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异位成骨动物模型的研究进展

中国矫形外科杂志 2015年第6期23卷 524-527页

作者：朱彦丞郑欣邱旭升陈一心南京医科大学鼓楼临床医学院南京210008

异位成骨动物模型在骨组织工程技术研究方面应用广泛。目前异位成骨模型建立方法主要有四种,分别为皮下植入、肌袋植入、肾被膜植入及腹膜内植入。四种异位成骨植入模型建立方法各有优缺点,本文就异位成骨动物模型的研究进展作一综述。

关键词：异位成骨动物模型皮下肌袋

联合培养血管内皮细胞与脂肪干细胞构建组织工程骨异位成骨

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中国修复重建外科杂志 2019年第10期33卷 1310-1319页

作者：王福科张红李彦林刘流何川蔡国锋宋恩昆明医科大学第一附属医院运动医学科昆明650031 昆明医科大学第一附属医院精神科昆明650031 昆明医科大学第一附属医院整形外科昆明650031

目的探讨将联合培养血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)和脂肪干细胞(adiposederived stem cells,ADSCs)的培养体系作为种子细胞的组织工程骨异位成骨能力。方法采用纤维粘连蛋白复合部分脱蛋白骨(partially deproteinised ... 详细信息

目的探讨将联合培养血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)和脂肪干细胞(adiposederived stem cells,ADSCs)的培养体系作为种子细胞的组织工程骨异位成骨能力。方法采用纤维粘连蛋白复合部分脱蛋白骨(partially deproteinised bone,PDPB)制备部分脱蛋白生物骨(partially deproteinised biologic bone,PDPBB);分离培养18周龄SD大鼠ADSCs及足月妊娠SD大鼠脐血VECs。体外构建3种组织工程骨:PDPBB+VECs(A组)、PDPBB+ADSCs(B组)、PDPBB+联合培养细胞(VECs∶ADSCs为1∶1,C组),以单纯PDPBB为对照组(D组)。细胞移植后10 d行扫描电镜观察细胞在各组支架上的黏附情况。取18周龄SD大鼠48只,随机分为A、B、C、D 4组,每组12只。分别将A、B、C、D 4种支架材料植入相应组别的大鼠股部肌袋,术后2、4、8、12周处死动物行大体观察及HE染色和Masson染色组织学观察,并取Masson染色切片行骨胶原量定量检测。结果扫描电镜观察示,PDPB材料孔隙内部相互连通;纤维粘连蛋白修饰的PDPBB表面大量片状蛋白结晶松散附着于支架表面;复合细胞联合培养10 d后,C组大量细胞与PDPBB附着,细胞相互堆积形成细胞团,多角形细胞和梭形细胞混合分布,细胞沿骨小梁生长,形成细胞层。大体观察示术后2周各组肉芽组织开始长入材料孔隙。C组自4周后材料表面逐渐产生大量白色软骨样物质,表面高低不平。至12周时,A组材料表面血管量增多,材料呈实变;B组材料表面出现少许白色软骨样物质,但材料孔隙未见明显减小;D组材料孔隙大小未见明显减小。组织学观察可见术后2周,各组间骨胶原量比较差异无统计学意义(F=2.551,P=0.088);术后4、8、12周,C组骨胶原量显著高于其余3组,B组高于D组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论联合培养VECs与ADSCs作为种子细胞构建组织工程骨的异位成骨能力最强。

关键词：脂肪干细胞血管内皮细胞联合培养组织工程骨异位成骨

慢病毒介导沉默P75神经营养蛋白受体联合NGF过表达转染BMSCs复合脱钙骨基质异位成骨的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2020年第11期34卷 1438-1445页

作者：陈俊毅王宁张衡张贤平赵利民朱伦井黎智君贝朝涌桂林医学院附属医院四肢创伤骨科广西桂林541000

目的探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响。方法通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传... 详细信息

目的探索沉默P75神经营养蛋白受体(p75 neurotrophin receptor,P75NTR)联合NGF过表达对大鼠BMSCs增殖活性和复合脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)构建组织工程骨异位成骨能力的影响。方法通过贴壁分离法培养SD大鼠BMSCs并传代。取第3代BMSCs,分别用慢病毒介导沉默P75NTR基因(B组)、NGF过表达基因(C组)、沉默P75NTR和NGF过表达双基因(D组)转染,以未转染细胞作为对照(A组)。转染7 d后荧光显微镜观察目的基因荧光蛋白表达;细胞计数试剂盒8法检测转染后连续8 d细胞的活性;Western blot检测各组P75NTR和NGF蛋白表达。倒置相差显微镜和扫描电镜分别观察沉默P75NTR和NGF过表达双基因转染后BMSCs与DBM的黏附情况。将上述4组转染后BMSCs分别与DBM共培养制备组织工程骨后,埋植于8周龄SD大鼠背侧皮下构建皮下异位成骨模型(n=6),术后4、8周行HE染色,术后8周ALP染色观察钙结节形成,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、ALP和骨钙素(osteocalcin,OCN)表达。结果转染7 d A组未见荧光表达,B组呈红色荧光表达,C组呈绿色荧光表达,D组呈红绿色复合荧光表达;目的基因荧光表达率可达70%左右。Western blot检测示,A、C组P75NTR蛋白相对表达量显著高于B、D组,C、D组NGF蛋白相对表达量显著高于A、B组,差异均有统计学意义(P异位成骨实验中,HE染色示术后4、8周,D组比其余3组有更多的骨组织形成。ALP染色示D组ALP活性最高,有更好的成骨表达。实时荧光定量PCR检测示,与A组比较,D组Runx2、ALP、OCN mRNA相对表达量显著升高,差异均有统计学意义(P异位成骨能力,通过提高NGF的水平、关闭P75NTR凋亡通道,不仅可以提高细胞活性,还能更好地促进骨组织再生。

关键词： P75神经营养蛋白受体 NGF BMSCs 细胞活性脱钙骨基质异位成骨大鼠

微包囊优化制备及复合自体微小颗粒骨异位成骨的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2007年第11期21卷 1184-1190页

作者：姬烨闫景龙徐公平张东旭哈尔滨医科大学附属第一医院骨科哈尔滨150001 松原市中心医院骨科

目的探讨优化生长因子微包囊制作方法,观察其释放规律和复合微小颗粒骨异位成骨的效果。方法正交设计优化聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly-DL-lactide-co-glycolide,PLGA)微包囊制作工艺,于2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、120、... 详细信息

目的探讨优化生长因子微包囊制作方法,观察其释放规律和复合微小颗粒骨异位成骨的效果。方法正交设计优化聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly-DL-lactide-co-glycolide,PLGA)微包囊制作工艺,于2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、120、144、168、192、216、240和264h计算微包囊的累计释放量。实验取24只Wistar大鼠,随机分为4组(n=6),每只大鼠于双侧股部作1cm切口,制备臀大肌肌袋模型。A组双侧植入胶原,B组双侧植入胶原和颗粒骨,C组双侧植入胶原和重组人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein2,rhBMP-2)/PLGA缓释微包囊;D组双侧植入胶原、颗粒骨与rhBMP-2/PLGA缓释微包囊。于术后3、4和5周取样(n=2)行大体和组织学观察。结果各优化变量对微包囊粒径及其包封率均有影响,包囊表面光滑,成球较好。体外能够在11d内缓慢释放。术后3周大体观察,A组未触及移植物,B、C、D组可触及,微包囊呈白色颗粒包裹于组织中。组织学观察:术后3周,A组胶原已经完全吸收,其余3组可见残余胶原;术后4周,A组胶原已不易见到,B组可见微小颗粒骨继续吸收,体积变小;C组包囊体积缩小,囊间成骨性细胞增多;D组微小颗粒骨和微包囊继续吸收,成骨性细胞和软骨性细胞团增多;术后5周,B、C、D组均可见植入物体积减小,包囊被吸收破碎,但颗粒骨和包囊周围的软骨性细胞、成骨性细胞更加密集。结论优化PLGA微包囊制备工艺,使其在体外能够长时间缓释。自体微小颗粒骨可在臀大肌肌袋内异位诱导生成大量成骨性细胞,PLGA微包囊可以与其有机复合,并在减少生长因子用量的同时协同微小颗粒骨成骨。

关键词：骨移植聚乳酸-羟基乙酸共聚物微包囊自体微小颗粒骨异位成骨大鼠

珍珠层聚乳酸人工骨复合成骨细胞体内异位成骨研究

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中国修复重建外科杂志 2005年第2期19卷 114-117页

作者：唐焕章陈建庭金大地杨春露谭小云南方医科大学附属南方医院脊柱骨病科

目的　探讨珍珠层聚乳酸 (nacre/ polylactic acid,N/ P)人工骨与同种异体成骨细胞复合 ,植入体内后异位成骨的作用机制 ,以及作为骨组织工程支架材料的可行性。　方法　成年雄性新西兰大白兔 18只 ,按 2、4和 8周3个时间点随机分成 3... 详细信息

目的　探讨珍珠层聚乳酸 (nacre/ polylactic acid,N/ P)人工骨与同种异体成骨细胞复合 ,植入体内后异位成骨的作用机制 ,以及作为骨组织工程支架材料的可行性。　方法　成年雄性新西兰大白兔 18只 ,按 2、4和 8周3个时间点随机分成 3组 ,每组 6只。将体外培养的同种异体新西兰大白兔成骨细胞 ,种植到 N/ P人工骨材料上 ,并植入每只兔左侧背部皮下为实验组 ;以不复合成骨细胞的 N/ P人工骨材料植入右侧背部皮下作对照 ,分别于植入后不同时间点取材 ,经大体观察、组织学检查和免疫组织化学方法检测。　结果　实验组 2周时材料周围有少许炎性细胞聚集 ,4周时有类骨质形成 ,8周时有成熟骨组织形成 ,其中可见骨髓腔 ;对照组 2、4周时仅见大量纤维组织长入材料内 ,8周时材料内纤维组织增多 ,但无成骨发生。　结论　 N/ P人工骨可作为理想的骨组织工程支架材料。

关键词：成骨细胞人工骨材料异位成骨植入体内皮下同种异体雄性纤维组织体外培养

BMP_2活性多肽/鼠尾Ⅰ型胶原复合物植入异位成骨的实验研究

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中国生物医学工程学报 2010年第2期29卷 295-299页

作者：李景峰郑启新郭晓东卢宏伟林振宇兰生辉华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科武汉430022

用动物实验的方法验证鼠尾Ⅰ型胶原支架与自行研制合成的BMP2活性多肽复合后诱导异位成骨的能力与作用。自行提取鼠尾Ⅰ型胶原以及与BMP2活性多肽复合,冻干后低真空模式下电镜观察胶原结构。实验分2组。对照组:单纯鼠尾Ⅰ型胶原组;实验... 详细信息

用动物实验的方法验证鼠尾Ⅰ型胶原支架与自行研制合成的BMP2活性多肽复合后诱导异位成骨的能力与作用。自行提取鼠尾Ⅰ型胶原以及与BMP2活性多肽复合,冻干后低真空模式下电镜观察胶原结构。实验分2组。对照组:单纯鼠尾Ⅰ型胶原组;实验组:BMP2活性多肽/鼠尾Ⅰ型胶原复合物组。将12只大白鼠随机分成2组,每只大白鼠右侧大腿作2 cm的切口,制备股四头肌肌袋模型,将上述材料分别植入肌袋。术后第3周和第6周分别作放射学检查(X-ray,CT),第6周将所有大白鼠处死作组织学(HE染色)检查。鼠尾Ⅰ型胶原冻干后孔径大小合适与BMP2活性多肽复合后无明显改变。术后第3周和第6周放射学检查可见实验组有明显的钙化影形成,且第6周成骨范围要明显大于第3周时所见,而对照组无成骨现象。术后第6周组织学观察可见实验组植入区有成骨细胞和大量新骨形成,而对照组仅见炎性细胞改变。鼠尾Ⅰ型胶原是一种较好的载体支架材料,自行研制合成的BMP2活性多肽与其复合后,具有较强的异位诱导成骨能力。

关键词： BMP2活性多肽鼠尾胶原异位成骨

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永生化hBMSCs复合异种骨异位成骨

中国修复重建外科杂志 2010年第12期24卷 1515-1519页

作者：滕勇胡蕴玉李旭升王臻白建萍关玉成兰州军区乌鲁木齐总医院骨一科乌鲁木齐830000 第四军医大学西京医院骨科研究所

目的为解决组织工程中种子细胞数量不足及为组织工程种子细胞研究提供标准细胞,建立永生化hBMSCs(MSCxj)系,进一步探讨MSCxj的异位成骨能力。方法取冻存复苏后生长良好的第35代和第128代MSCxj,扩增培养至2109个,分别与牛松质骨复合培养... 详细信息

目的为解决组织工程中种子细胞数量不足及为组织工程种子细胞研究提供标准细胞,建立永生化hBMSCs(MSCxj)系,进一步探讨MSCxj的异位成骨能力。方法取冻存复苏后生长良好的第35代和第128代MSCxj,扩增培养至2109个,分别与牛松质骨复合培养,作为A、B组(n=12),C组为单纯牛松质骨(n=12)。成骨诱导培养48h和18d时行扫描电镜观察细胞在材料上的生长情况。于18只4～6周龄裸鼠背部两侧皮下各作一3mm小切口,将3组共36个标本采用组内随机、组间两两配对分别植入切口内。处死动物前分别行四环素荧光标记。于术后4、8、12周各组分别取4个标本行HE、丽春红三色、四环素荧光染色、鼠抗人骨钙素单克隆抗体免疫组织化学染色观察,并行形态学定量分析。结果细胞-异种骨复合培养48h,扫描电镜观察见A、B组细胞贴附生长良好;18d可见大量合成的丝状细胞外基质及细小颗粒样分泌物,并覆盖细胞。裸鼠皮下埋植实验:HE、丽春红三色、四环素荧光染色观察示,术后4周A、B组标本成骨不明显,8周A、B组标本周边及异种骨内部孔隙有类骨基质沉积,12周A、B组标本成骨增加,A、B组间成骨情况比较无明显差异;C组各时间点均未见骨质形成。鼠抗人骨钙素单克隆抗体免疫组织化学染色显示,A、B组8周及12周骨陷窝内骨钙素染色呈阳性。形态学定量分析显示,术后8周A、B组骨长入率分别为5.64%±2.68%和4.92%±2.95%,术后12周分别为13.94%±2.21%和14.34%±3.46%,两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);组内术后12周骨长入率均高于术后8周,差异有统计学意义(P异位成骨能力,可作为骨组织工程的种子细胞进行相关实验及临床研究。

关键词：骨组织工程永生化hBMSCs 异种骨异位成骨裸鼠

载BMP-2多肽P24的巯基化壳聚糖水凝胶诱导异位成骨的实验研究

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中国修复重建外科杂志 2018年第9期32卷 1144-1149页

作者：詹健峰刘徐妹于博南方医科大学珠江医院创伤骨科广州510282 南方医科大学珠江医院超声诊断科广州510282

目的探讨载BMP-2多肽P24的巯基化壳聚糖(chitosan-4-thio-butylamidine,CS-TBA)水凝胶的异位成骨能力及体内生物相容性。方法采用壳聚糖、2-亚氨基硫烷盐酸盐、羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)制备CS-TBA/HA溶液,进一步加入P24多肽制备CS... 详细信息

目的探讨载BMP-2多肽P24的巯基化壳聚糖(chitosan-4-thio-butylamidine,CS-TBA)水凝胶的异位成骨能力及体内生物相容性。方法采用壳聚糖、2-亚氨基硫烷盐酸盐、羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)制备CS-TBA/HA溶液,进一步加入P24多肽制备CS-TBA/5%P24/HA、CS-TBA/10%P24/HA溶液;取上述3种溶液,加入β-甘油磷酸二钠(β-glycerophosphate disodium,β-GP),获得CS-TBA/HA/β-GP、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP水凝胶。取雌性SD大鼠18只,随机分为A、B、C 3组(n=6),制备竖脊肌肌袋后,分别植入CS-TBA/HA/β-GP水凝胶(A组)、CS-TBA/5%P24/HA/β-GP水凝胶(B组)、CS-TBA/10%P24/HA/β-GP水凝胶(C组)。术后观察大鼠存活情况,4、8周取材采用micro-CT检测标本骨小梁厚度(trabecular thickness,***)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)、皮质骨骨密度(bone mineral density,BMD),组织学观察(HE、Masson染色)分析材料的生物降解性及成骨作用。结果术后各组大鼠均存活至取材时间点。micro-CT显示,术后随时间延长,各组新生骨逐渐增多;同一时间点B、C组较A组明显,且随着P24浓度的增加,C组新生骨形成更多。术后各组***、Tb.N、BMD逐渐增加,除A组***外,其余各指标4周与8周间比较差异均有统计学意义(P成骨效果随P24浓度升高而增强。结论 P24多肽有助于提升CS-TBA水凝胶的异位成骨作用,且10%浓度效果更强。

关键词：巯基化壳聚糖水凝胶 BMP-2 异位成骨 micro-CT 大鼠

重组人BMP-2/壳聚糖/硫酸葡聚糖复合微球诱导异位成骨的micro-CT评价

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中国修复重建外科杂志 2016年第3期30卷 286-291页

作者：夏远军余翔章莹尹庆水夏虹郑晓辉谢会斌黄显华广州军区广州总医院创伤骨科广州510010 广州中医药大学第一临床医学院广州中医药大学第一附属医院骨科

目的采用micro-CT评价重组人BMP-2/壳聚糖/硫酸葡聚糖（recombinant human BMP-2/chitosan/dextran sulfate,rhBMP-2/CS/DS）复合微球诱导异位成骨情况。方法采用离子交联法制作rhBMP-2/CS/DS复合微球,扫描电镜观察其形态,ELISA法检测微球体外缓释效应。取6-8周龄雄性SD大鼠48只,随机分为4组（n=12）;制备股四头肌肌袋模型后,分别将相同体积明胶海绵（A组）、CS/DS微球（B组）、rhBMP-2（C组）及rhBMP-2/CS/DS复合微球（D组）植入肌袋肌间隙中。术后观察大鼠一般情况;于4、8、12、16周处死动物,取异位骨化组织块行micro-CT扫描及三维重建,检测组织骨密度（tissue mineral density,TMD）、骨体积分数（bone volume fraction,BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness,***）、骨小梁数量（trabecular number,Tb.N）、皮质骨骨密度（bone mineral density,BMD）及组织矿含量（tissue mineral content,TMC）。结果扫描电镜观察示,制备的rhBMP-2/CS/DS复合微球球形较规整,分散较均匀,无团聚,微球表面较光滑;微球体外释放rhBMP-2于2 h后出现1个突释放期,2 d时达峰值,释放周期约20 d。各组大鼠均存活至实验完成,术后各时间点,A、B组CT扫描均未见放射性显影,三维重建未发现成骨;而C、D组放射性显影强度及三维重建骨组织逐渐增加,且D组强于C组。各时间点A、B组TMD、BVF、***、Tb.N、BMD及TMC均为0。随时间延长,C、D组除Tb.N外,其余骨组织参数均呈总体增加趋势,各时间点与A、B组比较差异均有统计学意义（P〈0.05）;C、D组间4周时比较差异无统计学意义（P〉0.05）,8-16周时D组显著高于C组,比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 rhBMP-2/CS/DS复合微球异位诱导成骨能力显著强于单独rhBMP-2。

关键词： BMP-2 壳聚糖硫酸葡聚糖异位成骨 micro-CT 三维重建大鼠