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BoHV-1感染新西兰白兔引起脑干损伤的初步研究

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BoHV-1感染新西兰白兔引起脑干损伤的初步研究

作者：李宁晰河北大学

学位级别：硕士

牛疱疹病毒1型(Bovine hepervirus 1,BoHV-1)是一种常见的牛传染病病原体,其感染引起呼吸系统和生殖系统等多系统炎性疾病,病毒能够形成潜伏感染,可以被反复激活而导致感染症状反复出现,对养牛业造成巨大经济损失,研究BoHV-1感染造成组... 详细信息

牛疱疹病毒1型(Bovine hepervirus 1,BoHV-1)是一种常见的牛传染病病原体,其感染引起呼吸系统和生殖系统等多系统炎性疾病,病毒能够形成潜伏感染,可以被反复激活而导致感染症状反复出现,对养牛业造成巨大经济损失,研究BoHV-1感染造成组织损伤的分子机制对于防控技术研究具有重要意义。相关报道表明与BoHV-1同一病毒科的HSV-1可以感染脑干组织并建立潜伏感染,而BoHV-1是否感染脑干并造成组织损伤目前还没有报道。本研究利用BoHV-1感染新西兰白兔这一动物模型,在感染后的急性感染、潜伏感染及潜伏感染被激活的阶段分别取脑干组织,用于相关研究。由于BoHV-1病毒感染新西兰白兔未必都会形成潜伏感染,并且未形成潜伏感染的个体与形成潜伏感染的个体均没有明显的差异,故为了开展上述研究需要借助检测病毒基因组来确定该动物是否已经建立潜伏感染。前期研究发现由于该病毒基因组庞大以及细胞基因组的干扰,传统的PCR检测方法不适合用于从脑干组织中检测该病毒基因组,因此本研究首先建立巢式PCR检测方法,用于确定新西兰白兔是否已建立潜伏感染。本研究基于巢式PCR实验方法,根据BoHV-1基因组序列设计了巢式PCR两轮扩增所需的两对引物,结合简便提取动物组织DNA模板方法,优化实验条件,建立了巢式PCR检测BoHV-1感染方法,用于对脑干组织BoHV-1感染状态进行检测和筛选。实验结果显示该方法可用于检测样品BoHV-1感染情况,并具有一定的实际应用价值。本研究利用BoHV-1人工感染新西兰白兔,成功建立动物潜伏感染及潜伏感染被激活模型,发现感染后最典型的症状是在急性感染阶段眼睑红肿,在潜伏感染被激活后眼睑出现明显的疱疹,即最典型的症状出现在潜伏感染被激活后的阶段。通过免疫组化检测脑干,发现潜伏感染被激活后脑干出现最明显的组织损伤,这与眼睑症状表现在时间上是一致的。通过对脑干样品进行RNA-seq以及RT-q PCR检测筛选与组织损伤及炎症反应相关的基因,发现潜伏感染被激活后引起HMGB1基因表达上调。综上所述,本研究首次发现BoHV-1感染引起脑干组织损伤,并观察到病毒潜伏感染被激活后诱导显著的脑干组织损伤和眼睑疱疹症状,同时诱导促炎性细胞因子HMGB1高水平表达,该促炎性细胞因子大量表达可能是造成组织损伤的重要原因。相关结果对于深入了解HMGB1致病机制以及对于HMGB1感染相关研究具有重要理论意义和借鉴作用。

关键词： BoHV-1 脑干新西兰白兔巢式PCR HMGB1

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新西兰白兔

畜牧市场 2003年第4期 15-15页

作者：王永康重庆市畜禽品种改良站

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新西兰白兔线粒体基因组全序列的测定与分析

基因组学与应用生物学 2021年第1期40卷 28-33页

作者：梁爽胡帅帅周娟周彤鲍志远赵博昊杨乃苏陈阳吴信生扬州大学动物科学与技术学院扬州225009

本研究旨在获得新西兰白兔(New Zealand white rabbit)线粒体DNA基因组全序列(mtDNA)。根据GenBank已经公布的近缘物种穴兔mtDNA全基因组序列(GenBank登录号:AJ001588.1),设计12对可覆盖新西兰白兔mtDNA全序列的引物,通过PCR扩增、测序... 详细信息

本研究旨在获得新西兰白兔(New Zealand white rabbit)线粒体DNA基因组全序列(mtDNA)。根据GenBank已经公布的近缘物种穴兔mtDNA全基因组序列(GenBank登录号:AJ001588.1),设计12对可覆盖新西兰白兔mtDNA全序列的引物,通过PCR扩增、测序、拼接,获得新西兰白兔线粒体全序列,并分析其特点。新西兰白兔线粒体基因组全序列为17 418 bp,A+T含量高,为59.72%,蛋白编码基因数量为13个,rRNA基因数量为2个,tRNA基因数量为22个和1个非编码控制区(D-loop区),与其他兔属动物线粒体全基因组排列顺序一致。分析4种特殊的tRNA二级结构,发现tRNA-Ser (AGY)为二叶草型,缺失DHU臂,其余三种tRNA均为三叶草型。与其他哺乳动物线粒体基因组的D-loop区相比,新西兰白兔与格拉达野兔(Lepus grana-tensis)核苷酸组成、编码偏好性和氨基酸组成较为相近。相比穴兔的线粒体基因组,新西兰白兔具有一定的保守性和异质性,该结果为其遗传种质资源保护和利用提供基础资料。

关键词：新西兰白兔 mtRNA 序列分析 D-loop区

新西兰白兔MSTN基因克隆、生物信息学分析及表达谱构建

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中国畜牧兽医 2021年第10期48卷 3501-3511页

作者：姜懿轩王亚玲邢珊珊宋国华许会芬李明河南农业大学动物科技学院郑州450046

肌肉生长抑制素(MSTN)是骨骼肌发育的主要调控因子,为获得新西兰白兔MSTN基因序列及其表达规律,试验通过RT-PCR技术从新西兰白兔腿肌组织中扩增并克隆得到MSTN基因序列,利用在线网站对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR技术检... 详细信息

肌肉生长抑制素(MSTN)是骨骼肌发育的主要调控因子,为获得新西兰白兔MSTN基因序列及其表达规律,试验通过RT-PCR技术从新西兰白兔腿肌组织中扩增并克隆得到MSTN基因序列,利用在线网站对其进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测MSTN基因在新西兰白兔同一时期不同组织及不同时期腿肌组织中的表达量。结果显示,新西兰白兔MSTN基因CDS区序列长1128 bp,编码375个氨基酸,其核苷酸序列与GenBank上公布的人、猪、马、小鼠、犬、牛和鸡的核苷酸序列相似性分别为95.9%、94.9%、94.9%、91.7%、91.5%、91.3%及84.2%。新西兰白兔MSTN蛋白属于酸性、亲水性分泌蛋白,且具有不稳定性,不含跨膜结构,含有1个信号肽,主要分布在内质网和线粒体中。MSTN蛋白二级结构和三级结构预测结果一致,以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋、延伸链,为混合型蛋白。蛋白质互作关系预测发现,MSTN蛋白与PAX7、MYOG、IGF1、FST、Smad3及Smad2等与肌肉生长发育有关的蛋白之间存在相互作用。不同组织表达分析结果表明,新西兰白兔MSTN基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腿肌、子宫和胃中均有表达,在腿肌中表达量最高,极显著高于其他组织(P新西兰白兔MSTN基因在180日龄腿肌组织中的表达量显著高于90和240日龄(P<0.05)。研究结果为深入探讨MSTN基因对家兔肌肉生长发育的调控机制奠定了基础。

关键词：新西兰白兔 MSTN基因生物信息学分析实时荧光定量PCR 表达

新西兰白兔CTSB、CTSS基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

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中国畜牧兽医 2023年第9期50卷 3499-3509页

作者：袁冬冬宋国华陈孟娟王智通柏中峰蔡含芳李明许会芬河南农业大学动物科技学院郑州450046 泌阳县农业农村局驻马店463700

【目的】克隆新西兰白兔组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)与CTSS基因CDS区序列并进行生物信息学分析,探究其在新西兰白兔不同组织中的表达规律。【方法】采用PCR法扩增并克隆CTSB、CTSS基因CDS区序列,使用Mega 7.0软件构建系统进化树并分... 详细信息

【目的】克隆新西兰白兔组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)与CTSS基因CDS区序列并进行生物信息学分析,探究其在新西兰白兔不同组织中的表达规律。【方法】采用PCR法扩增并克隆CTSB、CTSS基因CDS区序列,使用Mega 7.0软件构建系统进化树并分析氨基酸序列相似性;利用生物信息学软件分析CTSB、CTSS蛋白理化性质、跨膜结构、信号肽位点及亚细胞定位情况;用实时荧光定量PCR检测CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达量。【结果】新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS区序列长分别为1020、1023 bp,共编码339、340个氨基酸,蛋白分子质量分别为37.627、38.253 ku,理论等电点为5.53、8.40,不稳定系数为30.76、32.38,分别为酸性及碱性蛋白。新西兰白兔CTSB、CTSS基因氨基酸序列分别与猪、马的亲缘关系最近,与鸡亲缘关系较远。CTSB、CTSS蛋白二级结构均主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,二者三级结构预测结果与二级结构一致,均为亲水性蛋白;CTSB蛋白信号肽剪切位点位于第17—18位氨基酸处,含有1个N-端Propeptide-C1结构域与1个Peptidase-C1A-C结构域;CTSS蛋白信号肽剪切位点位于第25—26位氨基酸处,含有1个Inhibitor-129结构域与1个Peptidase-C1结构域。亚细胞定位结果表明,CTSB、CTSS蛋白均主要分布于细胞质(包括细胞壁)内。实时荧光定量PCR结果显示,CTSB基因在腹脂和肝脏组织中表达量较高,CTSS基因在脾脏组织中表达量最高,均显著高于其他组织(P新西兰白兔CTSB、CTSS基因CDS全长序列,揭示了CTSB、CTSS基因在新西兰白兔不同组织中的表达水平并初步分析了其生物学功能,为进一步研究家兔CTSB、CTSS基因功能及调控机制提供了基础和参考。

关键词：新西兰白兔 CTSB基因 CTSS基因克隆生物信息学分析组织表达

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新西兰白兔CYP11A1基因的克隆、生物信息学分析及其对繁殖相关基因的影响

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中国畜牧兽医 2022年第7期49卷 2484-2496页

作者：白少成周娟靳荣帅王璠卢婷婷汤先伟赵博昊吴信生陈阳扬州大学动物科学与技术学院扬州225000 江苏省邳州市东方养殖有限公司邳州221300

【目的】旨在通过分析细胞色素P450家族成员11A1(CYP11A1)的生物信息功能及其在新西兰白兔卵巢颗粒细胞中对繁殖性能相关基因的调控作用,为探究其在卵泡发育过程中调控功能奠定基础。【方法】根据GenBank上兔CYP11A1基因的序列,设计特... 详细信息

【目的】旨在通过分析细胞色素P450家族成员11A1(CYP11A1)的生物信息功能及其在新西兰白兔卵巢颗粒细胞中对繁殖性能相关基因的调控作用,为探究其在卵泡发育过程中调控功能奠定基础。【方法】根据GenBank上兔CYP11A1基因的序列,设计特异性引物,以新西兰白兔卵巢组织cDNA为模板,PCR扩增并克隆CYP11A1基因序列,构建pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体;用Mega 5.1在线软件构建系统进化树,并通过生物信息学软件对CYP11A1蛋白的氨基酸组成、理化性质、磷酸化位点、保守结构域、二级结构、三级结构、亚细胞定位、蛋白互作进行预测分析。分离新西兰白兔卵巢颗粒细胞,并通过免疫荧光法鉴定颗粒细胞特异性抗体卵泡刺激素受体(FSHR)的表达。设计3条干扰CYP11A1基因表达的引物(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),筛选出干扰效率最高的1条,并将其与pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体转染到卵巢颗粒细胞中,用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中羟基类固醇17-β脱氢酶1(HSD17B1)、骨形态发生蛋白15(BMP15)和促卵泡刺激素受体(FSHR)等繁殖相关基因mRNA表达水平。【结果】成功克隆新西兰白兔CYP11A1基因,其CDS全长序列为1557 bp,编码518个氨基酸,其中亮氨酸含量(10.6%)最高,精氨酸(7.6%)、缬氨酸(7.4%)和丙氨酸(7.2%)次之。进化树分析显示,CYP11A1蛋白序列与家鼠、人和猩猩的距离最近。生物信息学分析显示,CYP11A1蛋白理论等电点为7.4,正负电荷残基数各占50个,脂肪族氨基酸指数为82.16,不稳定性指数39.54,其中氨基酸序列中亲水性残基数量多于疏水性残基;CYP11A1蛋白具有40个潜在的磷酸化位点,其中以苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸最为丰富;CYP11A1蛋白二级结构由α-螺旋(48.31%)、无规则卷曲(40.22%)、延伸链(7.42%)和β-转角(4.04%)组成,三级结构为弯曲螺旋状。亚细胞定位预测结果显示,CYP11A1蛋白主要分布于线粒体(52.2%)、细胞质(17.4%)和细胞核(13.0%)中,还具有1个p450家族的结构域,并与多个繁殖性能相关的蛋白(STAR、CYP21A2、CYP17A1和FDX1)相互作用。分离的兔颗粒细胞表达FSHR,可以用于后续试验;CYP11A1基因在颗粒细胞中过表达后,HSD17B1和FSHR基因表达量极显著上调(P<0.05),BMP15基因表达量显著上调(P<0.01);干扰CYP11A1基因表达后,BMP15和FSHR基因的表达量极显著下调(P<0.01),HSD17B1基因表达量显著下调(P<0.05)。【结论】CYP11A1是一个稳定、亲水、相对保守且具有抗氧化和类固醇激素合成功能的蛋白。CYP11A1基因可调控卵巢颗粒细胞中与繁殖性能相关的基因HSD17B1、BMP15、FSHR的表达,说明CYP11A1基因在母兔繁殖过程中发挥一定作用。

关键词：新西兰白兔 CYP11A1基因生物信息学颗粒细胞真核表达

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新西兰白兔生长性状的遗传参数估计

四川农业大学学报 2014年第2期32卷 199-204页

作者：贾先波陈仕毅赖松家四川农业大学动物遗传育种研究所四川温江611130

【目的】对新西兰白兔不同生长日龄体重和平均日增重进行遗传分析。【方法】利用成都市爱华畜牧科技有限公司种兔场2011-2013年的生长性状记录，采用多性状动物模型约束性最大似然法（REML）对新西兰白兔35、42、56、70、84日龄的5个体... 详细信息

【目的】对新西兰白兔不同生长日龄体重和平均日增重进行遗传分析。【方法】利用成都市爱华畜牧科技有限公司种兔场2011-2013年的生长性状记录，采用多性状动物模型约束性最大似然法（REML）对新西兰白兔35、42、56、70、84日龄的5个体重性状，35～42、42～56、56～70、70～84日龄的4个平均日增重性状进行遗传参数估计。【结果】结果表明，新西兰白兔35、42、56、70、84日龄体重的遗传力分别是0.63、0.46、0.43、0.42、0.39。各日龄间体重呈强正遗传相关，相邻日龄间的遗传相关较其他日龄间强。35～42、42～56、56～70、70～84日龄平均日增重的遗传力分别是0.30、0.36、0.31、0.21。4个平均日增重间呈弱遗传相关。【结论】为新西兰白兔育种方案的制定和选育工作提供了理论基础。

关键词：新西兰白兔生长性状遗传力遗传相关

新西兰白兔毛囊体外培养条件优化及其增殖能力的研究

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中国畜牧杂志 2022年第4期58卷 172-175页

作者：孙少宁陈秋燃李佳丽张琛靳荣帅白少成姚凡陈阳吴信生扬州大学动物科学技术学院江苏扬州225009 农业与农产品安全国际合作联合实验室江苏扬州225009

为建立新西兰白兔毛囊体外培养模型,探究其最适的培养环境,本实验选用2月龄新西兰白兔,采集触须毛囊,分离组织和脂肪,保留完整毛囊。将完整无损的毛囊放入24孔板,每孔1根,加入William’s E、DMEM、MEM3种不同培养基,每组6个重复,每2d在... 详细信息

为建立新西兰白兔毛囊体外培养模型,探究其最适的培养环境,本实验选用2月龄新西兰白兔,采集触须毛囊,分离组织和脂肪,保留完整毛囊。将完整无损的毛囊放入24孔板,每孔1根,加入William’s E、DMEM、MEM3种不同培养基,每组6个重复,每2d在倒置显微镜下观察毛囊毛干的生长,并利用HE和PCNA免疫荧光染色检测毛囊的形态和增殖能力。结果显示:3种培养基中毛囊毛干在体外培养4d后生长减缓,在2 d与4 d时的生长速度均大于6 d(P新西兰白兔触须毛囊生长,毛乳头增殖能力最强。

关键词：新西兰白兔触须毛囊体外培养 William’s E

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新西兰白兔SOD1基因编码区克隆及生物信息学分析

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中国畜牧兽医 2019年第8期46卷 2236-2245页

作者：邓小亮马文康洪玮付欣谭茵广州医科大学-中国科学院广州生物医药与健康研究院联合生命科学学院

试验旨在克隆新西兰白兔SOD1基因CDS区并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中穴兔SOD 1基因序列(登录号:NM_001082627.2)设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增并克隆新西兰白兔SOD 1基因完整的CDS区序列,测序鉴定后与其他物种进行同源... 详细信息

试验旨在克隆新西兰白兔SOD1基因CDS区并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中穴兔SOD 1基因序列(登录号:NM_001082627.2)设计特异性引物,利用RT-PCR技术扩增并克隆新西兰白兔SOD 1基因完整的CDS区序列,测序鉴定后与其他物种进行同源性比对并构建系统进化树,使用SOPMA、SWISS-MODEL、ExPASy、ProtParam等软件和在线工具对蛋白序列进行分析,并预测蛋白分子的亚细胞定位及互作网络。结果显示,新西兰白兔SOD 1基因CDS区长度为459 bp,A、T、C、G碱基含量分别为24.84%、18.95%、23.09%和33.12%,GC含量大于AT含量,编码153个氨基酸。同源性比对结果发现,新西兰白兔与穴兔、卷尾猴、人、黑猩猩、普通狨、骆驼、家犬、猕猴、野猪、小鼠的同源性分别为99.8%、85.2%、85.0%、84.7%、84.1%、83.9%、83.9%、83.7%、83.2%和81.3%。系统进化树结果显示,新西兰白兔和穴兔进化关系最近,并单独聚成一个分支。新西兰白兔SOD1蛋白分子质量为15.7 ku,理论等电点(pI)为5.86,分子式为C672H1084N200O221S5,不稳定指数为23.79,脂肪系数为78.89,平均亲水指数(GRAVY)为-0.276;属水溶性蛋白,无信号肽及跨膜区。SOD1蛋白包含5个潜在的磷酸化修饰位点和3个潜在的糖基化位点;在45-120位氨基酸处存在1个保守的活性中心;二级结构以无规则卷曲为主,占53.59%;三级结构建模显示蛋白易形成同源二聚体。亚细胞定位结果显示,细胞质、细胞核和线粒体分别占65.2%、26.1%和8.7%;SOD1蛋白在体内能与SOD2、PRDX1、PRDX3、PRDX4、DERL1等分子形成互作网络。本试验结果为进一步深入研究SOD 1基因的功能及探索其与相关疾病的关系提供了参考依据。

关键词：新西兰白兔 SOD1基因克隆生物信息学预测