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沉默大豆GmWRKY33B基因导致大豆抗病性降低

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生物工程学报 2024年第1期40卷 163-176页

作者：钟晨丽王文絮廖莉娜刘建中浙江师范大学生命科学学院浙江金华321004 浙江师范大学生命科学学院浙江省特色经济植物生物技术重点实验室浙江金华321004

WRKY转录因子基因家族是植物特有的转录因子,在防御中起着重要作用。通过生物信息学分析,本研究在古四倍体大豆(Glycine max)基因组中找到一对同源性高达93%的WRKY33同源基因,并将其命名为GmWRKY33B。从GmWRKY33B的两个同源基因保守区... 详细信息

WRKY转录因子基因家族是植物特有的转录因子,在防御中起着重要作用。通过生物信息学分析,本研究在古四倍体大豆(Glycine max)基因组中找到一对同源性高达93%的WRKY33同源基因,并将其命名为GmWRKY33B。从GmWRKY33B的两个同源基因保守区域选取一个315bp片段构建至菜豆豆荚斑驳病毒(bean pod mosaic virus,BPMV)沉默载体(BPMV-VIGS)上,以期同时沉默上述2个GmWRKY33B基因。结果表明,同时沉默2个GmWRKY33B基因并不显著改变沉默植株的表型,但却显著降低了大豆对大豆斑点病菌以及大豆花叶病毒的抗性,说明GmWRKY33B在大豆免疫反应中起正调控作用。激酶分析表明,GmWRKY33B沉默植株中flg22诱导的GmMPK6的磷酸化水平较空载体BPMV-0植株显著降低,说明GmWRKY33B可以通过调控GmMPK6的激酶活性而参与大豆的免疫反应。抗毒素为大豆中主要起防御作用的植保素,而大豆异黄酮类特异性异戊烯基转移酶(prenyltransferase,PT)基因家族是参与大豆抗毒素生物合成的主要基因,许多PT基因启动子区含有与WRKY特异性结合的W-box序列。在丁香假单胞菌pv.甘氨酸(Pseudomonas syringae ***,Psg)侵染条件下,4个PT基因的表达水平在沉默株系中显著降低,说明GmWRKY33B参与PT基因的转录激活。综上所述,GmWRKY33B通过调控GmMPK6的激活以及调控大豆抗毒素生物合成途径中关键酶编码基因的表达而参与免疫反应。

关键词： GmWRKY33 利用病毒诱导基因沉默免疫反应 GmMPK3/6 异戊烯基转移酶大豆抗毒素

植物激素合成酶基因ipt,iaaM及其双价基因转入甘蓝型油菜对其产量性状的影响

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植物激素合成酶基因ipt,iaaM及其双价基因转入甘蓝型油菜对其产量...

作者：文红秀西南农业大学

学位级别：硕士

油菜是我国重要的油料作物。目前，我国的油菜栽培面积、产量虽均居世界首位，但其单产却远远低于德国等欧洲国家。这对于我国人口逐渐增多而耕地日益减少的问题无疑是一个不利因素。为此，本研究利用根癌农杆菌介导法，将带有激素合成... 详细信息

油菜是我国重要的油料作物。目前，我国的油菜栽培面积、产量虽均居世界首位，但其单产却远远低于德国等欧洲国家。这对于我国人口逐渐增多而耕地日益减少的问题无疑是一个不利因素。为此，本研究利用根癌农杆菌介导法，将带有激素合成酶基因ipt(编码异戊烯基转移酶)、iaaM(编码色氨酸单加氧酶)及其双价基因的三个表达载体：衰老启动子SAG12启动的ipt基因(SAG12-ipt)、种子特异启动子(seed specific promoter，缩写为SSP)启动的iaaM基因(SSP-iaaM)及其双价表达载体(SAG12-ipt-SSP-iaaM，简写为ipt-iaaM)转入甘蓝型油菜，以期获得性状优良的转基因油菜新材料。本研究现取得了如下主要结果： 1．转化植株T代表型性状的观察与分析对油菜下胚轴进行ipt、iaaM及其双价基因的转化，筛选，生根，增殖与移栽，共得61个Km抗性株系。观察分析转化植株的表型，结果发现：在植株形态及角果形状上存在差异。与对照相比，转SAG12-ipt基因的植株主要表现为叶片衰老延迟、分枝数增多、角果伸长、弯曲;转SSP-iaaM基因的植株主要表现为角果变宽;转双价基因ipt-iaaM的植株主要表现为植株矮化、分枝数增多、角果伸长。其它性状如育性等与对照植株无甚异常，说明外源基因可能已导入油菜并在其中得到表达。 2．转化植株T代ipt基因的PCR检测对转SAG12-ipt及SAG12-ipt-SSP-iaaM基因有表型差异的T代各转化株系进行目的基因ipt的PCR鉴定分析。结果表明，有9个株系的转化植株能得到与目的基因大小相同的扩增带(约700bp)，说明外源基因已整合进油菜基因组中。 3．T代转基因植株的田间试验将转基因油菜的第一代(T)自交种子与阴性对照同期播种、育苗后移栽至大田，以观察转化植株在自然环境条件下的表型及其遗传稳定性。 (1)、田间考察结果表明：转SAG12-ipt基因的3个株系衰老明显延迟，其中，2个株系的角果明显伸长;转SSP-iaaM基因的4个株系中，2个株系明显早花;转双价ipt-iaaM基因的6个株系中，1个株系的植株偏矮，2个株系的衰老明显延迟，且1个株系的角果伸长。保持了TO代的表型性状。说明外源基因在转基因株系中得到了稳定的遗传及表达。 (2)、室内考种数据结果表明：不同转基因株系在某些性状上与对照植株的差异达到显著或极显著水平。其中，转 SAG12－ipt基因植株的特征是株高、二次分校数、每株角果数与千粒重均增加，角果伸长：转％卜加M基因植株的特征是千粒重增加：转双价…咖M基因的株系表现为每株角果数、二次分枝数与千粒重均增加，植株偏矮，同时具有ipt与oM 基因的作用特点。综合各相关性状，有6个株系的表现较好，其中株系iaaM七增产15．0％。

关键词：异戊烯基转移酶色氨酸单加氧酶甘蓝型油菜遗传转化

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代谢改造大肠杆菌合成8-异戊烯基山奈酚

食品与发酵工业 2023年第23期49卷 16-24页

作者：赵婉莹周景文侯颖天津科技大学生物工程学院天津300000 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

8-异戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol,8-pk)是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗癌等药理活性。目前8-pk的生物合成主要通过植物来源的异戊烯基转移酶(prenyltransferases,PTs)催化山奈酚(kaempferol,Kae)实现。然而植物源的PTs自身含有... 详细信息

8-异戊烯基山奈酚(8-prenylkaempferol,8-pk)是一种黄酮类化合物,具有抗炎、抗癌等药理活性。目前8-pk的生物合成主要通过植物来源的异戊烯基转移酶(prenyltransferases,PTs)催化山奈酚(kaempferol,Kae)实现。然而植物源的PTs自身含有的信号肽会极大阻碍其在原核生物中异源表达和高效催化,且催化途径中前体物质二甲基烯丙基焦磷酸盐(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)的供给不足严重限制了8-pk的生物合成产量。该研究以大肠杆菌(Escherichia coli)为底盘细胞,通过强化前体DMAPP供应和截短异戊烯基转移酶信号肽实现了8-pk的高效合成。首先,在*** BL21(DE3)中游离表达了淫羊藿来源的异戊烯基转移酶(EkF8DT),并引入异戊烯醇利用途径提升了EkF8DT的前体DMAPP的供应,8-pk产量达到2.14 mg/L。随后,通过AlphaFold2预测了EkF8DT的结构,将EkF8DT N端截短60个氨基酸时8-pk产量最高,达到6.46 mg/L。通过将EkF8DT的N端融合蛋白质标签以及优化发酵条件产量达到24.28 mg/L,最终在5 L发酵罐中8-pk产量达到44.33 mg/L,这是目前报道的较高水平。该研究为8-pk等类黄酮异戊烯基化的高效生物合成提供了策略。

关键词： 8-异戊烯基山奈酚异戊烯基转移酶异戊烯醇利用途径信号肽截短蛋白质标签

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植物中异戊烯基取代的酚类化合物及其分布

西北植物学报 2023年第9期43卷 1604-1620页

作者：王圆月落艳娇张译心申国安郭宝林中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所北京100193

异戊烯基取代的酚类化合物由UbiA家族的异戊烯基转移酶(prenyltransferase)催化异戊烯基转移到芳香族化合物母核上,其亲脂性较无异戊烯基取代的化合物明显增强,并提高了与生物膜的亲和力,从而形成了各种具有重要生物学功能的活性分子,... 详细信息

异戊烯基取代的酚类化合物由UbiA家族的异戊烯基转移酶(prenyltransferase)催化异戊烯基转移到芳香族化合物母核上,其亲脂性较无异戊烯基取代的化合物明显增强,并提高了与生物膜的亲和力,从而形成了各种具有重要生物学功能的活性分子,在植物防御和人体健康方面具有重要作用。本综述总结了538种异戊烯基酚类化合物的取代基类别和取代位点等,为发掘植物中新型异戊烯基转移酶,以及受体和供体的选择提供参考,以期有更多异戊烯基转移酶可应用于合成生物学来生产具有重要活性的异戊烯基酚类化合物。该文对国内外报道的378种类黄酮,80种香豆素类,27种醌类,32种二苯乙烯类,16种对羟基苯甲酸类,5种苯丙酸类共计538种异戊烯基取代的酚类化合物的取代基类别、取代位置以及在植物中的分布进行总结,发现异戊烯基酚类化合物主要分布在28个科中,且以C5和C10取代基为主。该文还综述了已鉴定功能的30余种植物芳香族异戊烯基转移酶。

关键词：异戊烯基酚类化合物异戊烯基转移酶

pap和ipt共表达与提高转基因烟草抗病性的初步研究

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北京师范大学学报（自然科学版） 2010年第6期46卷 714-718页

作者：殷娴李朝霞张海燕吴国智程伟肖尊安北京师范大学生命科学学院北京100875 天津市园林花圃天津300112 中国科学院遗传与发育研究所北京100101 甘肃亚盛集团博士后科研工作站北京分站北京100101

通过构建pap与ipt共表达的双元载体,利用农杆菌介导,将pap与ipt共表达基因导入烟草K326品种的叶肉细胞,经过抗性筛选和鉴定,获得高表达的转基因植株,并对其进行了攻毒实验.结果表明:pap与ipt共表达基因转化烟草的转化率明显提高(25%),... 详细信息

通过构建pap与ipt共表达的双元载体,利用农杆菌介导,将pap与ipt共表达基因导入烟草K326品种的叶肉细胞,经过抗性筛选和鉴定,获得高表达的转基因植株,并对其进行了攻毒实验.结果表明:pap与ipt共表达基因转化烟草的转化率明显提高(25%),证实转基因细胞中ipt基因表达可降低PAP细胞毒性;接种烟草花叶病毒(TMV)后,pap高表达的转基因植株出现病症的时间延迟20 d,叶片失绿程度较轻,表明该转基因植株对病毒的抗性有一定程度的提高.

关键词：美洲商陆抗病毒蛋白(PAP) 异戊烯基转移酶烟草烟草花叶病毒

酶的杂泛性与活性天然产物的分子创新及药物发现

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酶的杂泛性与活性天然产物的分子创新及药物发现

外源ipt对叶片衰老分子调控研究进展(综述)

中国化学会第十二届全国天然有机化学学术会议

作者：戴均贵陈日道解可波陈大伟刘晓李建华王瑞杉冯渴评乐田中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室＆天然药物生物合成卫健委重点实验室

多种酶具有杂泛性（Promiscuity）,即具有底物的宽泛性与反应的多样性,在复杂结构活性天然产物的结构优化与药物发现中具重要意义。本报告将主要介绍新颖糖基转移酶（Glycosyltransferase）、异戊烯基转移酶（Prenyltransferase）的发... 详细信息

多种酶具有杂泛性（Promiscuity）,即具有底物的宽泛性与反应的多样性,在复杂结构活性天然产物的结构优化与药物发现中具重要意义。本报告将主要介绍新颖糖基转移酶（Glycosyltransferase）、异戊烯基转移酶（Prenyltransferase）的发掘、杂泛性以及多样性导向下活性天然产物的分子创新与药物发现,亦将介绍新颖异戊烯基转移酶AtaPT杂泛性的分子机制及其结构导向下其杂泛性与选择性的人工操控。

关键词：糖基转移酶异戊烯基转移酶酶的杂泛性蛋白质理性设计药物发现

来源： cnki会议评论

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cnki会议

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热带亚热带植物学报 2002年第1期10卷 77-82页

作者：王晓莺范树国张明永梁承邺中国科学院华南植物研究所广东广州510650

综述了叶片衰老的分子机理,并介绍了将外源异戊烯基转移酶(ipt,isopentenyltransferase)基因转入植物以获得抗衰老植株的研究进展。

关键词：叶片衰老衰老相关基因细胞分裂素异戊烯基转移酶启动子 ipt 分子调控植物

转P_(rd29A)-ipt基因对烟草根及侧芽生长的影响

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生物技术通报 2010年第8期26卷 137-140页

作者：董绍旺王爱英孙建富沈海涛祝建波石河子大学农业生物技术重点实验室石河子832000

利用异戊烯基转移酶(isopentenyl-transferases,ipt)基因转化植物,可明显提高抗逆性和抗病性,延缓叶片衰老。逆境胁迫常会对植物造成很大的伤害,拟南芥的Prd29A启动子受干旱、盐及冷胁迫诱导。构建了Prd29A-ipt植物表达载体,通过农杆菌... 详细信息

利用异戊烯基转移酶(isopentenyl-transferases,ipt)基因转化植物,可明显提高抗逆性和抗病性,延缓叶片衰老。逆境胁迫常会对植物造成很大的伤害,拟南芥的Prd29A启动子受干旱、盐及冷胁迫诱导。构建了Prd29A-ipt植物表达载体,通过农杆菌介导转化普通烟草,获得了能够正常生长的转基因植株。通过表型观察发现,转Prd29A-ipt烟草具有一定的组成型表达,降低了烟草的顶端优势,促进了烟草侧芽的生长,同时,对根的伸长有一定的抑制作用。

关键词：异戊烯基转移酶细胞分裂素顶端优势侧芽

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山奈酚在大肠杆菌中生物合成淫羊藿苷的研究

山奈酚在大肠杆菌中生物合成淫羊藿苷的研究

作者：赵婉莹天津科技大学

学位级别：硕士

淫羊藿苷是一种重要的异戊烯基黄酮类化合物,是传统中药淫羊藿的主要活性成分,在食品和医药领域具有广阔的应用前景。植物提取与化学合成存在成本高,环境不友好等问题。随着合成生物学的飞速发展,利用微生物合成淫羊藿苷成为趋势。本文... 详细信息

淫羊藿苷是一种重要的异戊烯基黄酮类化合物,是传统中药淫羊藿的主要活性成分,在食品和医药领域具有广阔的应用前景。植物提取与化学合成存在成本高,环境不友好等问题。随着合成生物学的飞速发展,利用微生物合成淫羊藿苷成为趋势。本文以山奈酚为底物,构建了8-异戊烯基山奈酚(8-pk)的合成系统以及淫羊藿素的合成系统。同时以淫羊藿素为底物,建立了合成淫羊藿苷的方法,为淫羊藿苷的从头合成奠定了一定的基础。本研究主要策略和结果如下:(1)通过强化前体DMAPP供应和截短异戊烯基转移酶信号肽实现了8-pk的高效合成。首先,在*** BL21(DE3)中游离表达了淫羊藿来源的异戊烯基转移酶(Ek F8DT),并引入IUP途径提升了Ek F8DT的前体DMAPP的供应。随后,通过Alpha Fold2预测了Ek F8DT的信号肽结构,根据Ek F8DT信号肽的结构特点将N端截短60个氨基酸残基时8-pk产量最高。最终,通过将Ek F8DT的N端融合蛋白质标签以及优化发酵条件,最终在5-L发酵罐中8-pk产量达到44.33 mg/L。(2)通过筛选不同来源的4位甲基转移酶,得到了大豆来源的Gm4′OMT,其催化8-pk生成淫羊藿素的能力最强。对该酶进行改造,将GST助溶标签连接到其N端,进一步提高了淫羊藿素的产量。对甲基供体SAM的合成基因进行过表达,大幅度提高了淫羊藿素的产量。最后通过添加镁离子浓度的优化,将淫羊藿素的产量提高到2.8mg/L。(3)构建来自淫羊藿素合成淫羊藿苷的体系。引入了鼠李糖基合成酶Vv RHM-N RS、3位鼠李糖基转移酶Ek F3RT和7位葡萄糖基合成酶Ep F7GT,并进行了基因表达水平的优化。敲除EMP途径和PPP途径关键基因pgi和zwf,构建EG6(*** B L21(DE3)ΔpgiΔzwf)工程菌株。进一步敲除UDPG合成相关竞争途径,构建EG14(*** BL21(DE3)ΔpgiΔzwfΔugdΔots AΔgcdΔush A)工程菌株,在EG14中使用p ETDue t质粒过量表达UDPG合成关键基因pgm、gal U和ndk,当加入100 mg/L淫羊藿素为底物时,淫羊藿苷产量为36.53 mg/L。

关键词：大肠杆菌 8-异戊烯基山奈酚淫羊藿苷异戊烯基转移酶