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微小牛蜱磷酸丙糖异构酶基因片段的克隆与原核表达

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第4期30卷 331-332页

作者：梁怡琳高攀柯泽楷罗新萍刘志刚深圳大学过敏反应与免疫学研究所深圳518060

为克隆和表达微小牛蜱磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,Tim)编码基因,提取微小牛蜱成虫总RNA,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其连入pMD-18T载体,经酶切和测序鉴定后,将正确的目的基因与pET-28a表达载体连接,并转入大肠埃希菌(... 详细信息

为克隆和表达微小牛蜱磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase,Tim)编码基因,提取微小牛蜱成虫总RNA,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其连入pMD-18T载体,经酶切和测序鉴定后,将正确的目的基因与pET-28a表达载体连接,并转入大肠埃希菌(***)Rosetta(DE3)中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定分析。结果发现,克隆所得的微小牛蜱成虫tim基因片段长度为750bp(登录号为JX112888),其中开放阅读框为750 bp,编码249个氨基酸,与微小牛蜱胚胎中克隆出的tim基因序列的同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Tim相对分子质量(Mr)约为27 000。

关键词：微小牛蜱磷酸丙糖异构酶克隆表达

微小牛蜱Bm86基因的原核表达与表达条件的优化

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第6期27卷 531-533页

作者：马米玲关贵全李有全刘爱红任巧云牛庆丽殷宏罗建勋家畜疫病病原生物国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046

根据微小牛蜱Bm86基因序列设计引物,在重组质粒pMD18-T-Bm86中克隆,并将其定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同时间进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯... 详细信息

根据微小牛蜱Bm86基因序列设计引物,在重组质粒pMD18-T-Bm86中克隆,并将其定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同时间进行诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,37℃条件下经1mmol/LIPTG诱导8h后,目的重组蛋白表达量最大,表达相对分子质量(Mr)约为94000的包涵体蛋白,与预期大小一致,目的蛋白约占蛋白总量的29%。蛋白质印迹(Western blotting)分析表明,该重组蛋白可被兔抗微小牛蜱全蜱阳性血清所识别。

关键词：微小牛蜱 Bm86基因表达

微小牛蜱Bm91基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

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中国兽医科学 2008年第7期38卷 569-575页

作者：王玙罗建勋马米玲关贵全李有全刘爱红任巧云刘军龙殷宏中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bm91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoRⅠ酶... 详细信息

从我国半饱血微小牛蜱雌性成蜱肠道和唾液腺中提取总RNA;参照GenBank中已发表的微小牛蜱Bm91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用RT-PCR技术扩增Bm91基因,测序正确后将其亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的EcoRⅠ酶切位点,构建重组表达载体pPIC9K-Bm91。再次测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化,电转化毕赤酵母GS115并经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,Bm91基因获得了成功表达,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的83ku的重组Bm91蛋白。

关键词：微小牛蜱 Bm91基因分泌表达

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微小牛蜱Bm86基因的真核表达

中国兽医科技 2005年第9期35卷 718-722页

作者：李文卉罗建勋殷宏关贵全马米玲刘志杰刘爱红党志胜高金亮任巧云中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经G418抗性筛选... 详细信息

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因,将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86,测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌GS115,经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68 ku重组Bm86蛋白,目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32%以上,诱导96 h目的蛋白的表达量为0.36 mg/mL。

关键词：微小牛蜱 Bm86基因毕赤酵母真核表达

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微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析

畜牧兽医学报 2005年第1期36卷 66-69页

作者：白霞周金林程天印周勇志刘毅中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所上海200232 湖南农业大学动物科技学院长沙410128

从微小牛蜱克隆到1个新的铁蛋白编码基因,cDNA全长642bp,编码区为123 639bp,编码172个氨基酸残基,该蛋白预测的分子量为19 9ku,等电点为4 24。经过分析,其预测氨基酸序列与已报道的变异革蜱、非洲钝缘蜱和蓖子硬蜱铁蛋白同源性分别为93 ... 详细信息

从微小牛蜱克隆到1个新的铁蛋白编码基因,cDNA全长642bp,编码区为123 639bp,编码172个氨基酸残基,该蛋白预测的分子量为19 9ku,等电点为4 24。经过分析,其预测氨基酸序列与已报道的变异革蜱、非洲钝缘蜱和蓖子硬蜱铁蛋白同源性分别为93 60%、88 37%和83 72%。且核苷酸序列在mRNA5′未翻译区(5′UTR)的茎环结构存在铁应答元件(IRE),其氨基酸序列上带有典型的亚铁氧化酶中心结构的保守序列。RT PCR分析表明,该基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半饱血雌蜱、饱血雌蜱和雄蜱这几个阶段均有表达。

关键词：铁蛋白编码基因微小牛蜱克隆表达编码区氨基酸序列硬蜱保守序列 RT-PCR分析

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微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库的构建

中国兽医科技 2005年第12期35卷 994-996页

作者：李文卉罗建勋殷宏高金亮关贵全刘志杰党志胜马米玲刘爱红任巧云中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREE... 详细信息

为了研究微小牛蜱功能性抗原基因,从微小牛蜱(Boophilus microplus)幼蜱中提取总RNA并分离纯化mRNA。采用Oligo(dT)引物合成双链cDNA,在其两端加EcoRⅠ、HindⅢ定向接头,用Mini Column Fractionation凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体。经体外包装,成功构建了我国微小牛蜱幼蜱cDNA表达文库,铺板测定原始库容量为4.5×105PFU,扩增后的滴度为7.2×1010PFU/mL。

关键词：微小牛蜱 cDNA表达文库抗原基因

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微小牛蜱一个抗菌多肽编码基因的克隆和表达

中国预防兽医学报 2005年第2期27卷 134-138页

作者：白霞周金林程天印周勇志龚海燕中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所上海200232 湖南农业大学动物科技学院湖南长沙410128

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究 ,本研究根据微小牛蜱巴西株报道的一种抗菌多肽核苷酸序列设计引物 ,从微小牛蜱中国安徽株克隆到该抗菌多肽基因 ,全长 383bp ,编码 110个氨基酸残基 ,该蛋白预测的分子量为 12 2ku ,等电点为 4 87。... 详细信息

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究 ,本研究根据微小牛蜱巴西株报道的一种抗菌多肽核苷酸序列设计引物 ,从微小牛蜱中国安徽株克隆到该抗菌多肽基因 ,全长 383bp ,编码 110个氨基酸残基 ,该蛋白预测的分子量为 12 2ku ,等电点为 4 87。经同源性比较 ,该微小牛蜱巴西株抗菌多肽基因有 10 0 %的相同性。经RT_PCR分析表明 ,该基因在微小牛蜱卵、幼蜱、半饱血雌蜱、饱血雌蜱和雄蜱这几个阶段均有表达。将该基因亚克隆到 pET_2 8a(+)表达载体 ,转化BL2 1(DE3)宿主菌 ,经IPTG诱导 ,可成功表达。重组融合蛋白大小为 15ku左右 ,与预期大小一致。初步体外抗菌试验表明 ,重组蛋白具有一定的抗菌活性。Western_blot显示。

关键词：微小牛蜱抗菌多肽 cDNA克隆重组表达

微小牛蜱Bm86基因的克隆及真核表达载体的构建

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中国兽医科技 2005年第2期35卷 124-128页

作者：李文卉罗建勋刘磊党志胜高金亮关贵全刘志杰刘爱红马米玲任巧云殷宏甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃兰州730046

为了克隆微小牛蜱Bm86 基因及构建该基因的表达载体,以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板,参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列,设计了1对引物,采用RT-PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因;将Bm86基因克隆入载体,并进行序列分析... 详细信息

为了克隆微小牛蜱Bm86 基因及构建该基因的表达载体,以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板,参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列,设计了1对引物,采用RT-PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因;将Bm86基因克隆入载体,并进行序列分析,结果证明,克隆的Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因序列的同源性达97.4%,而且该序列包含完整的开放阅读框。将该基因克隆入真核表达载体 pPIC9K,构建并获得了重组真核表达载体pPIC9K-Bm86。

关键词：微小牛蜱 Bm86基因克隆重组表达载体

微小牛蜱雌蜱唾液腺消减cDNA文库的构建与分析

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中国兽医科学 2010年第5期40卷 441-445页

作者：杨朝霞关贵全马米玲刘军龙殷宏罗建勋中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

以我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺cDNA为检测子Tester）,饥饿雌性成蜱cDNA为驱动子（Driver）,采用抑制消减杂交技术和T/A克隆技术构建了微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺消减cDNA文库。对获得的158个阳性克隆进行PCR鉴定,显示插入片段... 详细信息

以我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺cDNA为检测子Tester）,饥饿雌性成蜱cDNA为驱动子（Driver）,采用抑制消减杂交技术和T/A克隆技术构建了微小牛蜱半饱血雌性成蜱唾液腺消减cDNA文库。对获得的158个阳性克隆进行PCR鉴定,显示插入片段主要集中在200-550bp之间,挑取60个阳性克隆进行测序,共获得了14个有效ESTs,生物信息学分析推测,它们所编码的功能性蛋白包括卵黄蛋白原、基质蛋白、富含脯氨酸蛋白质、OTM-3假定蛋白等。根据基因序列设计引物,以微小牛蜱DNA为模板,对所得ESTs进行鉴定,证明它们都是微小牛蜱所固有的。该项工作为进一步研究微小牛蜱唾液腺差异表达基因奠定了基础。

关键词：微小牛蜱抑制消减杂交表达序列标签序列分析