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日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用

日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用

作者：孙圣福华中农业大学

学位级别：硕士

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)简称乙脑，是一种由乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的人畜共患的病毒性传染病。主要引起人的神经系统疾病以及猪的繁殖障碍，对养殖业和人类的健康有极大的威胁。猪是本病的... 详细信息

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)简称乙脑，是一种由乙脑病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的人畜共患的病毒性传染病。主要引起人的神经系统疾病以及猪的繁殖障碍，对养殖业和人类的健康有极大的威胁。猪是本病的扩散宿主，乙脑可以通过蚊虫传染到人类。因此乙脑的诊断和防治不但对于猪的规模化养殖有重要的意义，而且有重要的公共卫生学意义。本课题主要是乙脑实验室诊断方法的研究和初步应用。主要工作包括以下三个方面： 1．乙脑全病毒酶联免疫吸附试验诊断(ELISA)方法的优化及试剂盒的研制与初步应用选取9-11日龄的健康鸡胚增殖乙脑病毒SA14-14-2株，经过病毒纯化，提纯的病毒包被ELISA板，选择最佳包被条件，确定阴阳性界限值，建立ELISA诊断方法，在4℃和-20℃两种条件进行保存期试验，实验结果表明，酶标板可以在两种条件下保存12个月而不影响检测结果。将该方法的相关试剂装配组成ELISA试剂盒，并对试剂盒进行了特异性、重复性等相关特性进行研究，结果表明ELISA试剂盒特异性强、敏感性高、重复性好。应用该试剂盒与血凝抑制试验(HI)对85份血清进行同步检测，两者符合率达86.2％。在此基础上，用ELISA试剂盒对127家猪场的1454份血清进行了检测，其中阳性882份，阳性率为60.7％，表明该试剂盒可以在临床上进行血清学的检测和流行病学的调查。 2．乙脑病毒逆转录-聚合酶联反应诊断(RI-PCR)方法的建立和初步应用通过对乙脑病毒基因组的比较，针对NS1基因中比较保守的一段序列设计了一对引物，扩增出长度为430bp的片段。提取疑似乙脑病例新鲜病料中的RNA，确定适当的扩增条件，扩增NS1的特异性片段，建立了检测乙脑抗原的PCR诊断方法。并对该方法的灵敏性和特异性进行了研究：用不同滴度的乙脑活疫苗提取RNA进行RT-PCR，产物进行二次扩增，然后进行鉴定，结果表明可以检测到5TCID的病毒量;检测结果表明，该方法灵敏性高、特异性强。在此基础上对送检的38份病料进行了检测，其中检出阳性13份，阳性率为39.5％。试验结果表明，RT-PCR方法是临床检测乙脑病原的一种行之有效的方法，特别是对乙脑早期病例的检测。 3．乙脑病毒E基因表达蛋白ELIsA方法的建立和初步应用日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用 E基因是乙脑病毒主要抗原基因。采用E基因的表达产物作为包被抗原，替代全病毒作为包被抗原，可以减少操作人员被感染和应用全病毒EUSA试剂盒造成环境污染的风险。本研究通过大肠杆菌表达乙脑病毒主要抗原基因E基因，选择最佳的表达条件，提取、纯化表达蛋白形成的包涵体，用提纯的包涵体包被ELISA 板来检测乙脑抗体，确定最佳的包被条件，确定阴阳性界限值，建立了乙脑E蛋白的ELISA诊断方法。用该方法对引起猪繁殖障碍的其它传染病做了检测，检测结果均为阴性;随机抽取了6份不同抗体水平的血清，用不同批次包被的酶标板进行检测，结果变化不大;用该方法和血凝抑制对97份血清进行同步检测，两者符合率为95.8%，比血凝抑制试验阳性率高2.0%，用该方法和全病毒ELISA方法对送检的97份血清进行了同步检测，两者符合率为95.8%;检测结果表明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。用建立的该方法对送检的892份血清进行了检测，其中阳性血清422份，阳性率达47.3%。以上结果说明该方法可以替代全病毒ELISA 方法用于流行病学调查和血清学诊断。

关键词：日本乙型脑炎全病毒ELISA RT-PCR E蛋白ELISA

一例梅花鹿布氏杆菌和日本乙型脑炎混合感染的诊断

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野生动物学报 2019年第2期40卷 435-439页

作者：郭倩妤石远菊汤德元叶丽杨伟廖少山刘巧玲贵州大学动物科学学院贵阳550025

2018年3月17日,贵州省某梅花鹿场的梅花鹿(Cervus nippon)出现关节肿大、下颌肿大、睾丸单侧肿胀,还伴有严重的跛行等症状。采集4份该发病梅花鹿的血样送检。检测结果表明,通过虎红平板凝集试验2份血样检测出了布氏杆菌感染,4份血样经RT... 详细信息

2018年3月17日,贵州省某梅花鹿场的梅花鹿(Cervus nippon)出现关节肿大、下颌肿大、睾丸单侧肿胀,还伴有严重的跛行等症状。采集4份该发病梅花鹿的血样送检。检测结果表明,通过虎红平板凝集试验2份血样检测出了布氏杆菌感染,4份血样经RT-PCR均扩增出了JEV NS1部分基因的特异性条带,PCR产物测序结果分析显示,4份梅花鹿血样的JEV NS1基因(GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039)间的核苷酸同源性分别为99. 9%、99. 3%、99. 4%,与强毒株SA-14、国内外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分离株之间核苷酸同源性为99%以上,GZ-015、GZ-019、GZ-022、GZ-039与强毒株SA-14、弱毒株、国内外的疫苗株及四川、吉林等地的JEV分离株处于同一个较大的遗传进化分支。

关键词：梅花鹿日本乙型脑炎 NS1基因序列分析

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湘西发生猪日本乙型脑炎

中国兽医杂志 2003年第1期39卷 32-33页

作者：杨丽君邓治邦曹庸秦向阳武陵大学生物资源系湖南张家界427000 湖南省张家界市永定区畜牧局湖南张家界427000

日本乙型脑炎是由乙脑病毒引起的一种人畜共患传染病.本病主要感染马属动物、牛、羊、猪以及人,以神经症状和中枢神经系统病变为特征.猪表现怀孕母猪流产、死胎、畸形胎和木乃伊胎.

关键词：猪日本乙型脑炎症状病理变化诊断

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一株日本乙型脑炎病毒的分离与鉴定

家畜生态学报 2018年第6期39卷 67-68页

作者：苗丽娟张立春张宏玲李青竹吉林农业科技学院动物科技学院吉林吉林132101 吉林省预防兽医学重点实验室吉林吉林132101

吉林省某猪场送检一例病猪,经诊断疑似为日本脑炎病毒感染,对病猪的脏器以及全血进行BHK21细胞接种,对细胞培养物进行PCR检测和间接免疫荧光试验。结果显示,荧光显微镜下细胞浆内可见绿色荧光信号;PCR检测为日本脑炎病毒阳性,成功分离... 详细信息

吉林省某猪场送检一例病猪,经诊断疑似为日本脑炎病毒感染,对病猪的脏器以及全血进行BHK21细胞接种,对细胞培养物进行PCR检测和间接免疫荧光试验。结果显示,荧光显微镜下细胞浆内可见绿色荧光信号;PCR检测为日本脑炎病毒阳性,成功分离到一株日本乙型脑炎病毒。

关键词：猪日本乙型脑炎分离鉴定

基于CRISPR/Cas9系统研究日本乙型脑炎病毒复制增殖相关的宿主蛋白

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基于CRISPR/Cas9系统研究日本乙型脑炎病毒复制增殖相关的宿主蛋白

作者：朱君海四川农业大学

学位级别：硕士

日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）,简称乙脑病毒,属于单股正义链RNA病毒,病毒基因组较小,病毒结构较为简单,必须利用宿主蛋白完成自身复制增殖。前期研究发现宿主蛋白锌指蛋白ZNF251与α2巨球蛋白α2M是病毒NS1蛋... 详细信息

日本乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）,简称乙脑病毒,属于单股正义链RNA病毒,病毒基因组较小,病毒结构较为简单,必须利用宿主蛋白完成自身复制增殖。前期研究发现宿主蛋白锌指蛋白ZNF251与α2巨球蛋白α2M是病毒NS1蛋白的潜在互作蛋白,CRBN蛋白、蛋白磷酸酯酶PPP2CB与腓骨蛋白FBLN-5是病毒NS3的潜在互作蛋白。本研究旨在验证上述宿主蛋白对乙脑病毒的复制增殖是否有影响,进一步揭示宿主蛋白在乙脑病毒增殖与复制中发挥的作用。首先,构建针对上述蛋白的293单基因敲除细胞系。研究中成功运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建针对ZNF251、α2M、CRBN、PPP2CB、FBLN-5和HSP70的293单基因敲除细胞系,并通过测序和Western Blotting鉴定正确;之后,发现ZNF251基因的缺失正向调节了JEV的mRNA和子代病毒粒子水平,而除HSP70外的其他基因的缺失对JEV的mRNA和子代病毒粒子水平无影响。使用反转录荧光定量和噬斑形成实验,发现在敲除ZNF251基因的293细胞上JEV E基因的mRNA水平约为对照组的2.4倍,而在敲除除HSP70外的其他基因的293细胞上JEV E基因的mRNA水平与对照组的差异不显;敲除ZNF251基因的293细胞接种JEV后,子代病毒滴度平均值约为lg8.67 PFU/ml,高于对照的lg7.80 PFU/ml,而在敲除除HSP70外其他基因的293细胞上,子代病毒滴度平均值与对照组差异不明显。综上结果证实了CRISPR/Cas9可以成功运用在293细胞上进行基因编辑并进行JEV的相关研究,并通过在各敲除细胞系上的研究,筛选出293细胞的宿主蛋白ZNF251是一种对JEV的增殖与复制有影响的宿主蛋白,ZNF251可能对JEV在293细胞中的复制增殖有一定的抑制作用,而α2M、CRBN、PPP2CB、FBLN-5基因对于JEV在293细胞中的复制增殖无明显影响。

关键词：日本乙型脑炎宿主蛋白 ZNF251 CRISPR/Cas9

甘肃省景泰县日本乙型脑炎发病情况调查和分析

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中国兽医科技 1997年第12期27卷 32-33页

作者：高鹏程苏进才张承芸郝社平孙国栋甘肃省景泰县畜牧兽医技术服务中心

甘肃省景泰县日本乙型脑炎发病情况调查和分析高鹏程苏进才张承芸郝社平孙国栋（甘肃省景泰县畜牧兽医技术服务中心７３０４００）日本乙型脑火是一种人畜共患传染病，在马属动物表现为中枢神经系统高度兴奋或沉郁、麻痹。景泰县自７０... 详细信息

甘肃省景泰县日本乙型脑炎发病情况调查和分析高鹏程苏进才张承芸郝社平孙国栋（甘肃省景泰县畜牧兽医技术服务中心７３０４００）日本乙型脑火是一种人畜共患传染病，在马属动物表现为中枢神经系统高度兴奋或沉郁、麻痹。景泰县自７０年代以来每年都有马类家畜发病。本病...

关键词：马病日本乙型脑炎脑炎疫情调查疫情分析

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日本乙型脑炎LAMP方法的建立和应用

中国畜禽种业 2015年第5期11卷 34-35页

作者：孙圣福陈静田夫林马惠玲楚遵锋王敏山东省动物疫病预防与控制中心 250022

日本乙型脑炎（Japanese encephalitis,JE,简称乙脑）是一种由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的人畜共患的病毒性疾病。对于人类和动物的健康有极大的威胁,主要引起人的神经性疾病以及猪的繁殖障碍。

关键词：日本乙型脑炎 LAMP方法 encephalitis Japanese 繁殖障碍乙脑病毒神经性疾病病毒性疾病特异性阴性对照

药师参与日本乙型脑炎合并肺部感染治疗实践1例

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中国药师 2014年第9期17卷 1544-1546页

作者：闫成薛洪源刘建芳解放军白求恩国际和平医院药剂科石家庄050082

目的:通过临床药师参与1例日本乙型脑炎合并肺部感染患者的治疗实践,探讨药师在临床发挥的作用。方法:临床药师积极参与该患者的整个治疗过程,围绕抗病毒、抗癫痫、抗感染等方面开展药学监护,对治疗药物的选择、剂量、疗程提出合理化建... 详细信息

目的:通过临床药师参与1例日本乙型脑炎合并肺部感染患者的治疗实践,探讨药师在临床发挥的作用。方法:临床药师积极参与该患者的整个治疗过程,围绕抗病毒、抗癫痫、抗感染等方面开展药学监护,对治疗药物的选择、剂量、疗程提出合理化建议,关注药物相互作用及不良反应。结果:患者治疗过程顺利,病情逐步得到控制,整个治疗过程中未见明显药品不良反应。结论:临床药师参与疾病治疗工作,旨在优化治疗方案,确保患者用药安全、有效。

关键词：日本乙型脑炎肺部感染临床药师药学监护

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单克隆抗体治疗日本乙型脑炎患者的初步研究

细胞与分子免疫学杂志 1987年第4期 1-4页

作者：张明杰汪美先姜绍谆马文煜于碧云周战科闰容白宪光刘丽杨凤仪第四军医大学微生物学教研室第四军医大学附属一院传染科第四军医大学附属二院传染科第四军医大学附属二院传染科西安

将抗日本乙型脑炎（乙脑）病毒（JEV）的单克隆抗体（McAb）2H4、2F2、mC3三种腹水等量混合后,制备成IgG或其F（ah′）2。用0.3/0.15μm的微孔滤膜过滤除菌。经小白鼠体内急、慢性毒性试验,家兔体内发热试验,无菌试验,与人体重要脏器的... 详细信息

将抗日本乙型脑炎（乙脑）病毒（JEV）的单克隆抗体（McAb）2H4、2F2、mC3三种腹水等量混合后,制备成IgG或其F（ah′）2。用0.3/0.15μm的微孔滤膜过滤除菌。经小白鼠体内急、慢性毒性试验,家兔体内发热试验,无菌试验,与人体重要脏器的交叉试验以及DNA测定等鉴定证实,该制剂安全可靠,适合于人体内注射应用。在小白鼠。幼山羊及恒河猴实验性治疗研究,证实有效的基础上,对临床症状典型,抗JEV-IgM抗体阳性的两个乙脑患儿,进行了探索性治疗:发现疗效良好,观察三月余,无异常反应。

关键词：单克隆抗体治疗实验性治疗日本乙型脑炎慢性毒性试验恒河猴交叉试验迟发型变态反应等量混合证实有效发热试验