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微小毛霉发酵制取凝乳酶的培养基优化研究

食品工业科技 2011年第9期32卷 214-216,219页

作者：张丽红王昕朴姍善郑丽杨贞耐吉林大学生物与农业工程学院吉林长春130024 中国农业科技东北创新中心农产品加工研究中心吉林长春130033

利用响应面分析法优化微小毛霉的发酵培养基,提高微小毛霉凝乳酶的凝乳活力。在单因素实验的基础上,用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析,建立了3种因素与凝乳酶活力之间的函数关系,得出在基础发酵培养基中加入的氯化钙、乳... 详细信息

利用响应面分析法优化微小毛霉的发酵培养基,提高微小毛霉凝乳酶的凝乳活力。在单因素实验的基础上,用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析,建立了3种因素与凝乳酶活力之间的函数关系,得出在基础发酵培养基中加入的氯化钙、乳清粉和葡萄糖的最佳浓度分别为0.58%、0.64%和1.13%,此时,微小毛霉凝乳酶的凝乳活力的理论值为1150.81SU/mL,验证平均值为1109.7SU/mL,与预测值基本一致。

关键词：凝乳酶微小毛霉发酵培养基优化

微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中的表达条件及其酶学特性研究

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食品科技 2010年第11期35卷 2-6页

作者：张丽红王景会王昕郑丽杨贞耐吉林大学生物与农业工程学院长春130025 中国农业科技东北创新中心农产品加工研究中心长春130033

在实验室成功构建的表达凝乳酶的重组巴斯德毕赤酵母GSl15/pPIC9KG4-3-35的基础上,对其表达外源蛋白的发酵条件进行了研究。经过单因素实验研究表明,培养基发酵产酶的最佳条件为:每隔12 h补加一次浓度为1.3%的甲醇、诱导时间为96 h;诱... 详细信息

在实验室成功构建的表达凝乳酶的重组巴斯德毕赤酵母GSl15/pPIC9KG4-3-35的基础上,对其表达外源蛋白的发酵条件进行了研究。经过单因素实验研究表明,培养基发酵产酶的最佳条件为:每隔12 h补加一次浓度为1.3%的甲醇、诱导时间为96 h;诱导过程中是否更换培养基对外源蛋白表达影响不大,重组菌的最佳初始诱导菌浓度为2.0 OD600/mL。对酶的酶学特性的研究结果表明,该酶作用的最适温度和最适pH分别为55℃和5.5。在50℃处理30 min和55℃处理10 min的条件下酶的活性完全丧失,重组凝乳酶的对热不稳定性的特性有利于干酪生产工艺中对乳清处理的要求。该酶在pH6.0时最稳定。金属离子中,Ca2+和Na+对酶凝乳有促进作用,而Mg2+、K+和Cu+则对酶凝乳有抑制作用。

关键词：微小毛霉重组凝乳酶优化酶学特性

微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达

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中国农学通报 2010年第2期26卷 64-67页

作者：吴建勇黄华磊重庆医科大学生命科学研究院重庆400016 重庆市农科院特色作物研究所重庆402160

微小毛霉(***)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证... 详细信息

微小毛霉(***)Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与表达。以一株产γ-亚麻酸的微小毛霉为材料,通过PCR方法克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因,构建重组的酵母表达载体pYMpD6D,将重组载体通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中,并利用酵母表达系统证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。通过GC分析,γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53%,微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达。此试验为进一步研究Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。

关键词： γ-亚麻酸微小毛霉 Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因酿酒酵母

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微小毛霉凝乳酶基因的克隆与表达

中国乳品工业 2010年第2期38卷 7-9页

作者：姜媛媛王景会李玉秋李达杨贞耐中国农业科技东北创新中心农产品加工研究中心长春130124

微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶是微生物凝乳酶的主要来源之一,但与传统的牛凝乳酶比较具有一定的缺陷。为将其采用基因工程的方法进行改造获得理想的凝乳酶,本研究克隆到微小毛霉凝乳酶基因,将其插入原核表达载体pTWlN1中,使之与几丁... 详细信息

微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶是微生物凝乳酶的主要来源之一,但与传统的牛凝乳酶比较具有一定的缺陷。为将其采用基因工程的方法进行改造获得理想的凝乳酶,本研究克隆到微小毛霉凝乳酶基因,将其插入原核表达载体pTWlN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/M。转化大肠杆菌BL21(DE3),后经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析,获得了重组蛋白。

关键词：微小毛霉克隆表达

微小毛霉凝乳酶及其重组酶的产酶条件和酶学特性的研究

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微小毛霉凝乳酶及其重组酶的产酶条件和酶学特性的研究

作者：张丽红吉林大学

学位级别：硕士

干酪是一种营养、方便,风味独特的奶制品,目前我国干酪生产所需的凝乳剂即凝乳酶仍以进口为主,酶价格较高。研制和生产我国自有技术的凝乳酶产品对于促进我国乳品工业的发展具有重大的现实意义。本文是国家高技术研究发展计划(863计划)... 详细信息

干酪是一种营养、方便,风味独特的奶制品,目前我国干酪生产所需的凝乳剂即凝乳酶仍以进口为主,酶价格较高。研制和生产我国自有技术的凝乳酶产品对于促进我国乳品工业的发展具有重大的现实意义。本文是国家高技术研究发展计划(863计划)(编号:2006AA10Z306)“干酪加工专用真菌凝乳酶的分子改造及其生物工程酶制剂研制”的子课题《凝乳酶理化特性及应用》的部分内容,主要内容包括:探讨了微小毛霉发酵产酶的工艺条件,在基础培养基的基础上,通过单因素试验探讨了碳源、氮源、无机盐等各种营养条件对微小毛霉产凝乳酶的影响,并结合了响应面分析法确定了最适产酶的培养基的组成。同时考查了通气量、接种量等条件对产酶的影响,确定了最适产酶的培养条件。选取了甲醇诱导时间、甲醇添加量、诱导过程中更换培养基、重组菌的最佳初始诱导生长期不同等因素进行单因素摇瓶试验,对巴斯德毕赤酵母发酵生产重组凝乳酶的发酵条件进行了优化。探讨了微小毛霉凝乳酶及其重组凝乳酶作用的最适温度、热稳定性、最适pH值、pH的稳定性以及金属离子对两种酶酶活的影响等酶学特性进行了研究。

关键词：微小毛霉优化重组凝乳酶酶学特性

微小毛霉（***）△6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与功能研究

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作者：吴建勇西南大学

学位级别：硕士

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)对于维持生物体的细胞膜结构、正常代谢和信号传导等具有重要的作用。γ-亚麻酸(γ-linolcnic acid，GLA)是人体必需的一种多不饱和脂肪酸，GLA可转化成长链多不饱和脂肪酸(LCPUFAs... 详细信息

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)对于维持生物体的细胞膜结构、正常代谢和信号传导等具有重要的作用。γ-亚麻酸(γ-linolcnic acid，GLA)是人体必需的一种多不饱和脂肪酸，GLA可转化成长链多不饱和脂肪酸(LCPUFAs)，这些LCPUFAs是前列腺素、环前列腺素和白三烯类等具有强烈生理活性的物质的前体。研究证实，高血脂、糖尿病、动脉硬化、癌症、早衰等疾病，都与缺乏这些必需脂肪酸有关。适量的必需脂肪酸，对调节体内胆固醇代谢及增强免疫功能、促进脂肪酸代谢都有重要作用。毛霉属(Mucor)是一类可以产生多不饱和脂肪酸的真菌，实验证实微小毛霉能产生γ-亚麻酸。本研究以一株产GLA的微小毛霉(***)为材料，通过PCR方法克隆得到的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因，并利用酵母表达系统pYES2.0证实该基因能导致酵母合成γ-亚麻酸。主要的工作和结果如下： 1、微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的克隆与序列分析根据已知鲁氏毛霉等微生物的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因设计引物序列，利用PCR技术在微小毛霉的DNA和cDNA中均扩增出一条约1.6Kb的带，通过测序、比较，发现该基因在微小毛霉中不含有内含子，其长度是1569bp。通过NCBI上的Blast比对，发现与已知的鲁氏毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因序列具有85％的同源性，蛋白序列具有95％的一致性;并同其它真菌和植物的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因具有广泛的同源性。这说明我们从微小毛霉中克隆了一个新的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因。 2、Δ6-月旨肪酸脱饱和酶基因的生物信息学研究利用在线服务器或生物软件研究了所克隆Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的生物信息学特点，包括同源性分析、蛋白质的进化关系、蛋白质模体分析以及预测蛋白质高级结构等。分析发现假定的微小毛霉Δ6-脂肪酸脱饱和酶是一类跨膜蛋白，具有典型的细胞色素b结构和3个保守的组氨酸区，除了组氨酸富集区Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ各自对应的序列HXXXH，HXXHH和QXXHH外，我们在微小毛霉的Δ6-脱饱和酶基因中还发现了另外一个组氨酸富集区，HKHHSH，在细胞色素b的下游，它没有出现在通常的Δ6-脱饱和酶基因中。实验证实，酵母能表达该Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因，将亚油酸转化为γ-亚麻酸。对基因序列进行分析，发现它与其它已报道过的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因不一样，这说明从微小毛霉上克隆的基因是一个未被克隆的基因，实验为进一步研究Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因家族和进一步利用该基因来改良作物奠定了一定的基础。 3、6-脂肪酸脱饱和酶基因酵母表达载体的构建利用BamHI,KpnI将基因的ORF区从转化的pMD18-T载体上酶切下来，同时用BamHI、KpnI对酵母表达载体pYES2.0进行酶切，将回收的片段进行连接，构建重组的酵母表达载体pYMpD6D。 4、Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中的表达将重组载体pYMpD6D通过醋酸锂方法导入酿酒酵母中，培养8h后再添加2％的半乳糖和酶反应的底物亚油酸进行培养，通过气相色谱分析转基因酵母的脂肪酸成分，发现了一个新的与γ-亚麻酸标样出峰时间一致的色谱峰，而对照酵母中没有。这说明Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因在酵母中得到了正确的表达，表达产物能够将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸，面积法测定其γ-亚麻酸占总脂肪酸量的6.53％。

关键词：多不饱和脂肪酸γ-亚麻酸 Δ6-脂肪酸脱饱和酶微小毛霉酿酒酵母基因表达

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微小毛霉产凝乳酶条件及酶性质的研究

微小毛霉产凝乳酶条件及酶性质的研究

作者：王明强西南大学

学位级别：硕士

凝乳酶在食品、医药、工业等行业应用广泛，是重要的工业用酶之一。在奶酪生产过程中，它起着凝结牛乳、改善风味的作用。根据来源的不同，可将凝乳酶分为三类：动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。而利用微生物生产凝乳酶是目前最... 详细信息

凝乳酶在食品、医药、工业等行业应用广泛，是重要的工业用酶之一。在奶酪生产过程中，它起着凝结牛乳、改善风味的作用。根据来源的不同，可将凝乳酶分为三类：动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶。而利用微生物生产凝乳酶是目前最有前途的发展方向。因此，本论文借鉴现有相关研究成果，以微小毛霉(Mucor　pusillus AS 3．3445)为研究对象，采用固态发酵技术，对菌株的产酶条件以及酶学性质进行了研究，以期为实际生产提供一定的理论依据。主要研究结果如下： 1．对菌株AS 3．3445进行纯化与复壮后，接种麸皮培养基，观察其产酶规律，发现菌株在发酵4d后获得最大酶活。采用水浸提法，探讨加水量、浸提时间对酶活的影响。结果表明，发酵酶曲经80mL蒸馏水浸提15h后，可基本把凝乳酶浸提完全，而此时的酶活比先前提高了23％。 2．对菌株的发酵培养基进行了优化。通过单因素实验，研究了不同碳源、氮源种类、酵母粉、Mg、KHPO·3HO对菌株固态发酵产凝乳酶的影响。实验结果表明，以麸皮为基质，培养基中添加0．8％果糖、0．5％奶粉、0．4％KHPO·3HO、0．2％Mg和0．2％酵母粉，提高的凝乳酶的活性。 3．对菌株的培养条件进行了优化，确定了最佳接种量为10％，最佳固液比为1：1．2，最佳装瓶量为20g，最佳培养温度为28℃，最佳颗粒大小为20目到40目之间。 4．在单因素的试验的基础上，利用响应面分析法优化了培养基中影响凝乳酶产量的主要因素，得到了果糖(X)、奶粉(X)、固液比(X)对凝乳酶产量(Y)的回归方程：Y=14573．80+533．50X+354．38X+2138．63X+516．75XX+908．75XX-72．00XX-1553．65X -1484．40X-2239．40X根据响应值典型分析求得了果糖(X)、奶粉(X)、固液比(X)的最佳组合依次为：1．04％0．58%、1：1．02，与其对应的响应值(Y)为14733Su／g。 5．研究了微小毛霉固态发酵产酶进程。在发酵过程中，发酵曲中凝乳酶和蛋白水解活性的变化有一定的相似性，都在发酵4d后获得了最大酶活，且此时凝乳酶活力与蛋白水解活性之比值最大，为21．75。培养基基质pH在发酵时间内中基本维持不变，而水分、还原糖含量到最后都呈现下降趋势。 6．对Mucor pusillus AS3．3445凝乳酶的酶学性质研究结果表明：该酶耐酸性比耐碱性强，在pH5．4～7．8之间，随着pH值的降低，酶活增加，其最适温度为60℃;该酶在50℃以下，pH5～8范围内稳定。

关键词：凝乳酶微小毛霉固态发酵响应面分析法

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重组微小毛霉凝乳酶的发酵条件及其酶学性质

食品科学 2010年第19期31卷 225-230页

作者：李玉秋王景会李铁柱张莉杨贞耐吉林省农业科学院农产品加工研究中心吉林长春130033

通过对重组微小毛霉凝乳酶(recombinant Mucor pusillus rennet,RMPR)发酵条件的研究,确定甲醇诱导体积分数1%、初始OD600nm0.5、装瓶量100mL/500mL摇瓶、诱导时间96h为发酵最适条件。培养液离心取上清用硫酸铵分级沉淀获得粗酶液,并对... 详细信息

通过对重组微小毛霉凝乳酶(recombinant Mucor pusillus rennet,RMPR)发酵条件的研究,确定甲醇诱导体积分数1%、初始OD600nm0.5、装瓶量100mL/500mL摇瓶、诱导时间96h为发酵最适条件。培养液离心取上清用硫酸铵分级沉淀获得粗酶液,并对其酶学性质进行研究,经测定该酶的最适反应温度为60℃,30～45℃酶较稳定,保温90min,剩余凝乳酶活力达86.5%;酶在pH5.5～7.0范围内,随pH值升高,凝乳酶活力逐渐降低,pH5.5时凝乳酶活力最高。当Ca2+浓度为0.03mol/L时凝乳酶活力最高,Na+浓度对凝乳酶活力没有明显影响,Ni2+和Fe2+对酶有抑制作用,Mn2+、K+、Mg2+对酶有一定的促进作用。

关键词：微小毛霉凝乳酶酶学性质发酵重组

响应面法优化微小毛霉固态发酵生产凝乳酶工艺研究

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食品工业科技 2012年第4期33卷 248-254页

作者：李倬林邵淑娟李铁柱孙悦李玉秋王景会郑丽杨贞耐吉林省农业科学院农产品加工研究中心吉林长春130033 吉林大学军需科技学院吉林长春130062 吉林农业大学吉林长春130118 吉林大学生物与农业工程学院吉林长春130024

采用麦麸培养基进行固态发酵,以研究发酵条件对产酶活力的影响,在此基础上应用Plackett-Burman、最陡爬坡实验和Box-Behnken实验设计,对微小毛霉的固态发酵培养基进化以达到最佳产酶量。实验结果表明,最佳发酵条件为:发酵时间5d,发酵温... 详细信息

采用麦麸培养基进行固态发酵,以研究发酵条件对产酶活力的影响,在此基础上应用Plackett-Burman、最陡爬坡实验和Box-Behnken实验设计,对微小毛霉的固态发酵培养基进化以达到最佳产酶量。实验结果表明,最佳发酵条件为:发酵时间5d,发酵温度30℃,固液比值0.75,接种量为3份,测得凝乳酶酶活为828U/mL。并且当麸皮质量为15.50g、(NH4)2SO4质量为0.15g、KH2PO4质量为0.08g时,微小毛霉产凝乳酶活力达到1200U/mL。较未优化前活力提高了66.67%。

关键词：微小毛霉固态发酵凝乳酶响应面法