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抑癌基因p53密码子偏好性分析及其突变致癌预测

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计算机与应用化学 2012年第11期29卷 1299-1303页

作者：谈承杰朱平江南大学理学院江苏无锡214122

p53是人类恶性肿瘤中最常见的突变基因,与人类肿瘤的发生相关性最高,也是基因研究中热度最高的基因之一。为深入研究人类p53基因突变机理,选取了6条人类p53基因mRNA序列。首先,利用基于RSCU方法下的多重变量分析软件CodonW对影响密码子... 详细信息

p53是人类恶性肿瘤中最常见的突变基因,与人类肿瘤的发生相关性最高,也是基因研究中热度最高的基因之一。为深入研究人类p53基因突变机理,选取了6条人类p53基因mRNA序列。首先,利用基于RSCU方法下的多重变量分析软件CodonW对影响密码子使用的各项参数进行计算和统计分析,分析可得,密码子适应指数(CAI)与最优密码子使用频率(FOp)、密码子偏爱指数(CBI)均呈极显著正相关(pp)、第三位碱基G3s、密码子适应指数(CAI)均呈极显著负相关(pp53密码子偏好性间距进行了分析设计,得出了基于拟氨基酸编码的方法能充分体现p53密码子对同义密码子的一致偏好性的结论,且p53基因更偏好使用以c或g结尾的同义密码子。以上各项参数也充分验证了拟氨基酸编码方法与p53密码子偏好性研究结果的紧密关联性。最后,结合前人对抑癌基因p53突变致癌的研究,对该6条基因序列作了病变预测,从而为人类恶性肿瘤的预防和预测提供重要的理论依据。

关键词：抑癌基因p53 偏好性同义密码子突变 QRSCU

抑癌基因p53调控丙戊酸所致乳腺癌细胞放射增敏性的分子机制研究

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抑癌基因p53调控丙戊酸所致乳腺癌细胞放射增敏性的分子机制研究

作者：田竹筠山东大学

学位级别：硕士

研究目的乳腺癌是恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的生命健康,如何有效地治疗乳腺癌一直备受关注。放射治疗即通过电离辐射(ionizing radiation,IR)治疗,是乳腺癌患者临床治疗常用手段,寻找有效的放射增敏剂是该领域的焦点问题。IR能导致... 详细信息

研究目的乳腺癌是恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的生命健康,如何有效地治疗乳腺癌一直备受关注。放射治疗即通过电离辐射(ionizing radiation,IR)治疗,是乳腺癌患者临床治疗常用手段,寻找有效的放射增敏剂是该领域的焦点问题。IR能导致严重的DNA损伤,即诱发DNA发生双链断裂(double strand breaks,DSBs)损伤,在DNADSBs损伤的修复机制中,同源重组(homologous recombination,HR)修复发挥了重要的作用。丙戊酸(valproic acid,VpA)是一种短链脂肪酸,具有抗肿瘤活性,我们课题组和其他研究小组均发现,0.5 mM VpA通过干扰BRCA1-RAD51介导的HR修复机制抑制肿瘤细胞生长并发挥放射增敏作用。野生型抑癌基因p53(wild-type p53,wtp53)具有抑制HR修复能力过度增强的作用,以维持HR功能处于正常的水平。有研究表明,在结直肠癌细胞中,p53通过干扰细胞凋亡机制影响VpA的放射增敏作用,表现为在wtp53细胞中VpA的放射增敏作用显著,而对于p53缺欠(defective p53,dp53)的细胞,其放射增敏作用受到抑制。本课题旨在拟探讨p53表达状态是否影响VpA对乳腺癌细胞的放射增敏作用及其作用机制与HR修复功能之间的关系,为VpA用于临床治疗乳腺癌患者提供可靠的理论指导及实验依据。研究方法1.p53表达下调同源配对细胞系工作模型的建立及p53蛋白表达的检测用含有pLKO.1和p53shRNA表达的慢病毒颗粒液感染乳腺癌细胞MCF7,建立稳定表达wtp53和dp53的同源配对细胞系;以MCF7细胞作为阳性对照,应用蛋白免疫印迹实验检测p53蛋白表达情况,以鉴定p53表达下调同源配对细胞系(wtp53和dp53)的建立情况。同时,将wtp53和dp53细胞分别分为对照组、VpA组(单独0.5 mMVpA作用24 h)、IR组(单独8GyIR)以及VpA+IR组(VpA预处理24 h后再联合8GyIR),应用蛋白免疫印迹实验再次检测各组p53蛋白的表达情况,再次确定在不同处理条件下wtp53和dp53细胞中p53的表达情况。2.细胞核DNADSBs的检测选取处于对数生长阶段的wtp53和dp53细胞,分别分为四组:对照组、VpA组(单独0.5mM VpA作用24 h)、IR组(单独8Gy IR)以及VpA+IR组(VpA预处理24h后再联合8GyIR)。准备两部分:一部分IR处理结束后恢复30min,收集各组单细胞悬液,进行中性彗星实验;另一部分IR处理结束后恢复6h后收集细胞制备单细胞悬液,进行免疫荧光实验。分别检测各组细胞核拖尾尾距及细胞核γH2AX焦点形成情况,分析细胞核内DNADSBs损伤程度。3.细胞存活能力的检测选取处于对数生长阶段的wtp53和dp53细胞,分别分为八组:对照组、VpA组(单独0.5mM VpA作用24h)、IR组(三组:单独2、4、6Gy)、VpA+IR(三组:0.5mM VpA预处理24h后分别联合2、4、6Gy IR)组。处理结束后,更换新鲜培养基,静置培养14天,终止培养,结晶紫染色后计算各组细胞的克隆形成百分率,以反映细胞的增殖存活能力。***效率的检测将带有绿色荧光蛋白标记的HR底物报告基因pDR-GFp转入乳腺癌细胞MCF7,筛选出稳定表达pDR-GFp的MCF7细胞。用含有pLKO.1或p53shRNA表达的慢病毒颗粒液感染稳定表达的MCF7/pDR-GFp细胞,建立MCF7/pDR-GFp/wtp53和MCF7/pDR-GFp/dp53细胞,转染核酸内切酶I-sceI4h后,将细胞按照总数2-3*105接种于p60培养皿中,wtp53和dp53细胞各分为两组:对照组、VpA(单独0.5 mM VpA作用24h),药物处理结束后更换新鲜的细胞培养液,培养72h后胰酶消化,1000r/min离心5min,弃上清,pBS重悬,用流式细胞仪检测1*105个细胞,统计发出绿色荧光的细胞数,同源重组(HR)修复效率=绿色荧光细胞数目/(1*105),对比各组HR修复效率。***修复关键蛋白BRCA1和RAD51表达的检测选取处于对数生长阶段的wtp53和dp53细胞,分为对照组、VpA组(0.5mM VpA作用24h)、IR组(单独8GyIR)、VpA+IR(0.5mM VpA 预处理24h,再给予8Gy IR),处理后固定细胞,应用免疫荧光技术检测BRCA1和RAD51在细胞核中的焦点形成情况,计数其焦点形成阳性细胞数占总细胞数的百分率。研究结果1.p53表达下调同源配对(wtp53和dp53)细胞系模型的建立根据蛋白免疫印迹实验结果,与MCF7细胞相比,感染慢病毒颗粒pLKO.1的细胞中p5

关键词：乳腺癌细胞丙戊酸抑癌基因p53 放射增敏同源重组

丙戊酸对乳腺癌MCF7细胞的放射增敏性依赖于抑癌基因p53

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中国药理学与毒理学杂志 2019年第4期33卷 257-264页

作者：田竹筠杨春旺蔡祖超凤志慧山东大学公共卫生学院山东济南250012 济南市第三人民医院山东济南250132

目的研究抑癌基因p53对丙戊酸(VpA)所致乳腺癌细胞放射增敏性的影响及其与同源重组(HR)修复机制的关系。方法用含pLKO.1或p53 shRNA慢病毒颗粒液感染乳腺癌MCF7细胞,建立p53表达下调的同源配对MCF7细胞系,即MCF7/野生型p53(MCF7/wtp53)... 详细信息

目的研究抑癌基因p53对丙戊酸(VpA)所致乳腺癌细胞放射增敏性的影响及其与同源重组(HR)修复机制的关系。方法用含pLKO.1或p53 shRNA慢病毒颗粒液感染乳腺癌MCF7细胞,建立p53表达下调的同源配对MCF7细胞系,即MCF7/野生型p53(MCF7/wtp53)和MCF7/缺欠型p53(MCF7/dp53)细胞;感染MCF7/(pDR-GFp)细胞,建立MCF7/pDR-GFp/wtp53和MCF7/pDR-GFp/dp53细胞;各分为细胞对照组、VpA组(VpA 0.5 mmol·L-1处理24 h)、电离辐射(IR,8 Gy)组和VpA+IR组(VpA 0.5 mmol·L-1预处理24 h后联用IR)。通过Western印迹实验检测p53蛋白表达水平,彗星和免疫荧光实验分别检测细胞核拖尾尾距及磷酸化组蛋白(γH2AX)焦点细胞比率,细胞克隆形成实验检测克隆形成率,流式细胞术检测HR修复效率,免疫荧光实验检测含乳腺癌易感基因1(BRCA1)蛋白和重组酶51(Rad51)蛋白焦点细胞比率。结果 Western印迹结果显示,MCF7/wtp53细胞中存在p53蛋白表达,MCF7/dp53细胞中p53蛋白表达显著降低(pp53细胞中,与IR组相比,VpA+IR组细胞核拖尾尾距和含γH2AX焦点细胞百分率升高(pp53细胞中,与IR组相比,VpA+IR组细胞核拖尾尾距和含γH2AX焦点细胞百分率均升高(pp53细胞VpA+IR组(pp53细胞中,VpA+IR组细胞存活率低于IR组(pp53细胞中,VpA+IR组细胞存活率虽低于IR组(pp53细胞VpA+IR组(ppDR-GFp/wtp53细胞中,VpA组HR效率低于细胞对照组(ppDR-GFp/dp53细胞中,VpA组HR效率低于细胞对照组(ppDRGFp/wtp53细胞VpA组(pp53细胞中,VpA+IR组含BRCA1和Rad51焦点细胞百分率均低于IR组(pp53细胞中,VpA+IR组含BRCA1和Rad51焦点细胞百分率均低于IR组(pp53细胞VpA+IR组(ppA对乳腺癌MCF7细胞具有放射增敏性;抑制p53表达可降低VpA的放射增敏作用,与BRCA1-Rad51介导的HR机制过度增强有关。

关键词：乳腺癌细胞丙戊酸抑癌基因p53 电离辐射同源重组

U6嵌和型Maxizyme对肝癌突变抑癌基因p53的抑制作用

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中华肝脏病杂志 2005年第10期13卷 759-762页

作者：孔心涓林菊生宋宇虎金由辛华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所武汉430030 中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所

目的探讨U6嵌和型Maxizyme对肝癌突变抑癌基因p53的抑制作用。方法应用计算机设计针对肝癌突变抑癌基因p53(mtp53)249位密码子(AGG→AGT)Maxizyme(Mz)的基因片段,构建其真核表达载体,使抗mtp53的Mz嵌于U6表达系统中,细胞外由T7 RNA聚合... 详细信息

目的探讨U6嵌和型Maxizyme对肝癌突变抑癌基因p53的抑制作用。方法应用计算机设计针对肝癌突变抑癌基因p53(mtp53)249位密码子(AGG→AGT)Maxizyme(Mz)的基因片段,构建其真核表达载体,使抗mtp53的Mz嵌于U6表达系统中,细胞外由T7 RNA聚合酶转录,细胞内由RNA聚合酶Ⅲ高效转录。检测Mz在细胞外对mtp53的切割效率。在LipofectamineTM2000介导下转染肝癌细胞MHCC97,应用逆转录聚合酶链反应(RT-pCR)检测Mz对肝癌细胞mtp53的抑制作用,western blot分析mtp53蛋白表达水平,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察肿瘤细胞的生长情况。结果在细胞外,Mz可特异性切割靶基因mtp53,切割效率为42%,而野生型p53(wtp53)没有被切割。RT-pCR和western blot检测结果提示转染Mz的MHCC97内mtp53 mRNA和蛋白(5.3 ×104)表达均明显下降,转染Mz的MHCC97增殖速度明显降低。结论U6表达系统能高效启动核酶等小分子RNA的转录,U6嵌和型Maxizyme在细胞内外均可特异性抑制mtp53表达,抑制肝癌细胞增殖,有望开发为肝癌基因治疗的新方法。

关键词：癌,肝细胞基因,p53 基因疗法 Maxizyme 肝癌细胞增殖抑癌基因p53 抑制作用癌突变逆转录聚合酶链反应 RNA聚合酶Ⅲ

人抑癌基因p53与pTEN的CRISpR-Cas9导向RNA靶点筛选与效率验证

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吉林大学学报（医学版） 2018年第2期44卷 235-242页

作者：许文舒胡正杨永广王晓丹吉林大学第一医院转化医学院/免疫学研究所吉林长春130061

目的:探讨应用新兴基因编辑技术规律性成簇的间隔短回文重复序列-核酸酶系统(CRISpR-Cas9)对人体内2个抑癌基因p53与pTEN进行编辑的可行性,并通过体外检测研究其编辑效果,为原代细胞向肿瘤细胞转化及建立人源化小鼠肿瘤模型提供实验研... 详细信息

目的:探讨应用新兴基因编辑技术规律性成簇的间隔短回文重复序列-核酸酶系统(CRISpR-Cas9)对人体内2个抑癌基因p53与pTEN进行编辑的可行性,并通过体外检测研究其编辑效果,为原代细胞向肿瘤细胞转化及建立人源化小鼠肿瘤模型提供实验研究工具。方法:序列分析确定p53及pTEN基因各亚型mRNA剪辑的共同外显子区域,针对该区域进行软件评分,设计选择针对p53及pTEN基因的CRISpR-Cas9导向RNA(sgRNA)靶点各2个,即p53-1、p53-2、pTEN-1和pTEN-2。构建共表达sgRNA与Cas9-p2A-GFp的CRISpR-Cas9质粒。选择处于对数生长期的293T细胞,将其分为对照组(未转染质粒的野生型293T细胞)和实验组(利用Lipofectamine 2000转染sgRNA-Cas9-p2A-GFp共表达质粒的293T细胞),流式细胞术分选实验组绿色荧光蛋白(GFp)阳性细胞(成功转染质粒的细胞),2周扩增培养后提取基因组DNA,pCR扩增基因组DNA包含突变位点的区段,将扩增产物凝胶电泳后胶回收,连接至pEASY-Blunt Zero克隆载体中,转化,挑取单克隆菌斑培养,提取质粒DNA测序,对比对照组与实验组测序结果后确定RNA介导的特异基因位点突变效率。结果:转染sgRNA-Cas9-p2A-GFp质粒的实验组流式细胞术分选后GFp阳性率高达82%,与分选前(4%)比较明显升高(p基因组pCR,其中包含p53突变位点的扩增片段长度均为612bp,而包含pTEN-1突变位点的扩增片段长度为667bp,包含pTEN-2突变位点的扩增片段长度为947bp。对比实验组基因测序结果与未经sgRNA-Cas9-p2A-GFp质粒转染的对照组野生型细胞测序结果,p53-1、p53-2和pTEN-2诱导的突变效率分别为54.5%、45.5%和33.3%。结论:针对人p53及pTEN基因设计的sgRNA p53-1、p53-2和pTEN-2能够在基因组水平较高效率地成功介导Cas9进行位点特异性的基因编辑。

关键词：导向RNA 规律性成簇的间隔短回文重复序列抑癌基因p53 抑癌基因pTEN 人类

应用组织芯片探讨纤维连接蛋白和抑癌基因p53以及Ezrin表达与喉癌生物学行为的关系

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中华耳鼻咽喉科杂志 2004年第11期39卷 683-686页

作者：董频李晓艳路光忠朱正华於子卫金斌祝江才上海交通大学附属第一人民医院耳鼻咽喉头颈外科 200080 上海交通大学附属第一人民医院病理科 200080

目的　探讨纤维连接蛋白 (fibronectin ,Fn)、抑癌基因p5 3和 p81(Ezrin蛋白 )在喉癌中表达 ,及其与喉癌流行病史、病理学分级、临床TNM分期和预后等生物学行为的关系。方法　应用组织芯片技术进行免疫组织化学链霉抗生物素蛋白过氧... 详细信息

目的　探讨纤维连接蛋白 (fibronectin ,Fn)、抑癌基因p5 3和 p81(Ezrin蛋白 )在喉癌中表达 ,及其与喉癌流行病史、病理学分级、临床TNM分期和预后等生物学行为的关系。方法　应用组织芯片技术进行免疫组织化学链霉抗生物素蛋白过氧化物酶连接法 (streptavidin peroxidaseconjugatedmethod ,Sp法 )染色检测 1992～ 2 0 0 0年中手术治疗的 85例喉鳞状细胞癌中FN、p5 3和p81等因子的表达 ,结合临床相关因素进行统计分析。结果　 85例中 6例的组织芯片样本中肿瘤细胞较少或无肿瘤细胞。Fn染色 70例中 38例为阴性或低度阳性 ,32例为强阳性 ,在肿瘤T分级中Fn表达有统计学差异 (p p81阳性细胞比率范围 0 %～ 10 0 % ,平均 5 3 7% ,中位数 5 8 7% ,87 3% (6 9/ 79)有阳性表达。以中位数为界分为 p81高、低表达组 ,两组T分级、临床早晚期、生存率有统计学差异 (p p >0 0 5 )。p5 3染色 79例中 37例阳性 (46 8% ) ,平均染色比率为 2 1 6 % ,范围 0～ 90 3% ,中位数为5 9%。p5 3蛋白阳性表达与患者吸烟、性别。

关键词：表达喉癌抑癌基因p53 肿瘤组织芯片吸烟患者学分中位数差异

多发性结直肠癌中抑癌基因p53的表达与突变

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中华实验外科杂志 2005年第3期22卷 305-306,i006页

作者：张常华何裕隆詹文华王方金汪建平蔡世荣黄美近中山大学附属第一医院胃肠胰外科广州510080 中山大学达安基因诊断中心

目的探讨抑癌基因p53与多发性结直肠癌的关系。方法实验组为同时多发性结直肠癌19个癌灶和结直肠再发癌12个癌灶,对照组为散发性结直肠癌17个癌灶。分别采用免疫组织化学抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合物(ABC)方法和单链DNA构像多态... 详细信息

目的探讨抑癌基因p53与多发性结直肠癌的关系。方法实验组为同时多发性结直肠癌19个癌灶和结直肠再发癌12个癌灶,对照组为散发性结直肠癌17个癌灶。分别采用免疫组织化学抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合物(ABC)方法和单链DNA构像多态性(pCRSSCp)方法对癌组织和癌旁正常组织进行p53蛋白以及p53基因第5、7、8外显子突变的检测,比较各组蛋白表达和基因突变的不同。结果在同时多发癌组、再发癌组以及对照组中p53蛋白阳性表达率分别为73.7%、75%、35.3%,3组比较差异有统计学意义(χ2=6.952,pp53基因突变率和蛋白表达高于散发性结直肠癌。p53过度表达的结直肠癌患者要警惕多发癌的发生。

关键词：多发性结直肠癌抑癌基因p53 突变表达多发癌再发组蛋白单链DNA 外显子

高危性人乳头瘤病毒与抑癌基因p53在膀胱癌中的表达

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中华泌尿外科杂志 1996年第4期17卷 196-198页

作者：王晖陈赐龄郭震华胡勤勇张炜严春寅苏州医学院附属第一医院泌尿外科

用ＰＣＲ法检测５２例膀胱癌组织中人高危性乳头瘤病毒（ＨＰＶ）ＤＮＡ，同时用免疫组化方法检测其Ｐ５３蛋白的过度表达，发现２８例（５３．８４％）ＨＰＶＤＮＡ阳性，１９例（３６．５４％）肿瘤细胞核Ｐ５３染色阳性，二者同时阳... 详细信息

用ＰＣＲ法检测５２例膀胱癌组织中人高危性乳头瘤病毒（ＨＰＶ）ＤＮＡ，同时用免疫组化方法检测其Ｐ５３蛋白的过度表达，发现２８例（５３．８４％）ＨＰＶＤＮＡ阳性，１９例（３６．５４％）肿瘤细胞核Ｐ５３染色阳性，二者同时阳性者３例（５．７７％）。ＨＰＶＤＮＡ阳性者多见于高分化、非侵袭性肿瘤中，相反Ｐ５３蛋白阳性则主要表现在低分化、侵袭性肿瘤中。ＨＰＶＤＮＡ和Ｐ５３的表达呈显著性负相关（ｒ＝－０．５７６９）。结果提示：ＨＰＶ感染或Ｐ５３的过度表达与膀胱肿瘤的生物学行为有关，并可将其作为膀胱肿瘤的预后评价指标。

关键词：膀胱肿瘤乳头瘤病毒基因表达抑癌基因p53

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抑癌基因p53与乳癌

医学综述 1996年第4期2卷 175-177页

作者：董永红吕荣林苏州医学院附一院 215006