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猪瘟活疫苗（传代细胞源）效力检验方法的比较研究

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猪瘟活疫苗（传代细胞源）效力检验方法的比较研究

作者：陈建凯佛山科学技术学院

学位级别：硕士

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是一种对猪危害严重的传染病,该病对养猪业是一个巨大的威胁。猪感染猪瘟后,尚无有效的治疗手段,所以疫苗免疫是防控该病的首选。因此,猪瘟疫苗的生产质量、猪瘟疫苗效力的高低,是决定免疫成败的主要... 详细信息

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是一种对猪危害严重的传染病,该病对养猪业是一个巨大的威胁。猪感染猪瘟后,尚无有效的治疗手段,所以疫苗免疫是防控该病的首选。因此,猪瘟疫苗的生产质量、猪瘟疫苗效力的高低,是决定免疫成败的主要因素。传统的猪瘟活疫苗效力检验方法是兔体定型热法（Rabbit infection dose,RID）,该方法是将稀释后的猪瘟疫苗,通过耳静脉注射到兔子体内,再测量兔子的体温,绘制兔子体温的变化曲线,判定猪瘟疫苗的效力是否合格。但是这种检验方法容易受到兔子个体的差异、饲养条件的改变等因素的干扰,导致疫苗效力的检验结果不稳定。因此,探索实验室方法检验猪瘟活疫苗效力,寻找能与RID方法具有良好相关性的检验方法,是本研究的主要内容。本研究主要包括以下三部分:1.间接免疫荧光检验猪瘟活疫苗效力方法的建立与应用以制备的猪瘟阳性血清作为反应条件的一抗,荧光素FITC标记的山羊抗猪Ig G作为反应条件的二抗,确定一抗和二抗的最佳稀释倍数是1:400,建立间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence assay,IFA）检验猪瘟活疫苗效力的方法。使用本方法对30批猪瘟活疫苗成品疫苗进行效力检验,并将检验的结果与传统的RID方法进行比较,比较结果显示,检验猪瘟活疫苗效力的值的范围在10～10 TCID/头份,对应的RID的范围在20000倍～30000倍/头份,证明建立的IFA方法能较好的检验猪瘟活疫苗的效力,并与传统的RID检验方法具有良好的相关性（R=0.9269）。2.ELISA试剂盒检验猪瘟活疫苗效力的研究通过将30批猪瘟活疫苗按1头份10倍梯度稀释后接种到猪睾丸（Swine testicular,ST）细胞进行培养,将第三次收取（三收）的子代病毒使用猪瘟病毒ELISA抗原试剂盒（IDEXX）进行效力检验,通过ELISA检验的结果与RID进行比对,发现ELISA检验猪瘟活疫苗具有较好的灵敏性,ELISA检验30批猪瘟活疫苗效力的值的范围在10～10 TCID/头份,对应的RID的值范围在20000倍～30000倍/头份,ELISA检验猪瘟活疫苗的结果与RID具有较好的相关性（R=0.9148）。3.实时荧光RT-PCR试剂盒检验猪瘟活疫苗效力的研究将30批猪瘟活疫苗各稀释成1头份,采用实时荧光RT-PCR试剂盒检验,将实时荧光RT-PCR检验的结果与RID进行比较,发现实时荧光RT-PCR检验猪瘟活疫苗的Ct值集中在21.475～23.058/头份,对应的RID的值的范围在20000～30000倍/头份,与RID检验的结果具有一定的相关性（R=0.6602）。研究结果表明,通过建立的IFA检验方法、并采用ELISA检测试剂盒、实时荧光RT-PCR试剂盒对30批猪瘟活疫苗进行效力检验,IFA和ELISA与RID相关性良好,其次是实时荧光RT-PCR方法。

关键词：猪瘟活疫苗(传代细胞源) 效力检验 IFA ELISA 实时荧光RT-PCR

鸡毒支原体灭活疫苗效力检验气囊注射攻毒方法的研究

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中国兽药杂志 2022年第10期56卷 12-17页

作者：魏津刘博马欣王甲赵浩然刘元杰冯妍刘业兵罗玉峰中国兽医药品监察所北京100081

鸡毒支原体灭活疫苗效力检验采用的喷雾攻毒方法所需菌液量大,结果易受喷雾时间和器械设备影响。为探索一种简便、易行且结果稳定的新方法,研究冻干了一批攻毒用菌株鸡毒支原体R株,对其性状、纯粹、真空度、剩余水分、培养特性、特异性... 详细信息

鸡毒支原体灭活疫苗效力检验采用的喷雾攻毒方法所需菌液量大,结果易受喷雾时间和器械设备影响。为探索一种简便、易行且结果稳定的新方法,研究冻干了一批攻毒用菌株鸡毒支原体R株,对其性状、纯粹、真空度、剩余水分、培养特性、特异性、活菌计数和均一性等进行检定,结果全部符合规定。将其稀释成不同活菌数,采用气囊注射方式攻毒,试验结果与《中国兽药典(2020年版三部)》中的喷雾方法相比更加稳定、准确。使用两种攻毒方法对5批次疫苗进行效力检验,结果无显著差异,可为该类疫苗攻毒方法优化提供新思路。

关键词：鸡毒支原体灭活疫苗气囊注射效力检验

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猪丹毒灭活疫苗效力检验血清学方法建立

中国兽药杂志 2023年第8期57卷 1-11页

作者：张媛王甲张一帜李建赵浩然李巧玲王秀丽刘元杰冯妍李旭妮彭国瑞李俊平中国兽医药品监察所北京100081

建立了猪丹毒丝菌抗体竞争ELISA检测方法,用于猪丹毒疫苗效力检验。用SpaA蛋白(纯度90%)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的SpaA蛋白单克隆抗体,建立猪丹毒丝菌竞争ELISA抗体检测方法,确定检测结果的判定标准,并对该方法的特异性、敏感性、重... 详细信息

建立了猪丹毒丝菌抗体竞争ELISA检测方法,用于猪丹毒疫苗效力检验。用SpaA蛋白(纯度90%)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的SpaA蛋白单克隆抗体,建立猪丹毒丝菌竞争ELISA抗体检测方法,确定检测结果的判定标准,并对该方法的特异性、敏感性、重复性(批间重复性和批内重复性)等进行评价。建立效力检验血清学方法与免疫攻毒法的平行关系,并对两种方法符合率进行评价。结果表明,SpaA的最佳包被浓度为2.0 ng/μL,阴阳性对照血清的最佳稀释倍数为1∶75,HRP标记的单克隆抗体的最佳工作浓度为0.2 ng/μL。ELISA结果判定标准为血清样本抑制率PI≥8.0%时判定为阳性,PI效力检验免疫攻毒法具备平行关系,小鼠血清效价≥1∶100时可抵抗1000 MLD强毒攻击;对用不同冻干代次菌种制备的4批猪丹毒丝菌灭活抗原和来自4家企业的7批猪丹毒灭活疫苗进行检测并与免疫攻毒实验结果比较,总符合率为100%。建立的猪丹毒丝菌抗体竞争ELISA检测方法可以作为猪丹毒疫苗的效力检验方法。

关键词：猪丹毒疫苗效力检验竞争ELISA

猪支原体肺炎疫苗效力检验常见问题与质量控制

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中国兽药杂志 2023年第7期57卷 51-55页

作者：刘博魏津马欣王甲赵浩然刘燕姚文生罗玉峰中国兽医药品监察所北京100081

为了更规范、标准地评价猪支原体肺炎疫苗,本研究对近年来猪支原体肺炎疫苗检验进行了系统性分析。结果发现,效力检验作为疫苗质量的核心内容,是检验中最易出现问题参数。对效力检验相关方法、常见问题进行分析,有助于研发过程中规避问... 详细信息

为了更规范、标准地评价猪支原体肺炎疫苗,本研究对近年来猪支原体肺炎疫苗检验进行了系统性分析。结果发现,效力检验作为疫苗质量的核心内容,是检验中最易出现问题参数。对效力检验相关方法、常见问题进行分析,有助于研发过程中规避问题,提高疫苗质量继而保障养殖业发展。

关键词：猪支原体肺炎疫苗效力检验替代方法

牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗效力检验替代方法的研究

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兽医导刊 2023年第3期 43-46页

作者：柏庆鲁立柱刘宏吴升张常锁马关涛曹剑天康生物制药股份有限公司新疆乌鲁木齐830032

为筛选一种动物来源确定、个体差异较小、经济成本低的牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗效力检验方法,选择3个批次的牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(Ⅰ型,NM01株)分别免疫牛、豚鼠,并在免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d采血,用微量血清中和... 详细信息

为筛选一种动物来源确定、个体差异较小、经济成本低的牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗效力检验方法,选择3个批次的牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗(Ⅰ型,NM01株)分别免疫牛、豚鼠,并在免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d采血,用微量血清中和法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)中和抗体。通过比较牛与豚鼠免疫血清BVDV中和抗体效价,评价用豚鼠替代牛进行牛病毒性腹泻/黏膜病灭活疫苗效力检验的可行性。结果表明,牛和豚鼠接种疫苗后BVDV抗体水平结果相关性较好,证明该替代方法可行。

关键词：牛病毒性腹泻/粘膜病灭活疫苗效力检验方法

猪链球菌2型疫苗效力检验的动物模型研究进展

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动物医学进展 2010年第5期31卷 103-106页

作者：孙智远李书光张旭晖沈志强尹燕博青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109 山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600 南京农业大学动物科技学院江苏南京210095

猪链球菌病是一种重要的人兽共患病,近年该病在亚洲重新暴发。CpG寡脱氧核苷酸等佐剂以及逆向疫苗学方法、标签式突变法等一系列方法的相继出现,有利于猪链球菌特别是猪链球菌2型疫苗的研究,但因缺乏理想的动物模型来评价疫苗效力,给该... 详细信息

猪链球菌病是一种重要的人兽共患病,近年该病在亚洲重新暴发。CpG寡脱氧核苷酸等佐剂以及逆向疫苗学方法、标签式突变法等一系列方法的相继出现,有利于猪链球菌特别是猪链球菌2型疫苗的研究,但因缺乏理想的动物模型来评价疫苗效力,给该病的防治增加了难度。2007年-2010年,针对猪链球菌2型对小鼠、斑马鱼、猪等模型动物的致病性,以及这些动物易感性等方面做了大量研究。论文对近年来与猪链球菌2型疫苗效力检验动物模型有关的研究进行了综述。

关键词：猪链球菌疫苗效力检验动物模型

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猪瘟活疫苗效力检验替代方法的研究

中国兽药杂志 2015年第3期49卷 1-6页

作者：王海光宁宜宝赖月辉吴文福王芳刘灿张文利黄秋雪陈坚林旭埜张毓金范学政徐璐王琴赵启祖丁家波中国兽医药品监察所北京100081 广东永顺生物制药股份有限公司广州511356

目前，我国猪瘟活疫苗效力检验最常用的方法是测定猪瘟疫苗中病毒的兔体感染量（ RID），但是用该方法易受到检验兔品种、个体和饲养环境的影响。为了探索一种不依赖动物的疫苗效力检验新方法，本研究将待检猪瘟活疫苗系列稀释后分别接... 详细信息

目前，我国猪瘟活疫苗效力检验最常用的方法是测定猪瘟疫苗中病毒的兔体感染量（ RID），但是用该方法易受到检验兔品种、个体和饲养环境的影响。为了探索一种不依赖动物的疫苗效力检验新方法，本研究将待检猪瘟活疫苗系列稀释后分别接种易感细胞，使用抗原捕获ELISA、RT－nestPCR和RT－PCR三种方法检测不同稀释度疫苗中活病毒在感染细胞后增殖的子代病毒，计算疫苗病毒的最高细胞感染剂量，建立了猪瘟疫苗病毒的细胞感染量（ CID）的效力检验方法。结果显示：疫苗中活病毒粒子越多，CID就越高；对不同类型猪瘟疫苗的检测结果表明，该方法适用于传代细胞源和细胞源猪瘟活疫苗的效力效检。使用CID和RID两种检测方法同时对12批猪睾丸传代细胞源（传代细胞源）和3批牛睾丸原代细胞源（细胞源）猪瘟活疫苗进行了比对效检，结果表明，用CID测定方法检验，12批猪瘟活疫苗（传代细胞源）每头份均含10^5 CID，3批猪瘟活疫苗（细胞源）每头份含量均为10^4 CID；用兔子感染体温测定法，12批猪瘟活疫苗（传代细胞源）每头份含量在2．6×10^4～3．0×10^4 RID之间，3批猪瘟活疫苗（细胞源）每头份含7．0×10^3～8．0×10^3 RID。试验证明：本实验室建立的CID检测结果与现有质量标准RID的结果存在良好的相关性，能够较好反映疫苗中活病毒的含量，有望成为RID的替代方法。

关键词：猪瘟活疫苗效力检验替代方法兔体感染量细胞感染量抗原捕获ELISA RT—nestPCR RT—PCR

水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)效力检验用实验动物抗体效价的对比研究

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黑龙江畜牧兽医 2018年第24期 181-183,262页

作者：赵传芳张蕾赵旭贺实伟中国农业科学院特产研究所长春130112 吉林特研生物技术有限责任公司长春130122

为了变更“水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)”质量标准中效力检验用的试验动物,试验采用血凝抑制试验方法,对比检验水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)对水貂和兔产生的抗体效价水平。结果表明:水貂和兔接种疫苗后14~180天的血清H... 详细信息

为了变更“水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)”质量标准中效力检验用的试验动物,试验采用血凝抑制试验方法,对比检验水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)对水貂和兔产生的抗体效价水平。结果表明:水貂和兔接种疫苗后14~180天的血清HI抗体水平差异不显著(P>0.05),均达到效力检验质量标准要求。用兔替代水貂进行水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗(MEVB株)的效力实验的抗体监测科学、方便、可行。

关键词：水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗效力检验实验动物抗体效价

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兽用狂犬病灭活疫苗效力检验参考疫苗的研制

中国兽医杂志 2013年第8期49卷 73-76,80页

作者：李宁支海兵张伟薛青红李润印春生赵德明中国农业大学动物医学院国家动物海绵状脑病实验室北京海淀100193 中国兽医药品监察所北京海淀100081 北京出入境检验检验局北京朝阳100026

将试制的狂犬病灭活疫苗效力检验参考疫苗分别采用NIH和ELISA方法进行了标定,并组织人员进行了协作标定,确定参考疫苗的效价为5.44IU。对标定后的参考疫苗进行了均一性和稳定性试验,结果参考疫苗的均一性好,在-20℃放置15个月和4℃放置... 详细信息

将试制的狂犬病灭活疫苗效力检验参考疫苗分别采用NIH和ELISA方法进行了标定,并组织人员进行了协作标定,确定参考疫苗的效价为5.44IU。对标定后的参考疫苗进行了均一性和稳定性试验,结果参考疫苗的均一性好,在-20℃放置15个月和4℃放置2个月效价稳定,在37℃放置2个月效价大于2.00IU,符合我国和WHO对动物用狂犬灭活疫苗效力的要求。本课题为进一步自主研发检验用标准品提供了试验依据,同时也响应了WHO狂犬病委员会敦促各国研制和标定参考品的要求,填补了我国兽用狂犬病灭活疫苗效力检验标准品的空白。

关键词：狂犬病灭活疫苗效力检验标准品