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斑点热立克次体ompA和ompB基因片段的克隆与表达及重组蛋白抗原性的研究

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斑点热立克次体ompA和ompB基因片段的克隆与表达及重组蛋白抗原性...

作者：焦艳梅中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

斑点热(spotted fever)是由斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)所引起的一组疾病的总称。190kDa(外膜蛋白A,OmpA)和120kDa(外膜蛋白B,OmpB)是斑点热立克次体最主要的表面蛋白抗原,被认为是发展斑点热的诊断试剂和... 详细信息

斑点热(spotted fever)是由斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)所引起的一组疾病的总称。190kDa(外膜蛋白A,OmpA)和120kDa(外膜蛋白B,OmpB)是斑点热立克次体最主要的表面蛋白抗原,被认为是发展斑点热的诊断试剂和亚单位疫苗的靶分子。本研究旨在克隆与表达斑点热立克次体的ompA和ompB部分基因片段,并对所表达的重组蛋白的抗原性进行研究。采用PCR方法,从斑点热立克次体的基因组中扩增到ompA和ompB基因的基因片段,将两个基因片段分别与原核表达载体pQE30连接,构建重组质粒pQE30/ompA和pQE30/ompB。将该重组质粒分别转化大肠杆菌,并用IPTG诱导转化菌表达目的蛋白。SDS-PAGE鉴定pQE30/ompA和pQE30/ompB转化菌分别表达了56kDa OmpA和44kDa OmpB重组蛋白。免疫印迹分析证明立氏立克次体的OmpB重组蛋白仅与立氏立克次体全菌免疫血清发生特异反应。用纯化的OmpB重组蛋白免疫家兔,间接免疫荧光试验(IFA)该重组蛋白能有效地诱导家兔产生高水平的特异性IgG。IFA分析发现该重组蛋白免疫血清与立氏立克次体全菌抗原发生特异性反应,而与其它立克次体的全菌抗原无明显交叉反应。这些结果说明本次研究制备的OmpB重组蛋白为立氏立克次体种特异性抗原,该重组蛋白免疫血清可以用作检测立氏立克次体的特异性抗体。血清学分析显示黑龙江立克次体56kDa OmpA重组蛋白能与黑龙江立克次体、立氏立克次体、斑点热群立克次体精河株等斑点热立克次体免疫血清发生交叉反应,提示该OmpA重组蛋白具有斑点热群特异性。用OmpA重组蛋白免疫小鼠和豚鼠,采用IFA检测免疫动物的血清特异性抗体水平,结果显示该OmpA重组蛋白能有效地诱导动物产生较高水平的特异性IgG。为了了解OmpA重组蛋白诱导细胞免疫应答的能力,我们采用MTT法分析OmpA免疫小鼠脾细胞在该抗原刺激下的增殖水平。结果显示免疫小鼠脾细胞在OmpA的刺激下的细胞增殖水平显著高于对照,提示OmpA具有T细胞表位,能够有效刺激机体产生特异性细胞免疫应答。用黑龙江立克次体和立氏立克次体分别攻击黑龙江立克次体OmpA重组蛋白免疫豚鼠,结果发现免疫动物受立克次体攻击后的发热和脏器的病理学改变

关键词：斑点热立克次体表面蛋白抗原基因克隆与表达抗原性

吉林省长白山区斑点热立克次体自然疫源地调查

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中华流行病学杂志 2003年第12期24卷 1126-1128页

作者：郝永建曹务春高淑萍张泮河赵秋敏杨红张习坦第二炮兵防护防疫队北京100071 军事医学科学院微生物流行病学研究所

目的　了解吉林省长白山区蜱传斑点热的自然疫源地情况。方法　利用立氏立克次体[相对分子质量 (Mr) 190× 10 3 ]外膜蛋白A(R .rOmpA)基因序列设计引物 ,对 6 83只蜱类标本进行聚合酶链反应 (PCR)检测 ,并随机抽取一株森林革蜱阳性扩... 详细信息

目的　了解吉林省长白山区蜱传斑点热的自然疫源地情况。方法　利用立氏立克次体[相对分子质量 (Mr) 190× 10 3 ]外膜蛋白A(R .rOmpA)基因序列设计引物 ,对 6 83只蜱类标本进行聚合酶链反应 (PCR)检测 ,并随机抽取一株森林革蜱阳性扩增产物进行克隆与序列测定。结果　从森林革蜱和嗜群血蜱标本中检测出了斑点热立克次体DNA片段 ,阳性率分别为 5 3.81%和 7.4 1% ;所测序列与前苏联的DnS 14株的同源性为 10 0 .0 0 % ,与DnS 2 8和RpA 4的同源性均为99.0 0 % ;而与国内所检测的BJ 90、HLJ 0 5 4的同源性分别为 88.0 0 %和 86 .0 0 %。结论　长白山区存在斑点热的自然疫源地 ,存在与DnS 14株型别一致的斑点热立克次体 ,在中国系首次发现。

关键词：吉林省长白山区斑点热立克次体自然疫源地调查蜱

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非洲钝缘蜱传播精河株斑点热立克次体的途径

昆虫学报 1983年第1期26卷 59-62页

作者：唐士元李国艾王太华张启恩军事医学科学院微生物研究所

非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)叮咬感染精河株斑点热立克次体的豚鼠后45—52天,再叮咬正常豚鼠,可使后者感染。除个别蜱外,受精的感染雌蜱第一次产的卵(吸感染血后10—19天产出)和1龄稚蜱均为阴性。间隔1个月又喂以正常豚鼠血,这些... 详细信息

非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)叮咬感染精河株斑点热立克次体的豚鼠后45—52天,再叮咬正常豚鼠,可使后者感染。除个别蜱外,受精的感染雌蜱第一次产的卵(吸感染血后10—19天产出)和1龄稚蜱均为阴性。间隔1个月又喂以正常豚鼠血,这些蜱第二次的吸血率、产卵数和卵的孵化率都明显降低,但从第二次产的卵和1龄稚蜱压印片中均查见大量立克次体。经卵传递率60％,子代感染率59％(6—100％)。

关键词：斑点热立克次体精河非洲产卵数孵化率繁殖性能立氏立克次体经卵传递豚鼠荷兰猪

新疆部分地区蜱传斑点热立克次体的分子流行病学研究

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甘肃农业大学学报 2019年第5期54卷 10-16页

作者：曲志强林汉亮许肖枫马力克·艾则孜罗毅马站孙晓林刘光远甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃兰州730046 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830011

【目的】调查新疆地区斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)在蜱虫中的感染情况及其分布.【方法】2018年4~5月,采用人工布旗法对新疆地区10个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定.对采集的蜱虫提取... 详细信息

【目的】调查新疆地区斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsia,SFGR)在蜱虫中的感染情况及其分布.【方法】2018年4~5月,采用人工布旗法对新疆地区10个县(市)的游离蜱和寄生于家畜体表的蜱虫进行采集并鉴定.对采集的蜱虫提取基因组,利用SFGR特异引物对提取的基因组进行PCR扩增及测序分析,用MEGA 6.0软件构建分子系统进化树.【结果】共采集蜱虫2 079只,经鉴定分析,采集的蜱种包括革蜱属、璃眼蜱属和扇头蜱属3属的7个种.扩增得到了包括拉欧蒂立克次体(Rickettsia raoultii)、斯洛伐克立克次体(Rickettsia slovaca)等在内的4种已知SFGR和2株未定种.对其阳性率进行统计结果表明,不同地区的蜱虫阳性率为40%~80%,平均阳性率为51.5%;不同蜱种间的感染率为1.1%~80%.【结论】通过对新疆地区SFGR病原的流行病学调查表明,被检地区SFGR病原阳性率较高,存在2种病原交叉感染现象,且扩增到的病原多属我国少见的人兽共患病病原.

关键词：蜱斑点热立克次体阳性率系统进化分析

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一株斑点热立克次体的病原学研究

微生物学通报 1997年第1期24卷 31-34页

作者：陈香蕊胥照平陈万荣李申龙张永国军事医学科学院微生物流行病研究所北京100071

自内蒙古自治区的草原革蜱（D．nuttalli）中分离到一株斑点热立克次体。用微量酶标染色方法进行血清学鉴定表明，系西伯利亚（Rickettsiaesibirica种血清型。G＋Cmol％含量为32.4％。对其核酸进行聚合酶链扩增／限制性核酸内切酶消化（... 详细信息

自内蒙古自治区的草原革蜱（D．nuttalli）中分离到一株斑点热立克次体。用微量酶标染色方法进行血清学鉴定表明，系西伯利亚（Rickettsiaesibirica种血清型。G＋Cmol％含量为32.4％。对其核酸进行聚合酶链扩增／限制性核酸内切酶消化（PCR／RFLP）分析DNA长度多态性，分别引用立氏立克次体蛋白抗原基因Rr190序列作为扩增引物Rr190．70p～602n和Rr190．4442p～5664n，扩增后分别用Pst1和Rsal限制性核酸内切酶消化。其电泳图谱证明，该分离株的DNA多态图谱与R．sibirica完全一致。上述结果可确证该分离株为西伯利亚斑点热立克次体种，称内85011株即NM-8501。

关键词：立克次体斑点热立克次体病原学

黑龙江逊克地区森林革蜱斑点热立克次体DNA的检测

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中国人兽共患病学报 2014年第10期30卷 1020-1023页

作者：冯立王卓杨军于淼王立强邱广斌翟如波吴益民沈阳军区疾病预防控制中心沈阳110034 黑龙江省逊克出入境检验检疫局逊克164400 中国人民解放军第202医院沈阳110003

目的调查黑龙江逊克地区蜱传斑点热自然疫源地,发现该地区蜱携带斑点热立克次体的种类。方法采用斑点热立克次体ompA和gltA基因特异的PCR,检测该地区森林革蜱的DNA样本,并对扩得阳性产物进行测序和聚类分析。结果从60只森林革蜱中检测... 详细信息

目的调查黑龙江逊克地区蜱传斑点热自然疫源地,发现该地区蜱携带斑点热立克次体的种类。方法采用斑点热立克次体ompA和gltA基因特异的PCR,检测该地区森林革蜱的DNA样本,并对扩得阳性产物进行测序和聚类分析。结果从60只森林革蜱中检测有14只扩得斑点热立克次体ompA和gltA基因片段,阳性率为23.33%。随机选择2只蜱的阳性片段进行测序,二者同源性为100%,ompA基因序列与Rickettsia sp.JL-02同源性为99.30%,与Rickettsia raoultii为99.18%。结论黑龙江省逊克地区森林革蜱携带与Rickettsiasp.JL-02株亲缘关系相近的斑点热群立克次体。

关键词：蜱斑点热立克次体 PCR 序列分析

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我国斑点热立克次体感染与免疫的实验研究

中国人兽共患病学报 2016年第10期32卷 917-921页

作者：熊小路焦俊温博海军事医学科学院微生物流行病研究所病原生物生物安全国家重点实验室北京100071

研究证明黑龙江立克次体能够感染人血管内皮细胞和BALB/c小鼠,引起小鼠菌血症和器官损伤;全基因组序列分析发现黑龙江立克次体毒力相关基因。表面蛋白质组分析鉴定了黑龙江立克次体和立氏立克次体的表面蛋白,用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠... 详细信息

研究证明黑龙江立克次体能够感染人血管内皮细胞和BALB/c小鼠,引起小鼠菌血症和器官损伤;全基因组序列分析发现黑龙江立克次体毒力相关基因。表面蛋白质组分析鉴定了黑龙江立克次体和立氏立克次体的表面蛋白,用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠,发现某些表面蛋白为保护性抗原,并揭示这些保护性抗原均能够诱导抗原特异CD4+和CD8+T细胞增殖并产生和分泌IFN-γ和/或TNF-α,以及诱导高水平特异性IgG2a产生,在这些免疫因素的协同作用下使小鼠有效抵抗立克次体感染。用黑龙江立克次体感染Tim-3高表达或低表达人血管内皮细胞以及Tim-3高表达转基因小鼠,结果有力证明Tim-3高表达能够促进人血管内皮细胞和小鼠抵抗黑龙江立克次体感染。

关键词：斑点热立克次体感染免疫保护性抗原

实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体方法的建立

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安徽医科大学学报 2020年第7期55卷 1008-1013页

作者：罗婉蓉刘伯玉陈振任翠平高越杨莉朱禹余东阳柳燕安徽医科大学微生物学教研室合肥230032

目的建立斑点热群立克次体(SFGR)TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法。方法根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(ompA)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检... 详细信息

目的建立斑点热群立克次体(SFGR)TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)快速检测方法。方法根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(ompA)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的此检测方法和常规的巢式PCR方法同时对临床收集的80份患者血标本进行检测并比较两者结果。结果成功建立了检测SFGR的实时荧光定量PCR方法,标准曲线的循环阈值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(r>0.99),且在检测SFGR核酸样本时具有良好的灵敏度、特异性和重复性。结论该研究建立了基于TaqMan探针检测SFGR的实时荧光定量PCR检测方法,为临床实验室快速确诊SFGR疾病提供了快速、有效的技术手段。

关键词：斑点热立克次体 ompA TaqMan探针实时荧光定量PCR

浙江省在蜱中检测到斑点热群——立克次体DNA片段

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中国媒介生物学及控制杂志 2006年第6期17卷 484-485页

作者：姜理平莫世华郑寿贵孟真程苏云谢淑云叶晓东浙江省疾病预防控制中心病原微生物所杭州310009 金东区疾病预防控制中心

目的了解蜱、鼠中自然感染斑点热群立克次体的状况。方法用聚合酶链反应(PCR)检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热DNA片段。结果在金华市金东区捕获社鼠2只,黄毛鼠10只,黑线姬鼠4只,用PCR检测结果均为阴性。用PCR检测49只中华硬蜱,阳性8只,阳... 详细信息

目的了解蜱、鼠中自然感染斑点热群立克次体的状况。方法用聚合酶链反应(PCR)检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热DNA片段。结果在金华市金东区捕获社鼠2只,黄毛鼠10只,黑线姬鼠4只,用PCR检测结果均为阴性。用PCR检测49只中华硬蜱,阳性8只,阳性率16.33%。结论初步认定浙江省存在斑点热病原,尚需进一步调查。

关键词：蜱斑点热立克次体聚合酶链反应