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扩增曲线在分析PCR核酸检测无效原因及其过程改进中的作用

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中国输血杂志 2019年第7期32卷 644-649页

作者：刘正敏王瑞查祎孙婧胡京辉葛红卫北京市红十字血液中心

目的通过扩增曲线图形分析,判断PCR核酸检测无效结果的发生原因,以便及时采取纠正预防措施,降低无效检测率,提升核酸检测效率和质量。方法提取本实验室2017年11月—2018年6月期间Roche Cobas s201检测系统所有无效扩增的曲线。结合扩增... 详细信息

目的通过扩增曲线图形分析,判断PCR核酸检测无效结果的发生原因,以便及时采取纠正预防措施,降低无效检测率,提升核酸检测效率和质量。方法提取本实验室2017年11月—2018年6月期间Roche Cobas s201检测系统所有无效扩增的曲线。结合扩增曲线形态,综合环境、仪器归类并分析找出引起无效扩增的原因。依据Pareto图分析原则对引起无效扩增的主要因素采取相应干预措施,分析各类无效扩增在不同月份间产生无效扩增率,以评估采取相应干预措施是否有效。结果 1)无效扩增曲线归类:本实验室2017年11月—2018年6月PCR核酸检测无效扩增数为53个(0. 21%,53/25 752),按曲线的特征可将53个无效扩增曲线归为7类。Pareto图分析显示:锯齿状扩增曲线(64. 15%,34/53)、单独内参通道未扩增曲线(13. 21%,7/53)和靶标通道未扩增曲线(9. 43%,5/53)的累积百分数为86.70%,是引起无效扩增主要因素(A因素);HCV通道的异常扩增曲线(7. 55%,4/53)定义为B因素;四通道成'V'形状扩增曲线(1. 89%,1/53)、四通道扩增曲线整体抖动(1. 89%,1/53)、某通道起跳过早致Ct值较小扩增曲线(1. 89%,1/53)占比较小,定义为C因素。2)无效扩增曲线发生分布:A因素的锯齿状扩增曲线在2017年11月—2018年6月期间每个月均有不同程度发生,单独内参通道未扩增曲线主要集中在2017年12月、2018年3、5月;其它类型无效扩增曲线主要分布在2017年12月和2018年3月份。3)干预措施的效果:2017年12月中旬开始逐渐对A因素可人为干预的原因(如环境、设备)采取环境、设备维护等相应干预措施,总无效扩增率由2017年11月份0. 47%降低至2018年6月0. 03%。不同月份之间无效扩增率差异显著(χ~2=27. 02,P扩增率各月变化最为显著(χ~2=21. 91,P扩增的原因是多方位的。实验室可根据无效扩增曲线图形结合检测通道Ct值变化特点趋势,综合环境、仪器状态定位无效扩增原因。针对可以人为干预的因素,如环境因素、设备维护因素造成的无效扩增,制定相应干预措施以降低无效率;针对试剂性能变化产生的无效扩增,应制定质量监控措施以及时发现问题。

关键词： cobas s201 扩增曲线无效原因 Pareto图

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新型冠状病毒检测中几种扩增曲线的探讨

中国药物经济学 2021年第10期16卷 47-50,54页

作者：赵宝平魏卓超鞍山市疾病预防控制中心辽宁鞍山114009

目的对于新型冠状病毒核酸检测中发现的几种非特异性扩增曲线进行探讨,以供后续实验参考。方法参照《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案(第六版)》附件3《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中的方法,对鞍山市疾控中心某月收检... 详细信息

目的对于新型冠状病毒核酸检测中发现的几种非特异性扩增曲线进行探讨,以供后续实验参考。方法参照《新型冠状病毒感染的肺炎防控方案(第六版)》附件3《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》中的方法,对鞍山市疾控中心某月收检的标本进行新型冠状病毒核酸检测,回溯实验结果,发现存在的问题。结果 5月份共检验5 090份样本,结果均为阴性;试剂A、B的检测结果中出现了一定数量的N基因特异性扩增曲线及非特异性扩增曲线(特异性接近S形Ct值扩增曲线,非特异性为非S形Ct值扩增曲线),C、D试剂盒未发现相似问题;试剂A、B两种试剂盒检测结果中出现了少量的ORF1ab基因特异性扩增曲线及非特异性扩增曲线,曲线形状有平行线形、斜线形、翘尾形和不规则的形态,均使用了另外一种试剂盒复检,均为阴性;部分检测结果呈现出阳性对照扩增曲线不圆滑不标准呈现锯齿状的情况。结论无明显的S形扩增曲线且未检出Ct值,检测过程中出现N基因或ORF1ab非特异性扩增曲线及阳性对照扩增曲线异常呈锯齿状。

关键词：新型冠状病毒扩增曲线核酸检测实验室生物安全个人防护试剂盒质量控制

血液核酸筛查PCR异常扩增曲线的分析与处理

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中国输血杂志 2019年第7期32卷 696-699页

作者：陈雪刘胡敏王欢赵欣季茂胜董玉芳张蓝江成都市血液中心

目的分析血液核酸筛查PCR异常扩增曲线产生的原因,并采取相应的处理措施。方法统计分析本实验室2018年1—6月异常扩增曲线出现的频率和类型。结果本实验室核酸扩增检测无效率为0. 83%(71/8 522),由扩增曲线异常引起的结果无效率为0. 18%... 详细信息

目的分析血液核酸筛查PCR异常扩增曲线产生的原因,并采取相应的处理措施。方法统计分析本实验室2018年1—6月异常扩增曲线出现的频率和类型。结果本实验室核酸扩增检测无效率为0. 83%(71/8 522),由扩增曲线异常引起的结果无效率为0. 18%(16/8 522),约占检测无效率的22. 5%。其中扩增曲线受到抑制占比为75%,扩增曲线形状异常占比为25%。结论结合数据软件并人工复查核酸扩增曲线,对异常扩增曲线加以分析和处理,从而确保核酸检测结果的有效性和准确性。

关键词： PCR 扩增曲线

扩增曲线异常对荧光定量PCR检测乙肝病毒核酸的影响

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江西医学检验 2006年第3期24卷 257-257,222页

作者：郑晓群浙江省温州医学院附属二院检验科 325027

乙型肝炎病毒(HBV)DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义.实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)是目前测定HBV DNA较为简便、敏感和特异的方法[1].影响实时荧光PCR准确定量的因素很多,我们在对血清HBV DNA... 详细信息

乙型肝炎病毒(HBV)DNA准确定量对乙型肝炎病人的治疗监测和预后判断有重要的临床指导意义.实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)是目前测定HBV DNA较为简便、敏感和特异的方法[1].影响实时荧光PCR准确定量的因素很多,我们在对血清HBV DNA定量检测中发现个别标本的PCR扩增曲线荧光强度增加特别不明显且不规则(以下称'异常扩增曲线'),致检测结果明显偏低,对此我们进行了分析.

关键词：荧光定量PCR检测扩增曲线乙肝病毒核酸实时荧光定量聚合酶链反应 HBVDNA定量检测异常乙型肝炎病毒荧光PCR 临床指导预后判断

用于基因检测的微流控PCR荧光信号提取方法研究

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光电子．激光 2014年第6期25卷 1229-1236页

作者：赵树弥朱灵李阳朱灿灿李志刚张龙邓国庆王安刘勇中国科学院安徽光学精密机械研究所安徽省生物医学光学仪器工程技术研究中心安徽合肥230031 中科院皖江新兴产业技术发展中心安徽铜陵244000

针对微流控聚合酶链式反应(PCR)芯片荧光图像中反应腔识别与荧光信号提取的难题,提出了一种基于算法集成的微流控PCR芯片荧光信号提取方法。首先提取CCD图像中包含多个反应腔的目标区域,采用最小误差阈值分割法分离背景和反应腔,使用网... 详细信息

针对微流控聚合酶链式反应(PCR)芯片荧光图像中反应腔识别与荧光信号提取的难题,提出了一种基于算法集成的微流控PCR芯片荧光信号提取方法。首先提取CCD图像中包含多个反应腔的目标区域,采用最小误差阈值分割法分离背景和反应腔,使用网格划分法提取单个反应腔区域,通过小波变换和改进的Canny算子相结合的方法实现反应腔边缘识别。然后对每个反应腔的识别区域进行像素灰度值求和,计算均值来表征本次循环荧光信号的强度。以人工质粒PUC-18基因为检测对象,开展了反应条件相同的四腔微流控实时荧光PCR实验。结果表明,本文方法可快速有效识别PCR反应腔并实时提取每个反应腔的荧光信号,绘制的扩增曲线一致性好,避免了亮、暗斑的影响,提高了基因扩增分析的准确性。

关键词：实时荧光聚合酶链式反应(PCR) 微流控芯片基因检测荧光信号扩增曲线

新型冠状病毒在病理石蜡样本中检测方法的探索

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中华病理学杂志 2020年第4期49卷 354-357页

作者：许三鹏况东胡愉刘聪段亚琦王国平华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所武汉430030 华中科技大学同济医学院病理学系武汉430030

目的:探索使用病理石蜡样本检测新型冠状病毒的方法。方法:采用荧光定量PCR技术,使用新型冠状病毒核酸扩增试剂盒,检测临床确诊患者的肺组织病理石蜡样本1例,无病毒感染肺组织石蜡样本2例和正常人群咽拭子样本2例。建立检测体系,判读检... 详细信息

目的:探索使用病理石蜡样本检测新型冠状病毒的方法。方法:采用荧光定量PCR技术,使用新型冠状病毒核酸扩增试剂盒,检测临床确诊患者的肺组织病理石蜡样本1例,无病毒感染肺组织石蜡样本2例和正常人群咽拭子样本2例。建立检测体系,判读检测结果。结果:经过荧光定量PCR反应和信号采集,所有5例样本RNA内参HEX信号扩增曲线均有升起;临床确诊患者手术石蜡样本RNA FAM信号(N基因)扩增曲线升起(Ct值35.48),ROX信号(ORF1ab基因)曲线未升起。重复试验FAM信号扩增曲线升起(Ct值36.00),ROX信号曲线未升起。结合2次检测结果,该例患者病理石蜡样本新型冠状病毒阳性。同时作为对照的2例无感染病理石蜡组织样本和2例正常人群咽拭子样本病毒核酸检测均为阴性。结论:病理石蜡样本提取的总RNA可以满足新型冠状病毒检测的质量要求;根据新型冠状病毒检测指南建议设计和生产病毒核酸检测试剂盒可以满足病理石蜡样本检测的需要;使用所建荧光定量PCR检测体系,病理石蜡样本可以用于进行新型冠状病毒的核酸检测。

关键词：重复试验荧光定量PCR 病毒感染扩增曲线核酸检测 N基因检测体系石蜡

水稻低丰度表达基因OsAMT1;3实时荧光定量PCR方法的建立及其应用

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中国水稻科学 2006年第1期20卷 8-12页

作者：孙淑斌李宝珍胡江徐国华南京农业大学资源与环境科学学院江苏南京210095

采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异引物，对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1；3进行了转录水平上的定量分析，成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量... 详细信息

采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异引物，对水稻中的低丰度表达基因OsAMT1；3进行了转录水平上的定量分析，成功建立了可检测低丰度表达基因的SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性。获得的荧光定量PCR扩增曲线，基线平整，指数区明显，斜率大且固定；线性范围广，17～36个循环都能测出；稳定性、重复性好，变异系数仅为0．47％；标准曲线表明，循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系，可对基因表达进行相对定量；缺氮条件下OsAMT1；3与纯NH4^＋处理相比表达量增加4倍以上。

关键词：实时荧光定量PCR 扩增曲线标准曲线铵转运蛋白基因基因表达研究方法

不同抗性番茄叶片接种晚疫病后总RNA提取方法及实时荧光定量PCR比较

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云南农业大学学报（自然科学版） 2016年第3期31卷 421-426页

作者：莫云容鲍继艳王梓然左志梅朱海山吕俊恒赵凯云南农业大学园林园艺学院番茄辣椒研究室云南昆明650201

为筛选出适合番茄晚疫病接种材料总RNA的提取方法,本研究选取番茄感病5#自交系和抗病CLN2037E自交系正常生长和晚疫病接种的叶片为材料,比较Takara公司（货号）9109、9752Q、9769S和北京华越洋公司ZH120等4种RNA提取试剂盒。结果表明：... 详细信息

为筛选出适合番茄晚疫病接种材料总RNA的提取方法,本研究选取番茄感病5#自交系和抗病CLN2037E自交系正常生长和晚疫病接种的叶片为材料,比较Takara公司（货号）9109、9752Q、9769S和北京华越洋公司ZH120等4种RNA提取试剂盒。结果表明：方法 9109和ZH120均能获得较清晰的RNA电泳条带。ZH120提取RNA的OD260nm/OD280nm在1.92-2.08之间,得率在316.38-359.71μg/g之间,其他3种方法提取RNA的完整性和纯度均不高。四种方法提取的RNA均能通过反转录PCR克隆出番茄Actin和RPL2基因片段。以ZH120方法提取的RNA为模板时,基因RPL2实时荧光定量PCR的溶解曲线峰值单一,扩增曲线和Ct值重复性好,变异系数低。结果表明：ZH120试剂盒可作为番茄正常及晚疫病接种叶片RNA提取的适宜方法,并为后续基因克隆及表达谱分析等分子生物学研究提供高质量的RNA。

关键词：番茄晚疫病 RNA提取实时荧光定量PCR 溶解曲线扩增曲线

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实时荧光定量PCR技术的操作实践

实验室研究与探索 2011年第7期30卷 15-19页

作者：杨怡姝孙晓娜王小利沈思嗣李泽琳曾毅北京工业大学生命科学与生物工程学院北京100124

采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBRGreen I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合... 详细信息

采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBRGreen I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合熔解曲线、扩增曲线进行结果分析;强调了实验整体设计、引物设计与PCR反应体系的优化和内参的恰当选择在实时荧光定量PCR技术中的重要性。

关键词：荧光定量PCR SYBRGreenI 扩增曲线熔解曲线