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鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响

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中国畜牧兽医 2021年第11期48卷 4074-4083页

作者：侯乃鹏王煜陶聪王彦芳中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1(UCP1)基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据。用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度(0、... 详细信息

研究通过检测鞘磷脂对小鼠肌卫星细胞C2C12成肌分化的影响,旨在为阐明鞘磷脂对解偶联蛋白1(UCP1)基因敲入猪骨骼肌生长的影响提供理论依据。用ELISA法检测野生型猪和UCP1敲入猪背部肌肉及血清中总鞘磷脂含量;利用CCK8法检测不同浓度(0、5、20、50和100μg/mL)鞘磷脂对C2C12细胞增殖和毒性的影响,并通过形态学观察和分化前后细胞成肌分化标记基因生肌因子5(Myf5)、生肌决定因子(MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin)、生肌调节因子4(MRF4)的表达检测,建立C2C12成肌分化体系;在成肌分化培养基中添加上述不同浓度的鞘磷脂,诱导分化6 d后,通过形态学和Myogenin免疫荧光染色观察肌管的形成及成肌分化标记基因的mRNA表达水平检测,确定鞘磷脂的最佳添加浓度。用筛选出的最佳鞘磷脂添加浓度诱导细胞成肌分化,在2、4和6 d收集细胞,利用实时荧光定量PCR检测周期蛋白相关基因CyclinD1、CyclinE、CDK2和CDK4的表达水平,CCK8法检测诱导2 d细胞的活力。结果发现,与野生型猪相比,UCP1-KI猪背部肌肉组织中总鞘磷脂含量显著增加(P0.05);不同浓度鞘磷脂对未分化C2C12细胞的增殖无显著影响(P>0.05);成肌分化6 d后,C2C12细胞形成明显的肌管,成肌分化标记基因Myf5、MyoD、Myogenin、MRF4的mRNA和蛋白水平均极显著上调(P肌管形成,Myogenin阳性信号和肌管融合指数均显著增加(P分化,在分化2 d时,处理组CyclinE、CDK4基因表达量显著高于对照组(P分化6 d后,处理组CyclinD1、CyclinE、CDK2、CDK4基因表达量均显著低于对照组(P肌卫星细胞C2C12分化早期细胞活力和成肌分化效率,可为研究鞘磷脂对骨骼肌生长的影响提供一定的参考。

关键词：鞘磷脂 C2C12细胞成肌分化

RNA甲基化转移酶METTL3对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响

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中国畜牧兽医 2023年第3期50卷 1025-1036页

作者：甄珍王梅王轶敏胡德宝张林林李新郭益文郭宏丁向彬天津农学院动物科学与动物医学学院天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室天津300384

【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实... 详细信息

【目的】探究RNA甲基化转移酶样3(methyltransferase-like 3,METTL3)对牛骨骼肌卫星细胞(bovine skeletal muscle satellite cells,BSMSCs)增殖和成肌分化的影响。【方法】利用体外诱导BSMSCs分化模型模拟牛骨骼肌生长发育过程,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测METTL3在BSMSCs分化前后mRNA和蛋白表达水平的差异。设计合成METTL3干扰RNA(si-METTL3),且构建METTL3的过表达载体pcDNA3.1-METTL3,分别转染至BSMSCs中,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测转染效果和BSMSCs增殖标志因子盒转录家族成员7(paired box 7,Pax7)的表达情况,EdU检测细胞增殖情况。将转染si-METTL3和pcDNA3.1-METTL3的BSMSCs进行体外诱导分化,通过光学显微镜观察BSMSCs进入分化期的细胞形态,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测BSMSCs分化标志因子肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)、肌细胞生成素(myogenin,MyoG)的表达情况。通过比色法检测干扰或过表达METTL3后,BSMSCs不同时期的m 6 A RNA甲基化水平。【结果】BSMSCs分化后METTL3蛋白表达水平极显著高于增殖期(P0.05),EdU阳性细胞率与对照组相比均无显著差异(P>0.05);干扰METTL3后,细胞肌管数量明显增多,肌管直径明显增大,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著升高(P分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著下调(P肌管数量明显减少,肌管直径明显变小,MyHC的mRNA和蛋白表达水平极显著降低(P分化期的m 6 A RNA甲基化水平均极显著上升(P成肌分化过程具有调控作用,并影响BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。干扰METTL3可以促进BSMSCs的成肌分化进程,降低BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平;而过表达METTL3会抑制BSMSCs的分化,提高BSMSCs的m 6 A RNA甲基化水平。试验结果为进一步探明METTL3在牛肌肉发育中的调控机制奠定了基础。

关键词：牛 METTL3 骨骼肌卫星细胞(BSMSCs) 细胞增殖成肌分化

MyoD、Myf6和Mef2c慢病毒过表达载体构建及诱导猪MSC成肌向分化的研究

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中国饲料 2012年第13期 26-29,32页

作者：宋奇纪元高飞武蓉王罡琦周焱唐小春吉林大学畜牧兽医学院

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是重要的成体干细胞,具有多向分化的能力,其成肌分化能力在医学上有广泛的应用,可用于多种疾病的治疗。成肌决定因子(MyoD)和成肌调节因子6(Myf6)同属生肌决定因子基因家族,控制着肌细胞... 详细信息

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是重要的成体干细胞,具有多向分化的能力,其成肌分化能力在医学上有广泛的应用,可用于多种疾病的治疗。成肌决定因子(MyoD)和成肌调节因子6(Myf6)同属生肌决定因子基因家族,控制着肌细胞的增殖分化,肌细胞增强因子(Mef2c)是一个具有重要功能的转录因子,可以作为心肌分化过程中的特异性标志。本试验通过构建猪MyoD、Myf6和Mef2c慢病毒表达载体,并在体外感染猪间充质干细胞(pMSC),成功在pMSC中过表达MyoD、Myf6和Mef2c三种调节因子,并且诱导MSC表达肌细胞生成素(MyoG)、肌肉特异型肌酸激酶(CKM)等重要的成肌相关因子。本研究为利用慢病毒过表达成肌相关因子诱导MSC细胞向成肌细胞分化奠定基础,为进一步探明MSC向成肌细胞分化的分子机制提供发新思路。

关键词： MyoD Myf6 Mef2c 慢病毒骨髓间充质干细胞成肌分化

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VD3调控乳酸代谢影响成肌分化的研究

VD3调控乳酸代谢影响成肌分化的研究

作者：胡媛媛陕西理工大学

学位级别：硕士

维生素D（Vitamin D,VD）的活性形式为1,25-二羟基-维生素D(1,25（OH）D)。研究证实,VD在肌肉生长以及运动后肌肉恢复等过程中发挥着重要作用。乳酸是运动过程中骨骼肌细胞糖酵解的代谢产物,可作为信号分子,协调不同细胞、组织和器官之... 详细信息

维生素D（Vitamin D,VD）的活性形式为1,25-二羟基-维生素D(1,25（OH）D)。研究证实,VD在肌肉生长以及运动后肌肉恢复等过程中发挥着重要作用。乳酸是运动过程中骨骼肌细胞糖酵解的代谢产物,可作为信号分子,协调不同细胞、组织和器官之间的信号传导,其对骨骼肌生长发育的影响有待进一步研究。有研究发现,剧烈运动后补充VD能够减少骨骼肌中乳酸堆积,缓解肌肉疲劳。但是,在骨骼肌中VD与乳酸代谢的关系及其对成肌分化的影响机制尚不清楚。因此,本研究首先通过构建运动小鼠模型,探究VD对运动小鼠骨骼肌中乳酸代谢的影响;然后,以小鼠成肌细胞C2C12为研究对象,进一步探究VD调控乳酸代谢的分子机制以及乳酸在成肌分化过程中的作用。主要取得以下研究结果:1.基于构建的运动小鼠模型,分析了运动6周后,VD处理对小鼠体重、耐力、乳酸代谢和骨骼肌生成的影响。研究发现,VD能够提升运动造成的体重减少,进一步提高运动小鼠的耐力,降低运动小鼠血清和肌肉中乳酸的含量以及蛋白质乳酸化修饰水平。另外,VD抑制了运动小鼠骨骼肌中LDHA的表达,上调运动小鼠肌肉中成肌因子MyoD、MyoG、MYH3和MYH7的表达,促进骨骼肌生成。2.通过JASPR软件预测发现LDHA启动子区存在一个VDR结合位点,双荧光素酶报告实验发现VDR可能对LDHA具有负调控作用。C2C12细胞中LDHA的时序表达分析发现,LDHA在增殖和分化期均稳定表达,在分化中后期表达量呈上升趋势。VD能够抑制C2C12细胞LDHA的表达,进而减少成肌细胞中的乳酸含量,使细胞培养基中的乳酸水平低于正常值（3 mmol/L）。乳酸化修饰分析实验也发现VD降低了细胞的蛋白质乳酸化修饰水平。3.乳酸钠添加实验发现,乳酸钠可使C2C12细胞培养基中乳酸含量高于正常水平（3 mmol/L）,上调成肌因子MyoD、MyoG、MYH3、MYH7的表达,说明适量提升细胞中乳酸含量,可促进C2C12细胞成肌分化。本研究同时也分析了VD处理对C2C12细胞成肌分化的影响,发现成肌因子MyoD表达上调,MyoG和MYH7表达下调,表明VD可促进C2C12细胞早期成肌分化的发生,但对于肌纤维的成熟发育有一定的抑制作用。综上所述,本研究证实VD可通过抑制LDHA的表达减少组织和细胞中的乳酸合成,从而影响成肌分化和肌肉生成。同时也发现,乳酸对成肌分化的影响,会因细胞或者组织中的乳酸水平存在较大的差异。

关键词： VD3 LDHA 乳酸骨骼肌成肌分化

补肾健脾方增加成肌分化表达促进去睾丸小鼠骨质疏松性骨折愈合的实验研究

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中国中医骨伤科杂志 2024年第9期32卷 1-5页

作者：廖文英邱丽玲张伟强赵永见高翔唐德志瑞金市人民医院复旦大学附属华东医院上海中医药大学附属龙华医院

目的:研究补肾健脾方对去睾丸小鼠骨质疏松性骨折愈合的疗效，探讨“先后天之本”“肾脾相关”“骨肉不相亲”等中医理论在骨质疏松性骨折防治中的应用。方法:按照体重并采用随机方法将30只雄性C57BL/6小鼠分为对照组和补肾健脾方组，... 详细信息

目的:研究补肾健脾方对去睾丸小鼠骨质疏松性骨折愈合的疗效，探讨“先后天之本”“肾脾相关”“骨肉不相亲”等中医理论在骨质疏松性骨折防治中的应用。方法:按照体重并采用随机方法将30只雄性C57BL/6小鼠分为对照组和补肾健脾方组，每组各15只；补肾健脾方组给予补肾健脾方灌胃，对照组给予生理盐水灌胃。两组制备去睾丸小鼠骨质疏松性骨折模型，于骨折术后第2天分别给予相应药物灌胃治疗，连续灌胃28 d,隔天1次，治疗结束后处死小鼠并取材，进行影像学观察、病理组织学染色以及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)方法检测MyoD1、MEF2C、Myf5及Myogenin的表达量。结果:微型CT结果显示，补肾健脾方可促进骨痂形成及加速骨折愈合；比目鱼肌苏木精-伊红(HE)染色结果显示，与对照组比较，补肾健脾方组肌纤维排列紧密，肌细胞较多。RT-PCR和Western Blot结果发现，与对照组比较，补肾健脾方组胫骨后肌MyoD1、MEF2C、Myf5及Myogenin等成肌分化基因和蛋白表达量均较高，且差异都有统计学意义(P肌内MyoD1、MEF2C、Myf5及Myogenin的表达有关。

关键词：骨质疏松去睾丸骨质疏松性骨折补肾健脾方成肌分化中医药疗法

姜黄素对成肌分化和肌肉再生过程中Wnt5a信号通路及成肌调节因子的影响

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姜黄素对成肌分化和肌肉再生过程中Wnt5a信号通路及成肌调节因子...

作者：杨佳明赣南医学院

学位级别：硕士

背景:骨骼肌损伤是体育运动中最常见的运动损伤之一,如果没有进行有效的康复治疗,可能会使骨骼肌修复延迟,甚至导致累积性损伤。一方面,姜黄素是一种天然的多酚类化合物,被发现能促进损伤骨骼肌的修复和再生。另一方面,研究显示Wnt信号... 详细信息

背景:骨骼肌损伤是体育运动中最常见的运动损伤之一,如果没有进行有效的康复治疗,可能会使骨骼肌修复延迟,甚至导致累积性损伤。一方面,姜黄素是一种天然的多酚类化合物,被发现能促进损伤骨骼肌的修复和再生。另一方面,研究显示Wnt信号通路与细胞的增殖和发育有着密切的联系。目的:本研究欲初步探索C2C12细胞成肌分化和小鼠骨骼肌损伤后再生过程中的分子机制,揭示姜黄素在成肌分化和肌肉再生中的作用以及姜黄素对成肌分化和肌肉再生分子机制的影响。方法:细胞实验:首先,在常规培养基中添加马血清以诱导C2C12成肌细胞分化6天,使用Western blot、RT-q PCR和免疫荧光技术观察分化过程中Wnt5a、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达变化。其次,构建Wnt5a过表达和低表达的C2C12细胞模型,观察Wnt5a在成肌分化中的作用。再次,在Wnt5a过表达或低表达的基础上,添加Ca抑制剂或激动剂,以探讨Ca通道开放或关闭对Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myf5、Myogenin和MHC的影响。然后,使用姜黄素对C2C12成肌细胞干预24小时,观察姜黄素对Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC表达的影响,同时使用荧光显微镜检测姜黄素干预对C2C12成肌细胞分化过程中Ca浓度的影响。最后,在姜黄素干预的基础上对Wnt5a进行敲低和过表达,观察Wnt5a对姜黄素干预效果的影响。动物实验:首先,在C57BL/6小鼠胫骨前肌处注射心脏毒素,构建骨骼肌损伤修复模型,观察建模后第1～21天中Wnt5a、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC在肌肉再生中的表达变化;同时通过HE染色观察骨骼肌损伤修复过程中的组织形态变化。其次,通过敲除Wnt5a基因构建Wnt5a突变小鼠模型,观察突变小鼠体内Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC表达的变化。然后,使用姜黄素灌喂小鼠14天,观察姜黄素对Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC表达的影响。最后,构建Wnt5a突变小鼠骨骼肌损伤模型并灌喂姜黄素,观察其与野生型小鼠相比,骨骼肌中Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达变化。结果:细胞实验:第一,在C2C12细胞成肌分化的0～6天中,Wnt5a、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC均呈现先升高后降低的表达趋势。第二,Wnt5a过表达后,C2C12成肌细胞中Wnt5a、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达量较马血清组升高;相反,Wnt5a低表达后,Wnt5a、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达量显著下降。第三,Wnt5a过表达后,细胞内的Ca浓度显著增加,在此基础上添加Ca抑制剂可明显降低Ca水平并减少Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myf5、Myogenin和MHC的表达;相反,Wnt5a低表达后,细胞内Ca浓度明显降低,在此基础上添加Ca激动剂可明显提高Ca水平并增加Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myf5、Myogenin和MHC的表达。第四,姜黄素干预后,C2C12成肌细胞中Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达量较马血清组明显增加。第五,在姜黄素干预的基础上敲低Wnt5a后,Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达明显下降;相反,在姜黄素干预的基础上过表达Wnt5a,可使它们的表达进一步增加。动物实验:第一,在小鼠骨骼肌损伤修复的1～21天中,Wnt5a、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达也呈现先升高后降低的趋势。HE染色结果显示,CTX注射后的第1～3天肌肉组织炎性细胞浸润逐渐加重,损伤区域细胞的形态发生改变,细胞失去规则排列;CTX注射后的第7～21天,炎性细胞浸润逐渐减少,细胞核向细胞中央移动,肌纤维重新恢复规则排列。第二,与野生型小鼠相比,在Wnt5a基因敲除小鼠中,Wnt5a没有表达,Myo D、Myogenin和Myf5表达显著下降,Ca N和NFAT2有下降趋势但差异不显著。第三,姜黄素灌喂1～14天后,小鼠骨骼肌中Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达较模型组明显升高。第四,对于突变型小鼠而言,无论是模型组还是姜黄素组的Wnt5a、Ca N、NFAT2、Myo D、Myogenin、Myf5和MHC的表达量,均比野生型小鼠的表达量要少得多。结论:本研究结果表明,Wnt5a/Ca/Ca N/NFAT2信号通路

关键词：姜黄素肌肉再生成肌分化 Wnt5a信号通路分子机制

山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化

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中国农业科学 2018年第8期51卷 1590-1597页

作者：睢梦华郑琪吴昊丁建平刘勇李文雍储明星张子军凌英会安徽农业大学动物科技学院/安徽地方畜禽遗传资源保护与生物育种省级实验室阜阳师范学院胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消... 详细信息

【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基(20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素)培养于37℃、5%CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、Myo D1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基(2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素),诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成c DNA后,利用q PCR测定Myo D1和Myog的相对表达量。【结果】分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和Myo D1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,q PCR结果显示,标志基因Myo D1和Myog均有表达,且Myo D1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。

关键词：山羊胎儿肌肉干细胞分离培养鉴定成肌分化

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间充质干细胞促进肌肉组织修复的应用前景

中国组织工程研究 2024年第1期28卷 107-112页

作者：黄勇彬王涛娄园一庞景群陈光华广东医科大学广东省湛江市524000 广东医科大学附属医院骨科中心广东省湛江市524000

背景:间充质干细胞是从骨髓、脂肪、脐带等多种组织中分离出来的多能基质细胞,可分化成不同的细胞类型,并分泌多种具有治疗潜能的蛋白,在肌肉组织修复中有良好的应用前景。目的:综述间充质干细胞促进肌肉组织修复的研究进展,为进一步临... 详细信息

背景:间充质干细胞是从骨髓、脂肪、脐带等多种组织中分离出来的多能基质细胞,可分化成不同的细胞类型,并分泌多种具有治疗潜能的蛋白,在肌肉组织修复中有良好的应用前景。目的:综述间充质干细胞促进肌肉组织修复的研究进展,为进一步临床应用提供理论依据。方法:检索中国知网、维普、万方、PubMed、Embase及Web of Science数据库从建库至2022年相关文献,检索词为“间充质干细胞,肌肉组织,肌肉损伤,肌肉萎缩,外泌体,支架”和“mesenchymal stem cells,muscle tissue,muscle injury,muscle atrophy,exosomes,scaffolds”。筛选间充质干细胞促进肌纤维增殖修复的文献,共纳入98篇文献进行综述分析。结果与结论:①间充质干细胞促进肌纤维增殖修复的相关机制复杂,多以抗炎、抑制间质纤维化、抑制脂肪形成等方式促进肌纤维增殖修复;②基于间充质干细胞的相关生物支架、细胞共培养等可明显弥补间充质干细胞定植后存活率低的缺点;③当前间充质干细胞疗法仍有明显的局限性,未来间充质干细胞联合其他治疗方式应当成为主要的发展趋势。

关键词：间充质干细胞肌肉组织肌肉损伤肌肉萎缩旁分泌作用成肌分化外泌体支架

过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化

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中国农业科学 2013年第14期46卷 3032-3039页

作者：李伟郑蒙蒙张亚妮朱才业邱峰龙韦光辉李碧春扬州大学动物科学与技术学院

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强... 详细信息

【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白(ehanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTMLTX转染山羊胎儿成纤维细胞(goat embryonic fibroblast,GEF)以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1的开放阅读框(ORF)两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418(400μ***-1)筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。

关键词： MyoD1基因基因克隆异位表达成肌分化