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杀香鱼假单胞菌中σ～E响应环境温度调控毒力因子表达的机制

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杀香鱼假单胞菌中σ～E响应环境温度调控毒力因子表达的机制

作者：黄玉萍华东理工大学

学位级别：硕士

大黄鱼是我国重要的海水养殖鱼类。近年来集约化、规模化的养殖使得大黄鱼病害频发,给产业带来严重的经济损失。2002年起,福建省宁德市等的大黄鱼主产区接连暴发了大规模的内脏白点病。2014年鉴定出导致该病的病原为杀香鱼假单胞菌。杀... 详细信息

大黄鱼是我国重要的海水养殖鱼类。近年来集约化、规模化的养殖使得大黄鱼病害频发,给产业带来严重的经济损失。2002年起,福建省宁德市等的大黄鱼主产区接连暴发了大规模的内脏白点病。2014年鉴定出导致该病的病原为杀香鱼假单胞菌。杀香鱼假单胞菌是一种典型的条件致病菌,通常在养殖水体温度为18～22℃时感染大黄鱼。目前对该菌的研究大多聚焦于温度对该菌的重要毒力因子及代谢过程等方面的调控作用。因此,揭示杀香鱼假单胞菌响应温度的分子机制,将为减毒活疫苗开发等防控手段提供可参考的理论依据。以 RpoE 为核心的受控膜内蛋白水解(regulated intramembrane proteolysis,RIP)通路是病原菌中跨膜信号转导并感知温度的重要途径,被称为生物温度计(Bio-thermometer),然而其在杀香鱼假单胞菌中的具体功能尚未可知。本研究首先通过生物信息学手段预测了杀香鱼假单胞菌中RIP信号通路相关基因,经过多序列比对发现其与大肠杆菌和铜绿假单胞菌相关蛋白相似性较高。接着探究了杀香鱼假单胞假单胞菌RIP信号通路相关基因缺失菌株在致病(18℃)和非致病(28℃)温度下的生长情况。通过qRT-PCR和Western blot实验测定RIP通路基因在不同温度下的转录和蛋白表达水平。RpoE在多种病原菌中作为全局调控因子调控不同功能基因的转录,因此本研究进一步利用转录组测序(RNA-seq)技术对RpoE在不同温度下的调控元进行全面鉴定。结果表明,RpoE在18℃和28℃下分别调控297和261个基因的转录,这些基因涉及细菌信号转导、膜稳态、能量代谢和毒力相关的多种通路。通过qRT-PCR、胞外分泌蛋白谱分析和细菌种间竞争实验等,发现RpoE显著调控杀香鱼假单胞菌中Ⅵ型分泌系统(T6SS)相关基因的转录、胞外毒力蛋白的分泌及其对大肠杆菌的杀伤作用。重要的是,RpoE调控了中心碳代谢调控基因csrA的转录,从而间接调控由后者介导的生物被膜形成过程。另外,利用巨噬细胞模型,发现RpoE影响杀香鱼假单胞菌在巨噬细胞中的复制过程。综上所述,以RpoE为核心的RIP信号通路能够感知温度变化并调控下游多种基因的表达,在杀香鱼假单胞菌适应生态位的过程中发挥着重要作用。以上结果有助于揭示杀香鱼假单胞菌介导的内脏白点病病害暴发机制,为控制该菌引起的鱼类感染提供了新的思路。

关键词：杀香鱼假单胞菌温度 RpoE Ⅵ型分泌系统(T6SS) 生物被膜

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杀香鱼假单胞菌菌蜕的构建及其免疫效果评价

杀香鱼假单胞菌菌蜕的构建及其免疫效果评价

作者：徐伟浙江海洋大学

学位级别：硕士

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国重要的海水养殖经济鱼类,养殖产量自2014年以来一直处于我国海水养殖鱼类品种之首。随着现代高密度集约化养殖模式的发展,生产上先后爆发了多种大黄鱼养殖病害。其中,由杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas pl... 详细信息

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国重要的海水养殖经济鱼类,养殖产量自2014年以来一直处于我国海水养殖鱼类品种之首。随着现代高密度集约化养殖模式的发展,生产上先后爆发了多种大黄鱼养殖病害。其中,由杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)感染引起的大黄鱼内脏白点病,因发病率高、致死性强,已成为威胁大黄鱼养殖产业健康发展的主要细菌类病害。目前,生产上一般使用恩诺沙星或盐酸多西环素对该病进行防控,但临床效果不稳定,且容易诱生耐药菌株,给该病的防控造成潜在威胁。因此,亟需开发一种绿色、高效的防治方法。疫苗作为一种生物防控手段,具有安全、高效的优点,目前已广泛应用于水产养殖病害防控。然而,现已报道的关于大黄鱼源杀香鱼假单胞菌的在研疫苗存在着保护效果不强、安全性不够高(如减毒活疫苗)等不足。因此,设计、筛选出一种更为安全、高效的候选疫苗对于大黄鱼产业发展具有重要意义。菌蜕是革兰氏阴性菌在噬菌体Phi X174裂解基因E的作用下发生穿孔性裂解,形成不含内容物、没有活力的菌体空壳结构。该结构保留了几乎与活菌一样的表面抗原结构(含抗原决定簇和免疫粘附因子等),能够有效诱导宿主产生体液免疫与细胞免疫应答,因而可作为一种理想的候选疫苗组分,具有开发成候选疫苗、佐剂、或疫苗载体等潜力。本研究基于现有理论基础,在商品化温控表达质粒p BV220的基础上,通过基因工程技术,导入噬菌体裂解基因E和卡那霉素抗性筛选标记,构建形成新的温控裂解质粒220E-Kn,将其先后导入大肠杆菌(Escherichia coli)和大黄鱼源杀香鱼假单胞菌,对其诱导菌蜕形成的能力进行了评估。结果表明:220E-Kn质粒在大肠杆菌中可稳定传代并在42℃时启动裂解基因的高效表达,诱导4 h后,大肠杆菌的裂解穿孔率达到99.997%,扫描电镜结果显示,大肠杆菌菌体发生了裂解、收缩和内容物外泄等结构变化。通过电转化法将220E-Kn质粒导入杀香鱼假单胞菌,获得阳性转化子,经28℃培养和42℃温控诱导,结果表明,220E-Kn质粒在卡那霉素筛选压力下,可在杀香鱼假单胞菌中稳定传代,溶菌动力学显示,42℃诱导24 h,杀香鱼假单胞菌的裂解率达到100%,扫描电镜观察发现菌体中间凹陷,两端出现明显的穿孔裂解现象,将诱导24 h后的菌液于TSA培养基上复苏培养48 h,无菌落形成,表明裂解完全无活菌存留。为准确评价菌蜕的免疫保护效果,本研究首先对杀香鱼假单胞菌感染大黄鱼的模型进行了初步研究。在20℃～25℃的水温条件下,将杀香鱼假单胞菌分别以腹腔注射和浸泡方式感染健康大黄鱼(35±5 g),结果显示,两种方式均可引起有效感染和死亡,其中,浸泡感染引起死亡的趋势更接近自然感染的发病死亡规律,且发病鱼的脾脏均出现典型的白点症状,而注射感染死亡过于迅速、集中,且平行组之间重复性较差,因而,本研究确立以浸泡感染为主要方式的感染模型。同时,为确定低温条件下杀香鱼假单胞菌的致病力,开展了低温(10℃～13℃)条件下的浸泡感染实验,结果表明,10℃～13℃水温条件下,浸泡感染大黄鱼(35±5 g)的半数致死剂量LD=1.3×10 CFU/m L。为评估菌蜕疫苗的免疫保护率,参照感染模型数据,以2×10CFU/m L的剂量分别对甲醛灭活疫苗和菌蜕疫苗进行免疫后28天攻毒,结果表明,菌蜕苗免疫组14天的相对保护率(Relative percentage survival,RPS)为66.67%,甲醛灭活苗的RPS为46.67%,菌蜕苗优于甲醛灭活苗。为进一步评价杀香鱼假单胞菌菌蜕对大黄鱼的免疫保护效果,本研究对3个实验组(PBS对照组、甲醛灭活疫苗组、菌蜕疫苗组)大黄鱼定期采样,采集血清、头肾和脾脏,对先天及后天免疫相关参数进行监测,包括血清中特异性抗体水平、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性、脾脏和头肾中免疫相关因子Ig M、IL-1β、MHCIα、MHCIIβ、CD4和CD8基因的相对表达量水平。结果显示,菌蜕疫苗诱导的血清抗体水平在10周免疫期内均高于PBS和甲醛灭活疫苗,且在第8、10周显著高于甲醛灭活苗组(P菌蜕苗诱导的IL-1β在头肾和脾脏中均呈现先升高后降低的趋势,并且在第4、6周均显著高于甲醛灭活苗组(P<0.01)。此外,CD4和CD8在头肾和脾脏中呈现不同的表达变化:头肾中CD4和CD8的转录水平呈现逐渐下降的趋势,其中CD4在第2、4周显著高于甲醛灭活苗组(P<0.01);脾脏中CD4在免疫周期内无显著性变化,CD8呈现先升高后降低的趋势,并在第4周显

关键词：大黄鱼内脏白点病杀香鱼假单胞菌菌蜕免疫保护

抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的制备及特性分析

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海洋渔业 2022年第6期44卷 769-779页

作者：陈韵施慧许文军汪玮谢建军浙江海洋大学水产学院浙江舟山316022 浙江省海洋水产研究所浙江省海水增养殖重点实验室浙江舟山316021

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要致病菌,为制备能识别杀香鱼假单胞菌的特异性抗体,采用固相化抗原筛选方法,以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白为抗原,从兔天然噬菌体scF... 详细信息

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要致病菌,为制备能识别杀香鱼假单胞菌的特异性抗体,采用固相化抗原筛选方法,以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白为抗原,从兔天然噬菌体scFv文库中筛选出特异性的单链抗体(scFv);通过构建含有针对杀香鱼假单胞菌单链抗体(scFv)的重组质粒,对筛选出的scFv进行原核诱导表达。通过4轮淘选,共获得16株针对杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的单链抗体(scFv),通过亲和力分析,最终筛选出7株特异性较高的单链抗体(scFv)进行原核表达;成功构建了含有抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节单链抗体(scFv)的重组质粒pET-30a-Hcp-scFv,转化到大肠杆菌表达菌株中,其中6个重组质粒可稳定表达,经过蛋白质可溶性分析和Western Blot鉴定,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。研究结果为快速制备大量抗杀香鱼假单胞菌抗体提供了一种简便的方法,为今后大黄鱼内脏白点病的临床快速诊断奠定了基础。

关键词：大黄鱼内脏白点病杀香鱼假单胞菌单链抗体

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杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

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水产学报 2017年第4期41卷 613-621页

作者：张杰郭海杰高丽婷毛芝娟浙江万里学院生物与环境学院上海海洋大学水产与生命学院

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011... 详细信息

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12;4 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD;为2.59×10;/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。

关键词：大黄鱼杀香鱼假单胞菌 Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA 突变毒力

抗杀香鱼假单胞菌单链抗体（scFv）的制备与特性分析

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抗杀香鱼假单胞菌单链抗体（scFv）的制备与特性分析

作者：陈韵浙江海洋大学

学位级别：硕士

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病(Visceral granulomas disease,VGD)的病原菌,该菌能感染包括大黄鱼、小黄鱼(Larimichthys polyactis)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、黄姑鱼(Nibea albiflora)以及石斑鱼(Epinephelinae)等在内的多种水产养殖经济鱼类。杀香鱼假单胞菌导致的内脏白点病造成的经济损失约占大黄鱼养殖总产值的10%左右,严重阻碍了大黄鱼产业的健康可持续发展,因此,有必要研发一种操作简便、判读简单、适合于大黄鱼内脏白点病现场快速诊断的检测方法。本研究以杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp)为抗原,从兔天然噬菌体单链抗体(single chain antibody fragment,sc Fv)文库中筛选出抗杀香鱼假单胞菌重组溶血素共调节蛋白(Hcp-sc Fv),构建重组质粒p ET-30a-hcp-sc Fv并进行诱导表达,获得抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的特异性sc Fv,以期为大黄鱼内脏白点病临床快速诊断技术的研发奠定基础。具体研究结果如下:1、抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的筛选:采用固相化抗原筛选方法,以杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白(p ET-30a-Hcp)为抗原,从兔天然噬菌体单链抗体(sc Fv)文库中筛选目的抗体,结果:筛选出16个针对杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白的单链抗体(hcp-sc Fv);通过亲和力和基因序列分析,最终获得7个特异性较高的hcp-sc Fv,分别命名为A5、F11、G5、G8、D2、D10、H12。2、抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体的制备:根据7个hcp-sc Fv的基因序列设计特异性引物,采用PCR方法对单链抗体目的基因进行扩增,并插入到p ET-30a(+)载体,构建原核表达质粒(p ET-30a-hcp-sc Fv)。PCR鉴定和双酶切分析结果显示7个重组质粒均构建正确。将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S进行诱导表达。结果:A5、F11、G5、G8、D2、D10这6个重组菌在IPTG终浓度为0.4mmol/m L,30℃诱导5 h的条件下可稳定表达;重组蛋白的可溶性分析结果显示,F11、G8、D2、D10重组蛋白以包涵体的形式存在,A5、G5重组蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种存在形式;纯化获得的重组蛋白对抗His-Tag鼠单抗有免疫反应,蛋白分子量大小在35 k Da左右,与预期相符。3、基于sc Fv的杀香鱼假单胞菌ELISA法的建立:选择A5和F11两个表达稳定的重组蛋白,进行了杀香鱼假单胞菌间接ELISA法的建立,结果:F11对杀香鱼假单胞菌的亲和力较差,A5对杀香鱼假单胞菌的亲和力较高;利用棋盘法确定杀香鱼假单胞菌包被浓度为5×10 cfu/m L,A5工作浓度为100μg/m L,抗原包被条件为4℃过夜,酶标二抗稀释度为1:2000,酶标二抗孵育条件为37℃孵育1h,显色条件为37℃显色10 min,阴阳性判定的临界值为0.456;利用建立的间接ELISA法进行灵敏度和特异性实验,结果显示该方法灵敏度为5×10cfu/m L,特异性实验结果显示A5与诺卡氏菌(Nocardia)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella retardans)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)无交叉反应,但与哈维氏弧菌(Vibrio harzianus)出现交叉反应。综上,本研究制备了6个抗杀香鱼假单胞菌溶血素共调节蛋白单链抗体,同时针对其中两个单链抗体A5、F11建立了杀香鱼假单胞菌的间接ELISA检测方法。实验结果表明制备的单链抗体有望用于大黄鱼内脏白点病病原菌的检测,为大黄鱼内脏白点病临床快速诊断技术的研发提供了理论依据和基础。

关键词：大黄鱼内脏白点病杀香鱼假单胞菌单链抗体原核表达间接ELISA

鱼类病原杀香鱼假单胞菌Ⅵ型分泌系统效应-免疫蛋白的筛选及功能初步研究

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鱼类病原杀香鱼假单胞菌Ⅵ型分泌系统效应-免疫蛋白的筛选及功能...

作者：李彦彦浙江海洋大学

学位级别：硕士

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是一种重要的鱼类致病菌,能造成大黄鱼等养殖鱼类的大量死亡。前期本实验室发现大黄鱼致病株XSDHY-P基因组中编码有3套Ⅵ型分泌系统(分别命名为T6SS-1、-2和-3),其中T6SS-2介导了菌间竞争,... 详细信息

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是一种重要的鱼类致病菌,能造成大黄鱼等养殖鱼类的大量死亡。前期本实验室发现大黄鱼致病株XSDHY-P基因组中编码有3套Ⅵ型分泌系统(分别命名为T6SS-1、-2和-3),其中T6SS-2介导了菌间竞争,可促进菌株在养殖环境或宿主中定植。目前,***介导T6SS菌间杀伤的效应因子及其功能尚未阐明。已发表的研究显示,菌间杀伤相关的T6SS效应因子都会在其编码基因上游或下游相邻区位点编码一个能中和其毒性的免疫蛋白;编码这些效应因子-免疫蛋白对(Effector and Immunity protein pairs;下文缩写为E-I)的基因多与Hcp、Vgr G、PAAR蛋白基因相关联。利用这些已知信息,本论文首先通过生物信息学分析,筛选了XSDHY-P菌株中具有潜在细菌毒性的T6SS效应因子,并预测了其毒性结构域;继而通过大肠杆菌生长抑制实验、质粒降解实验以及菌间竞争实验证明其中两对E-I在菌株T6SS介导的菌间竞争中发挥了作用,具体发现总结如下:*** XSDHY-P基因组中编码了5个vgr G基因(其中3个位于3个不同的T6SS基因簇,另外两个为孤儿vgr G基因),其中vgr G-2及两个孤儿vgr G(vgr G-4和vgr G-5)基因下游编码有4个潜在细菌毒性效应因子(命名为Type six XSDHY-P effector缩写为Txe)及其免疫蛋白(Txi)。vgr G-2下游编码效应因子-免疫蛋白对Txe1-Txi1和Txe2-Txi2,vgr G-4下游编码Txe3-Txi3,vgr G-5下游编码Txe4-Txi4。2.结构域预测分析显示4个潜在效应毒力因子为不同蛋白家族的核酸酶毒素。Txe1、Txe2和Txe4中含有典型的RHS保守结构域,Txe1、Txe3和Txe4含有PAAR模体结构。在C端结构域(CTD)预测中,在CCD数据库缺乏与Txe1 CTD同源的结构域,但Alphafold2预测的蛋白模型显示Txe1 CTD携带有与Caspase-Activated DNase His-Me finger(PDB ID:1v0d)类似催化结构。Txe2携带Tox-AHH核酸酶结构域(pfam14412,HNH/Endo ⅥI核酸酶家族)。Txe3具有HNHc核酸酶结构域(pfam01844,HNH核酸酶家族)。Txe4具有Tox-SHH核酸酶结构域(pfam15652,HNH/Endo ⅥI核酸酶家族)。***1、Txe2和Txe4在大肠杆菌诱导表达实验中展示了明确的细菌毒性,而仅Txe1和Txe4在菌株XSDHY-P与被捕食菌共培养时发挥了显著的抑菌作用。本文将编码序列txe1、txe2、txe3、txe4、txe1(Txe1的C端结构域)、txe2、txe4、txe1-txi1(效应-免疫基因共表达)、txe2-txi2和txe4-txi4克隆至阿拉伯糖(L-arabinose)诱导质粒p BAD33.1,转化至*** BL21(DE3)进行生长抑制实验及细胞内质粒降解实验。结果分析得Txe1、Txe2、Txe4、Txe1、Txe2和Txe4抑制大肠杆菌生长,细胞内降解质粒。Txi1、Txi2和Txi4分别是效应因子Txe1、Txe2、Txe4的免疫蛋白。构建效应因子缺失株,将XSDHY-P野生株(WT)、效应因子缺失株和ΔT6SS-2作为捕食菌(attacker),*** XL10作为被捕食菌(prey),开展菌间竞争实验,结果表明仅Txe1和Txe4介导了菌株T6SS-2相关的菌间杀伤。

关键词：杀香鱼假单胞菌 Ⅵ型分泌系统抗菌活性效应因子免疫蛋白

大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C和Porin的免疫保护效果研究

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大黄鱼源杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C和Porin的免疫保护效果研究

作者：王莹浙江海洋大学

学位级别：硕士

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国海水养殖的重要品种,养殖产量连续多年位居海水养殖鱼类第一,经济价值十分突出。近年来,随着养殖规模和密度的不断增加,各类养殖病害频繁爆发。其中,由杀香鱼假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)感... 详细信息

大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国海水养殖的重要品种,养殖产量连续多年位居海水养殖鱼类第一,经济价值十分突出。近年来,随着养殖规模和密度的不断增加,各类养殖病害频繁爆发。其中,由杀香鱼假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)感染引起的内脏白点病,死亡率高达70%-80%,在大黄鱼细菌类病害中危害最为严重,给大黄鱼养殖业造成了严重的经济损失。目前,生产上一般使用恩诺沙星、盐酸多西环素等药物对该病进行防控,然而,长期用药不仅会增加药残风险,还会污染水体生态环境,诱导新的耐药株生成。因而,亟需开发一种安全高效的防控方法。疫苗作为疫病防控的重要手段,在水产养殖中已有广泛应用。亚单位疫苗具有特异性强、安全性高等优势,是疫苗研发的重要方向之一。在前期研究中,我们通过原核表达获得了杀香鱼假单胞菌外膜重组蛋白TolC和Porin,并通过Western Blot验证了两种蛋白与杀香鱼假单胞菌的兔抗血清均有强结合条带,证明两个重组蛋白具有良好的免疫原性,本研究进一步评估这两种重组蛋白对大黄鱼的免疫保护效果。本研究从Tol C和Porin的原核表达菌株出发,通过优化表达和纯化条件,获得足量的重组Tol C和Porin蛋白,将其分别与明矾佐剂乳化均匀,制成亚单位疫苗,通过腹腔注射免疫大黄鱼。为确定实验水温条件下适宜的攻毒浓度,先用不同梯度浓度的杀香鱼假单胞菌菌液对大黄鱼进行预攻毒。根据预攻毒数据,选择适宜的浸泡浓度对免疫4周后的大黄鱼进行攻毒,统计14天相对保护率(relative percent survival,RPS);同时,采集免疫后第2、4、6、8周的鱼血清和头肾、脾脏,测定血清抗体效价、杀菌活性、天然免疫酶活和头肾、脾脏中免疫相关基因的表达变化;采集攻毒后免疫组和对照组个体的头肾和脾脏,制成石蜡切片,观察组织病理变化。结果表明:免疫4周后,水温16±3℃条件下,使用5×104CFU/mL浓度菌液浸泡攻毒,TolC疫苗组RPS达72.22%,Porin疫苗组RPS达38.89%。ELISA结果显示:Tol C疫苗组免疫后第2周起,血清抗体效价显著升高,第4周时达到峰值(log2 8.65),随后略有下降,第8周时降至log2 6.98;Porin疫苗组抗体效价在第4周达到峰值,其抗体效价达log2 7.99。血清杀菌活性结果显示:Tol C免疫组杀香鱼假单胞菌的存活率最低达31.24%;Porin免疫组杀香鱼假单胞菌的存活率最低达55.32%。天然免疫酶活结果显示:Tol C免疫组和Porin免疫组AKP和ACP的活力均上调,并显著高于PBS对照组(P杀香鱼假单胞菌外膜蛋白Tol C和Porin进行了免疫保护效果评价,结果表明Tol C和Porin均能激活鱼体的先天和后天免疫,表现为激活天然免疫酶、诱导血清抗体产生、刺激头肾和脾脏中免疫因子上升表达、减轻头肾和脾脏的攻毒损伤等。其中,Tol C免疫保护效果优于Porin,14天RPS达72.22%,免疫后血清抗体效价和杀菌活力显著升高,具有作为候选疫苗的潜力。

关键词：大黄鱼杀香鱼假单胞菌外膜蛋白免疫保护

拮抗杀香鱼假单胞菌的大黄鱼肠道益生菌的筛选、鉴定及其益生作用的初步研究

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拮抗杀香鱼假单胞菌的大黄鱼肠道益生菌的筛选、鉴定及其益生作用...

作者：李张婵浙江海洋大学

学位级别：硕士

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要致病菌,给大黄鱼养殖业造成巨大经济损失。目前恩诺沙星、盐酸多西环素是主要治疗内脏白点病的抗生素,但滥用抗生素会造成大黄鱼体内耐药菌... 详细信息

杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)是大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的主要致病菌,给大黄鱼养殖业造成巨大经济损失。目前恩诺沙星、盐酸多西环素是主要治疗内脏白点病的抗生素,但滥用抗生素会造成大黄鱼体内耐药菌株的增加,对环境造成污染,进而威胁人体健康。因此,亟须寻找安全无污染的抗生素替代品。一些内源益生菌可以在鱼体内定植,通过产生抗菌活性物质来抑制有害病原菌的生长,调节机体免疫。筛选具有抗菌活性物质的益生菌对于大黄鱼养殖具有重要的实践意义。本研究通过选择培养基从大黄鱼肠道中分离筛选对杀香鱼假单胞菌具有拮抗作用的益生菌,通过生理生化及构建16srRNA系统发育树鉴定拮抗菌株,并通过硫酸铵沉淀法提取其抗菌活性物质,分析抗菌物质的理化性质,初步进行抗菌物质分子量大小的估测,并进一步通过拌饲投喂的方式,研究拮抗菌对大黄鱼肠道结构、血清酶活及免疫功能的影响。筛选大黄鱼源杀香鱼假单胞菌的拮抗菌以期丰富大黄鱼内脏白点病的生防微生物资源,也为大黄鱼配合饲料中应用拮抗益生菌提供理论依据。研究结果如下:1.通过选择培养基分离到228株细菌,进行16SrRNAPCR基因序列扩增及同源性比对分析,共筛选出37株潜在益生菌候选菌株。对37株候选菌株进行产酶分析,发现其中有19株产蛋白酶,11株产脂肪酶,10株产淀粉酶;通过琼脂扩散法对候选菌株进行杀香鱼假单胞菌拮抗实验,筛选出三株具有拮抗效果的菌株,分别为P1-17、P2-33、P3-11,其中菌株P1-17、P2-33具有产蛋白酶和淀粉酶的能力,而菌株P3-11不具有产酶能力。2.通过生理生化特性分析及16S rRNA系统发育树的构建,菌株P1-17和P2-33鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),菌株P3-11鉴定为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。抗菌谱测定结果表明菌株P1-17、P2-33不仅对杀香鱼假单胞菌有拮抗作用,而且对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(***)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、副溶血弧菌(***)等多种水产病原菌均有拮抗效果,而菌株P3-11只对杀香鱼假单胞菌有拮抗作用,对其余多种病原菌无抑制效果。安全性实验结果表明三株拮抗菌均无溶血性,对水产常用抗生素敏感,所含耐药因子较少,急性毒性试验表明三株菌对大黄鱼均无致病性,表现出良好的生物安全性。3.通过传代培养,菌株P1-17表现出良好的遗传稳定性;用硫酸铵沉淀法提取菌株P1-17抗菌活性物质,硫酸铵饱和度为50%时,其抗菌活性最大,SDS-PAGE电泳分析,显示抗菌蛋白分子量大约在30kDa左右;通过单因素试验,对发酵培养的种子液的种龄、接种量、发酵液初始pH值、发酵液盐度等四个因素进行优化,种龄在18 h、接种量为1%、盐度为1%、pH为7.0时,其抗菌活性物质的抗菌能力最好;菌株P1-17抗菌活性物质热稳定性较好,100℃处理30 min条件下,仍具有65.85%的抑菌活性,紫外照射60 min内有一定的耐受性,对胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶不敏感,对木瓜蛋白酶敏感。4.大黄鱼饲料中添加拮抗菌P1-17,显著增加了肠道绒毛高度和绒毛宽度(P菌酶(LZM)免疫相关酶的活性以及过氧化氢酶(CAT)抗氧化能力;能调节肝、脾和头肾等组织中免疫相关基因的表达水平,使肝、脾中IgM、MHC-Ⅰα、MHC-Ⅱβ、CD4基因表达上调,头肾中MHC-Ⅰα、MHC-Ⅱβ、CD8基因表达上调。结果表明贝莱斯芽孢杆菌P1-17可以相对提高大黄鱼的生长和免疫能力。

关键词：大黄鱼杀香鱼假单胞菌贝莱斯芽孢杆菌抗菌活性

小黄鱼中杀香鱼假单胞菌实时荧光定量PCR检测技术的建立

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浙江海洋大学学报（自然科学版） 2023年第2期42卷 109-119页

作者：沈宁远韩明明陈琳詹炜刘峰谢庆平徐万土陈黎明楼宝浙江海洋大学水产学院浙江舟山316022 浙江省农业科学院水生生物研究所浙江杭州310021 宁波市象山县水产技术推广站浙江象山315702 象山港湾水产苗种有限公司浙江象山315702

自2015年首次实现小黄鱼全人工育种以来,小黄鱼各项养殖技术获得了长足发展,但病害防治形势依然十分严峻,其中由杀香鱼假单胞菌引发的内脏白点病是小黄鱼养殖过程中的主要病害。为准确预判该病的爆发时间并争取有效预防,建立了一种能高... 详细信息

自2015年首次实现小黄鱼全人工育种以来,小黄鱼各项养殖技术获得了长足发展,但病害防治形势依然十分严峻,其中由杀香鱼假单胞菌引发的内脏白点病是小黄鱼养殖过程中的主要病害。为准确预判该病的爆发时间并争取有效预防,建立了一种能高效、定量检测杀香鱼假单胞菌的方法。通过在小黄鱼鱼体内分离鉴定获得杀香鱼假单胞菌菌株,将其DNA回旋酶B亚基基因(gyrB)中一特异片段与pClone007 Blunt Vector载体重组得到重组质粒,后者经过转染大肠杆菌感受态细胞、LB-氨苄西林(ampicillin,AMP)选择性培养和测序鉴定,获得能表达gyrB特异片段的阳性质粒的菌落,进一步将阳性菌落进行扩大培养、质粒提取及纯化得到质粒标准品。利用设计合成的特异引物及逐级稀释的质粒标准品建立杀香鱼假单胞菌实时荧光定量PCR检测标准曲线和反应体系。通过验证,运用该技术灵敏度达到10 copies·μL^(-1),并且组内和组间变异系数均小于0.82%。建立的方法实现了对小黄鱼中杀香鱼假单胞菌的快速定量检测,能够精确反映该菌在养殖水体及鱼体内的季节性变化并确立其流行规律,为小黄鱼内脏白点病的早期诊断提供了准确有效工具,同时为建立小黄鱼病害预警系统提供了良好的技术支撑。

关键词：杀香鱼假单胞菌荧光定量PCR 小黄鱼

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