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玉米抗南方型锈病基因共分离分子标记的研究

作物学报 2007年第5期33卷 849-852页

作者：蒋雅娟贺岩张登峰徐丽苏胜宝戴景瑞王守才中国农业大学国家玉米改良中心北京100094

本文以玉米(Zea maysL.)抗南方型锈病自交系P25和感病自交系F349的F1与F349回交,并连续回交所得BC5代的F349抗病近等基因系(nearly isogenic lines,NILs)为材料,以RGA(resistance gene analogs)的方法,在抗病自交系中克隆出一条321 bp的特异性DNA条带。根据序列比对的结果,设计出新的引物作为分子标记,在96株BC7、BC4F5NILs及其亲本和杂种F1群体上进行鉴定,其中94株的田间抗感结果与分子检测结果一致,选择的有效率达97.9%。此标记扩增效果清晰、可重复性强,在抗玉米南方型锈病的分子标记辅助育种研究中有应用价值。

关键词：南方型锈病抗病基因同源序列分子标记玉米

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水稻品种抗瘟遗传多样性分析及其应用

植物保护学报 2006年第2期33卷 113-116页

作者：马辉刚黄瑞荣孙雁朱有勇刘康成江西农业科学院植物保护研究所南昌330200 云南农业大学植病实验室昆明650201 江西省吉安地区农科所吉安343119

以水稻的Xa21基因中富含亮氨酸重复区域(leucine-rich repeat regions)设计的XLRR for(CCGTTGGACAGGAAGGAG)与XLRR rev(CCCATAGACCGGACTGTT)为引物,通过PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,进行了江西省水稻主栽品种和地方资源品种的抗病基因类似序列(resistancegeneanalogue,RGA)分析。结果表明,水稻抗病基因类似序列类型丰富,供试的23个品种的RGA-PCR指纹聚类后,当以欧氏距离4.5划分时,可分为6个遗传相似组。同一遗传相似组内的品种,在品种的特性上,有较强的相似性,如第二组,由两个品种大禾谷和长粒糯组成,它们均为高秆的地方优质老品种,生产上均较感稻瘟病。烂蔸糯和流稻糯两个糯稻品种,属同一遗传相似组。当以欧氏距离5.0划分时,可分为2个遗传相似组,其中一组包括圆粒糯、大禾谷、长粒糯等江西三个地方老品种和巴西陆稻。主栽品种汕优63、两优培九等与烂蔸糯、圆粒糯等优质地方老品种,遗传距离较远。田间试验表明,遗传背景差异较大的品种混合间栽,对稻瘟病平均防效达91.98%～95.68%。

关键词：水稻抗病基因同源序列稻瘟病品种多样性

芝麻NBS类抗茎点枯病相关基因的克隆与分析

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河南农业科学 2013年第10期42卷 74-78,98页

作者：于沐刘红彦苗红梅田保明郑州大学生物工程系河南郑州450001 河南省农业科学院植物保护研究所河南郑州450002 河南省农业科学院芝麻研究中心河南郑州450002

根据前期获得的芝麻抗茎点枯病NBS-RGAs序列与河南省芝麻研究中心提供的EST序列比对结果,设计4对特异引物,从10个对茎点枯病表现不同抗性的芝麻品种中扩增得到16条RGAs(抗病基因同源序列),GenBank登录号分别为KC477692～KC477707,它们... 详细信息

根据前期获得的芝麻抗茎点枯病NBS-RGAs序列与河南省芝麻研究中心提供的EST序列比对结果,设计4对特异引物,从10个对茎点枯病表现不同抗性的芝麻品种中扩增得到16条RGAs(抗病基因同源序列),GenBank登录号分别为KC477692～KC477707,它们编码的氨基酸序列均具有NBS(核苷酸结合位点)类型抗病基因的特征结构域。Blastx分析结果表明,16个RGAs基因编码的部分氨基酸序列与已知NBS类抗病蛋白同源性为35%～52%。聚类分析发现这些RGAs基因聚为4类,且均为non TIR-NBS类型,为进一步筛选芝麻抗茎点枯病基因奠定了基础。

关键词：芝麻茎点枯病核苷酸结合位点抗病基因同源序列序列分析

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38 RGAs分析

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中国农学通报 2009年第19期25卷 222-227页

作者：王文霞宋志强杨文香刘大群河北农业大学植物病理系/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心河北保定071001

为获得Lr38的抗病类似物质,寻找与抗病基因表达相关的目的片段。根据已知植物抗病基因的NBS-LRR(核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复)类保守区域设计简并引物,应用RGA技术在小麦的未知基因cDNA中扩增和分离抗病基因同源序列。从小麦抗叶锈... 详细信息

为获得Lr38的抗病类似物质,寻找与抗病基因表达相关的目的片段。根据已知植物抗病基因的NBS-LRR(核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复)类保守区域设计简并引物,应用RGA技术在小麦的未知基因cDNA中扩增和分离抗病基因同源序列。从小麦抗叶锈近等基因系TcLr38中获得了9个小麦抗病基因同源片段D-8、A-5、B-20、C-6、F-16、A-4、B-9、C-4和D-12。经BLASTp分析,9个片段都含有NB-ARC保守结构域,其中D-8、A-5、B-20、C-6、A-4、B-9、C-4和D-12与已知抗病基因的相应区域相一致,具有抗病基因NBS特征结构域激酶2a(Kinase-2a)、激酶3a(Kinase-3a)和疏水结构域(HD)。片段D-8、A-5、B-20、C-6、A-4、B-9、C-4和D-12可能与抗病基因表达相关。

关键词：小麦叶锈 TcLr38 NBS—LRR 抗病基因同源序列

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小麦抗赤霉病品种NBS同源序列克隆与分析

生物技术通报 2012年第2期28卷 128-135页

作者：魏芳马鸿翔江苏省农业科学院农业生物技术研究所南京210014

根据二穗短柄草NBS-LRR类基因的保守序列设计同源引物,以小麦抗赤霉病品种苏麦3号、宁7840和望水白基因组DNA为模板,通过PCR扩增,得到43条序列,其中4条为非编码序列或结构域不完整;39条与植物抗病基因同源,其中的7条内部存在终止密码子... 详细信息

根据二穗短柄草NBS-LRR类基因的保守序列设计同源引物,以小麦抗赤霉病品种苏麦3号、宁7840和望水白基因组DNA为模板,通过PCR扩增,得到43条序列,其中4条为非编码序列或结构域不完整;39条与植物抗病基因同源,其中的7条内部存在终止密码子,可能是假基因,经过比对分析,其余32条具有连续的开放阅读框和保守结构域,推导的氨基酸序列均具有Kinase-1a、Kinase-2和Kinase-3a及GLPL区等几个保守区,在GenBank中均能找到与之高度同源的其他物种的核酸序列,并且Kinase-2的最后一个氨基酸均为色氨酸(W),属于non-TIR类NBS基因。32条序列可分为4大类,它们之间核苷酸同源性为64%-98%,编码氨基酸同源性为22%-98%。根据序列分析随机设计5对不同基因特异性引物,并利用RT-PCR技术进行表达分析,结果表明,7-1、s-3、s-4和w-2均能表达,说明这些片段可能是功能性抗病基因的部分序列;7-13不表达,再次证明属于假基因。32条序列在之前未被报道过,这些RGA可以作为筛选赤霉病功能性抗病基因的候选序列。

关键词： NBS-LRR 抗病基因同源序列小麦赤霉病

TcLr24小麦NBS-LRR同源基因的克隆与分析

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西北农业学报 2016年第4期25卷 518-522页

作者：谢欢周颖杨文香张娜刘大群河北农业大学植物保护学院植物病理系河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心国家北方山区农业工程技术研究中心河北保定071001

目前已克隆的小麦抗叶锈病基因多数含有NBS类保守结构域,为克隆高抗叶锈病Lr24基因及其抗病相关基因,根据NBS保守结构域设计引物,对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24cDNA进行扩增,得到534bp的抗病基因同源序列。对该序列进行同源性检索并验... 详细信息

目前已克隆的小麦抗叶锈病基因多数含有NBS类保守结构域,为克隆高抗叶锈病Lr24基因及其抗病相关基因,根据NBS保守结构域设计引物,对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24cDNA进行扩增,得到534bp的抗病基因同源序列。对该序列进行同源性检索并验证,获得1 408bp的电子延伸序列。以此通过RACE技术分别获取2 797bp和3 466bp的cDNA与gDNA全长产物,其翻译的蛋白质序列含有NBS保守区的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD和LRR保守结构,与大麦等单子叶植物NBS类蛋白序列同源性较高,生物信息学分析表明其为稳定的亲水性蛋白,分子质量104.28ku,理论等电点6.15。半定量RT-PCR表明该片段所在基因序列为组成型表达。

关键词：小麦 TcLr24 抗病基因同源序列 NBS

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辣椒抗黄瓜花叶病毒同源序列的克隆与分析

江苏农业学报 2009年第4期25卷 838-842页

作者：杨学玲王述彬刘金兵潘宝贵万红建陈劲枫南京农业大学园艺学院江苏南京210095 江苏省农业科学院蔬菜研究所江苏南京210014

根据已知抗病基因的核苷酸结合位点（NBS）保守结构域设计简并引物，以高抗黄瓜花叶病毒的辣椒Yv2007001为试材，获得10条抗病基因同源序列（RGA）。经序列分析，这些RGAs皆具有开放阅读框和NBS保守结构域（P-loop、Kinase-2、Kinase-3a... 详细信息

根据已知抗病基因的核苷酸结合位点（NBS）保守结构域设计简并引物，以高抗黄瓜花叶病毒的辣椒Yv2007001为试材，获得10条抗病基因同源序列（RGA）。经序列分析，这些RGAs皆具有开放阅读框和NBS保守结构域（P-loop、Kinase-2、Kinase-3a、RNBS-C和GLPL），属于nonTIR—NBS-LRR类抗病基因同源序列。其中RGA46与番茄花叶病毒抗性基因Tm-2^2的氨基酸同源性为78％，可能与辣椒抗黄瓜花叶病毒（CMV）相关。其它序列与已知抗病基因Prf、RPP13、I2C-1、Mi-1．2、L6、M氨基酸相似性为21％～70％。所得RGA序列的Ka／Ks值为0．0110—0．3051，均显著小于1，表明“纯化选择”在辣椒NBS区域进化中起主要作用。

关键词：辣椒黄瓜花叶病毒抗病基因同源序列核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复

核桃（Juglans regia L.）抗炭疽病基因类似物标记研究

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核桃（Juglans regia L.）抗炭疽病基因类似物标记研究

作者：安海山山东农业大学

学位级别：硕士

核桃炭疽病（anthracnose）是核桃（Juglans regia L.）的主要病害，给核桃生产业造成了严重危害，该病由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起。开展核桃抗炭疽病分子辅助选择，选育抗性种质是我国核桃育种的迫切需要。... 详细信息

核桃炭疽病（anthracnose）是核桃（Juglans regia L.）的主要病害，给核桃生产业造成了严重危害，该病由胶胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起。开展核桃抗炭疽病分子辅助选择，选育抗性种质是我国核桃育种的迫切需要。本研究根据抗病基因的保守性设计简并引物，研究了核桃NBS、LRR和STK抗病基因类似物标记(resistancegene analogs, RGA)，这对于核桃抗炭疽病相关基因克隆和抗炭疽病的分子辅助选择具有重要的现实意义。研究结果如下：1，根据已知抗病基因的NBS域、LRR域和STK域等保守域设计了8对兼并引物，扩增核桃基因组DNA中的抗病基因类似物。结果显示，3对引物组合P-loop/GLPL、NLRR inv1/inv2和Pto kin1/kin2能够扩增出目的条带。回收目的条带，连接、转化和测序，得到了35个NBS序列、45个STK序列和47个LRR序列，这些RGA标记均与杂交群体的抗病性共分离。2， NBS类RGA标记：引物P-loop/GLPL扩增出约500bp的DNA片段。BLAST结果显示，所得NBS序列与多个物种的NBS型抗病基因具有较高相似性，核苷酸相似性为67%-88%;氨基酸相似性为46%-73%;35个NBS序列分析表明，所得序列均具有典型的NBS功能域，将其命名为jrRGAPGs，GenBank登录号为: JX646704-JX646738。在35个NBS序列中，有32条具有完整开放阅读框（ORF），推导氨基酸序列分析表明，这32条序列都包含NBS类抗病基因所特有的保守结构域，如P-loop、kinase-2a、kinase-3a和GLPL等。基于核苷酸序列的NJ系统发育树可将NBS序列分为10类;基于推导氨基酸序列的NJ发育树可将其分为TIR和non-TIR两个亚类;在相似系数为0.1时,UPGMA聚类分析也将NBS序列分为10个小组。氨基酸序列相似性表明，核桃NBS序列各小组间相似度为23.1%-75%，与已知抗病基因相应区域相似性为20.6%-51.9%。NBS核苷酸序列多态性(Pi)分析表明，所得NBS序列在其保守功能域的Pi明显低于其它区段，进一步证明了NBS功能域的高度保守性;dN/dS分析表明，大部分核桃NBS序列的dN/dS比值集中在0-0.9331为正向选择（positive selection），核桃NBS序列的进化受不同自然选择压力的影响;推导氨基酸的二级及3D模型显示，所得NBS序列具有复杂的骨架结构，其中α螺旋结构（Helices）占53.55%，卷曲结构（Coils）占43.17%，线状结构（Strands）占3.28%。3，LRR类RGA标记：以NLRR inv1/inv2为引物，PCR扩增获得约500bp和2000bp的DNA片段，回收500bp的目的片段，共得到47条LRR序列，将其命名为jrRGANLs，GenBank登录号为：KF151270-KF151316。BLAST结果显示，所得LRR序列在GenBank中无同源性序列，且47条LRR序列之间也表现出较高的多态性。系统发育分析显示，所得核桃LRR核苷酸序列可划分为多个小组，氨基酸序列系统发育树将其分为两大类3个小组。4，STK类RGA标记：以Pto kin1/kin2为引物，PCR扩增获得约750bp的DNA片段，对其进行回收、连接转化和测序，共获得45条STK序列，GenBank登录号为：KF151225-KF151269。 BLAST结果显示，所得STK序列与多个物种的蛋白激酶受体具有相似性（89%-93%）。对这45条STK序列的推导氨基酸序列分析表明，这45条STK序列具有8个保守催化结构(I-VIII)。ORF分析表明所得STK序列均含有多个终止子。5，核桃RGA标记的定位：利用JoinMap3.0软件构建核桃RGA标记与抗病基因位点的连锁遗传图，发现3种不同类型的RGA标记与核桃抗病基因位点相连锁，NBS、LRR、STK标记与R位点的遗传距离分别为16.22cM、24.49cM和3.06cM。

关键词：核桃(Juglans regia L.) 抗病基因同源序列核苷酸结合位点富亮氨酸重复丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶

黄麻炭疽病病原菌的分离鉴定及NBS-LRR类抗病基因的克隆

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黄麻炭疽病病原菌的分离鉴定及NBS-LRR类抗病基因的克隆

作者：高红福建农林大学

学位级别：硕士

黄麻(jute)作为一种天然的纤维作物,是麻纺工业的重要原料。它往往受到多种病害的影响,黄麻炭疽病就是其中之一,对黄麻的生产带来巨大的影响。若要有效的防治黄麻炭疽病的发生,就必须对黄麻炭疽病病原菌的种类进行一个全面研究。本研究... 详细信息

黄麻(jute)作为一种天然的纤维作物,是麻纺工业的重要原料。它往往受到多种病害的影响,黄麻炭疽病就是其中之一,对黄麻的生产带来巨大的影响。若要有效的防治黄麻炭疽病的发生,就必须对黄麻炭疽病病原菌的种类进行一个全面研究。本研究主要是从圆果种黄麻炭疽病病原鉴定、黄麻179与爱店野生种的杂交所衍生的由144个品系组成的重组自交系(Recombinant inbred line,RIL)F8代群体的炭疽病抗性鉴定以及NBS-LRR类抗病基因的同源克隆三个方面展开试验,主要结果如下:(1)病原鉴定从浙江、福建、广西、河南4省采集圆果种黄麻炭疽病的病原菌样本,进行分离纯化、形态学特征分析、分子生物学方法分析其rDNA-ITS、LSU、β-Tub2区域的基因序列。结果发现:圆果种黄麻上的炭疽病病原菌主要有两种,分别为黑线炭疽菌(***)和胶孢炭疽菌(***)。(2)致病力测定将分离获得的7个菌株接种在同一品种福农1号的茎秆上,结果发现,供试菌株的致病性存在一定的差异,总的来说,黑线炭疽菌(***)致病力强,而胶孢炭疽菌(***)致病力较弱。(3)抗性鉴定取致病性最强的FJ2菌株,采用菌饼接种的方法对在大田里144份黄麻株系进行接种,结果表明不同株系的黄麻发病程度差异较大,病斑大小从11.79-30.50mm,其中 RI-98(11.79mm)、RI-45(11.87mm)、RI-76(12.69mm)等表现出抗病,RI-13(30.50mm)、RI-108(29.61mm)、RI-61(28.77mm)等表现出感病。(4)NBS-LRR类抗病基因的同源克隆按照同源克隆法,以黄麻抗炭疽病株系98号的DNA为模板,进行PCR扩增,分离出NBS抗病基因同源序列(RGA)3条。RGAs序列分析发现,各RGA编码的氨基酸序列皆含有NBS区的保守结构(P-loop、激酶2、激酶3和疏水结构域HD),这说明了各条RGAs可能与抗病性有关。

关键词：黄麻炭疽病病原菌病原鉴定抗性鉴定抗病基因同源序列