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鼠李糖乳杆菌LGG芳香酯酶的酶学表征与结构分析

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食品科学 2023年第8期44卷 162-169页

作者：李新锋郭彤彤李彬春山西大学大型科学仪器中心山西太原030006 山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西太原030006

为获得新型益生菌酯酶资源,通过挖掘鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus GG,LGG)的基因组信息,对芳香酯酶LggAE进行基因克隆、表达纯化、酶学表征与结构分析。结果表明:LggAE的最适反应pH值为7.5,在pH 7.0~10.0范围内保持75%以... 详细信息

为获得新型益生菌酯酶资源,通过挖掘鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus GG,LGG)的基因组信息,对芳香酯酶LggAE进行基因克隆、表达纯化、酶学表征与结构分析。结果表明:LggAE的最适反应pH值为7.5,在pH 7.0~10.0范围内保持75%以上酶活力,最适反应温度为50℃,偏好水解中链对硝基苯酚酯,最适底物为对硝基苯酚辛酸酯,在40℃条件下具有一定热稳定性,乙二醇可提升LggAE 17.3%酶活力,LggAE耐受二甲基亚砜,在较高盐浓度柠檬酸钠和氯化钠存在下能保持39.1%~71.0%酶活力,脱氧胆酸钠在高温下显著抑制酶活力。结构分析显示LggAE的底物结合口袋呈较小孔洞状,主要由脂肪族氨基酸残基构成。

关键词：芳香酯酶鼠李糖乳杆菌酶学表征结构分析底物结合口袋

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肝素C5异构酶的表达优化及分子改造

生物工程学报 2020年第7期36卷 1450-1458页

作者：王兵兵周正雄金学荣李江华史仲平康振江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室江苏无锡214122

肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.***.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体(N-sulfoheparosan)... 详细信息

肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.***.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体(N-sulfoheparosan)的D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸(L-iduronic acid,L-IdoA)。文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造。比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+)和pColdⅢ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pColdⅢ表达酶活最高,达到(1873.61±5.42)U/L。为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50%,酶活达到(2409.25±6.43)U/L。在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体(V153R)的酶活和比酶活分别为(5804.32±5.63)U/L和(145.14±2.33)U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础。

关键词：肝素葡萄糖醛酸-C5-异构化酶异源表达理性设计底物结合口袋

酿酒酵母α-N末端甲基转移酶（ScNTM1）与底物多肽结合的结构基础

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酿酒酵母α-N末端甲基转移酶（ScNTM1）与底物多肽结合的结构基础

作者：张海燕中国科学技术大学

学位级别：硕士

翻译后修饰是对于蛋白质发挥生物学功能必不可少的化学修饰,这些翻译后修饰包括泛素化,SUMO化和甲基化等。α-N末端甲基化是普遍存在的翻译后修饰,在整个原核生物和真核生物中都保守。最初报道的蛋白α-N末端甲基化修饰发生在细菌核糖... 详细信息

翻译后修饰是对于蛋白质发挥生物学功能必不可少的化学修饰,这些翻译后修饰包括泛素化,SUMO化和甲基化等。α-N末端甲基化是普遍存在的翻译后修饰,在整个原核生物和真核生物中都保守。最初报道的蛋白α-N末端甲基化修饰发生在细菌核糖体蛋白L16和L33上。随后,许多蛋白质如染色质浓缩调节子1(RCC1),CENP-A/B和受损DNA结合蛋白2(DDB2)等都经历了 α-N端甲基化修饰。总体而言,α-N末端甲基化涉及多种细胞过程,如有丝分裂,发育进程和DNA损伤修复。ScNTM1是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中YBR261C/Tae1基因编码的α-N末端甲基转移酶(本文称之为ScNTM1),可将核糖体蛋白Rpl12ab和Rps25a/Rps25b甲基化。同时,该酶也是首次报道的能将真核生物核糖体蛋白α-N末端甲基化修饰的酶。基因敲除研究表明,甲基化的核糖体蛋白可能保护酵母免受微生物侵袭并且对于蛋白质的合成有重要作用。然而,对来自酵母的ScNTM1的生化及其与底物相互作用的分子机制方面的研究却鲜有报道。为了阐明ScNTM1与其底物之间的分子相互作用,本文获得了酿酒酵母ScNTM1-SAH-Rps25a衍生的六肽(PPKQQL)的三元复合物以及ScNTM1-SAH的二元复合物的晶体结构。结构分析表明ScNTM1有一个与其他SAM-MTase中同样的用于SAM/SAH结合的核心结构域,蛋白分子表面有些结构发生变化,显示出与进化有关的结构变异。与SAH-NRMT1相比,ScNTM1的核心结构域中为SAH结合提供疏水相互作用的残基大部分是保守的,如Gly73,Phe98,Gly122和Leu145。由于Pro94取代了 NRMT1中相应的Ile,腺嘌呤环偏转约20°,以适应腺嘌呤与Pro94之间的环环堆积作用。通过比较ScNTM1和人源NRMT1,NRMT2的三元复合结构,我们发现参与Rps25a底物结合的残基大多数是保守的。底物的前两位氨基酸与蛋白结合时涉及的关键残基是相同的,如Asn172,Trp140。后四位由于底物多肽的摆动方向不同,因此与蛋白相互作用的氨基酸发生了变化。ScNTM1结构中Q4与Tyr32的侧链的氢键是特有的,该氢键在P2和多肽中的Q4识别中起重要作用。参与Rps25a和SAH结合的关键残基也通过点突变和体外等温滴定量热(ITC)实验进行了验证。ScNTM1的二元和三元复合物结构比对发现多肽结合后某些区域,如残基25-36,183-186,215-221部位发生了轻微的构象变化。这些研究丰富了人们对α-N末端甲基转移酶底物的选择性及特异性的认识。

关键词： ScNTM1 N末端甲基化甲基转移酶酿酒酵母底物结合口袋

基于半理性设计的亮氨酸脱氢酶分子改造及应用

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基于半理性设计的亮氨酸脱氢酶分子改造及应用

作者：鲁佳朋江南大学

学位级别：硕士

作为一种重要的非天然氨基酸,L-叔亮氨酸广泛应用于抗癌、抗艾滋病药物以及生物抑制剂等相关领域。亮氨酸脱氢酶(Leu DH)属于NADH依赖型酶,对三甲基丙酮酸有着良好的催化活性,可以用来高效合成L-叔亮氨酸。利用Leu DH催化制备L-叔亮氨... 详细信息

作为一种重要的非天然氨基酸,L-叔亮氨酸广泛应用于抗癌、抗艾滋病药物以及生物抑制剂等相关领域。亮氨酸脱氢酶(Leu DH)属于NADH依赖型酶,对三甲基丙酮酸有着良好的催化活性,可以用来高效合成L-叔亮氨酸。利用Leu DH催化制备L-叔亮氨酸具有反应条件温和、产物光学纯度高等优点,已成为生产L-叔亮氨酸重要方法之一。本研究通过基因挖掘及半理性设计和迭代突变等技术,获得具有高催化效率的亮氨酸脱氢酶。具体内容如下:(1)进行了酶基因挖掘、克隆表达和酶学性质分析。选用已报道的酶活最佳的Leu DH序列作为探针,在NCBI数据库里进行序列比对,从中筛选了5个亮氨酸脱氢酶基因,并进行了克隆和表达。其中来源于Exiguobacterium sibiricum的EsiLeuDH(WT)的酶活最高,粗酶液的比酶活达到15.6 U·mg,纯化后比酶活达到34.3 U·mg。酶学性质研究表明EsiLeuDH的最适p H为9.5、最适温度为30℃;EsiLeuDH对大部分脂肪族酮酸均具有较高酶活力,与其他报道的亮氨酸脱氢酶的底物特异性一致,但对于长链酮类物质均未检测到酶活性。(2)基于半理性设计预测了潜在突变位点,利用丙氨酸扫描和迭代突变技术对EsiLeuDH进行了分子改造。利用同源建模构建其三维模型,并与底物三甲基丙酮酸进行了分子对接;同时,通过氨基酸保守性分析及同源蛋白序列对比确定了17个潜在突变位点,均为非保守位点。通过丙氨酸扫描技术筛选到4个正向突变株E123A、V125A、T143A和V300A,其纯化后的比酶活相比于野生型(WT)分别提高了44%、36%、35%和17%。对4个正向突变位点进行定点饱和突变,获得了5株正向突变株E123V、E123S、V125M、T143C和T143M,其中最优突变株E123V,比酶活相比于WT提高了87%。进一步采用迭代饱和突变策略对三个正向突变位点进行组合突变,获得最优组合突变株EsiLeuDH-M3(E123V/V123M/T143C),比酶活相比于WT提高了306%。(3)进行了突变体结构与活性关系的分析。通过比较改造前后的蛋白结构,发现突变体EsiLeuDH-M3的底物结合口袋明显扩大,使得底物进入活性中心的空间位阻减小,提高了蛋白对于底物的接受程度,进而提高了酶的活性。对WT和突变体进行分子动力学模拟,结果表明突变体的氨基酸残基的波动更小,结构更加稳定,且更有利于与底物结合进行催化反应。(4)对WT和组合突变体EsiLeuDH-M3进行了酶学性质的比较和分析。WT和突变体EsiLeuDH-M3的最适反应条件为30℃,p H 9.5;突变体EsiLeuDH-M3的热稳定性明显提升,其半衰期超过2 h,同时发现Na和K对酶活有明显的促进作用,当浓度达到10 mmol·L时,相对酶活提高35%。动力学参数分析结果显示,突变体EsiLeuDH-M3对三甲基丙酮酸的k/K是WT的1.49倍,对辅酶NADH的k/K是WT的2.29倍。(5)利用重组工程菌催化三甲基丙酮酸制备L-叔亮氨酸。对催化条件进行了优化,结果表明p H 9.5、30℃为最适反应条件。在该条件下当底物浓度达到0.6 M时,WT催化的三甲基丙酮酸转化率仅为78%,而EsiLeuDH-M3催化的转化率几乎接近100%。构建了基于甲酸脱氢酶的NADH再生偶联系统,在该反应体系中当底物浓度为0.7 M时,其转化率达到了91%。

关键词：亮氨酸脱氢酶 L-叔亮氨酸半理性设计底物结合口袋

脂肪酶CAL-B定点突变及其酶促立体选择性研究

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脂肪酶CAL-B定点突变及其酶促立体选择性研究

作者：邬琼斯浙江大学

学位级别：硕士

近年来对酶的微观结构及催化机理有了更深入的研究,因此酶的定点突变改造提高催化特性成为活跃的研究领域之一。脂肪酶CAL-B催化酯化或水解反应中对醇底物具有非常好的立体选择性,是当前学术界和工业生产中应用最广泛的脂肪酶之一,CAL-... 详细信息

近年来对酶的微观结构及催化机理有了更深入的研究,因此酶的定点突变改造提高催化特性成为活跃的研究领域之一。脂肪酶CAL-B催化酯化或水解反应中对醇底物具有非常好的立体选择性,是当前学术界和工业生产中应用最广泛的脂肪酶之一,CAL-B的催化中心由Ser (105)-His (224)-Asp (187)组成的三联体、Thr (40)、Gln (106)组成的氧穴和特异性底物结合口袋构成,其中两个袋状的基质结合区分别结合酯类化合物结构上的酰基部分和羟基部分。本论文主要对CAL-B的特异性底物结合口袋热点残基进行定点突变,并研究其突变株的催化立体选择性调控规律,主要研究成果总结如下：论文将CAL-B活性中心醇口袋底部104位色氨酸突变为体积较小氨基酸;共获取CAL-B的突变株WB系列29种。其中WB2-WB8为单一位点突变株,WB9-WB12在WB7基础上将活性口袋入口处281位、282位氨基酸突变;WB14在WB9基础上将酸口袋中149位氨基酸突变;WB22在WB9的基础上再突变了144位的氨基酸;WB15-WB25(除WB22)在WB9基础上对酸口袋144位、149位氨基酸进行了一系列突变;经过基因测序检验基因序列并确认正确。实验主要纯化了5种突变株的酶液,通过SDS-PAGE凝胶电泳测定杂蛋白的含量明显减少,CAL-B及其突变株的分子量约33kDa;实验得到纯酶溶液,并直接在酶液中加入表面活性剂冷冻干燥获得固体酶粉。论文研究了CAL-B突变株催化乙酸苏合香酯水解合成手性仲醇的立体选择性,并用手性气相色谱分析实验结果。研究表明：野生型CAL-B催化乙酸苏合香酯水解选择R构型的底物水解,而CAL-B突变株优先选择S构型的底物水解,立体选择性发生了反转,其中WB2、WB7、WB11、WB14、WB15、WB16、 WB17 WB18、WB20、WB21等10种突变株的催化活性和立体选择性最优,一定反应时间内产率达30%至50%左右,ee值在78%以上,E值均大于20。论文进一步研究CAL-B突变株催化选择性与底物结构的关系,当底物手性碳原子上烷基链逐渐增长到5个碳原子时,突变株的催化效率逐渐提高而选择性逐渐下降,但野生型CAL-B催化活性快速减低;当苯基依次被溴、硝基、甲氧基取代后,突变株的催化活性迅速降低;活性口袋对催化效率和立体选择性均有明显影响。CAL-B突变株催化的底物适应性结果表明：CAL-B突变株有较广的底物范围,可催化一系列底物拆分合成手性仲醇。论文还研究了CAL-B突变株104位被突变回色氨酸后新酶WB26、WB27催化乙酸苏合香酯立体选择性与野生型一致,进一步证明了104位突变是选择性反转的重要因素。论文研究了CAL-B突变株催化1-苯乙醇与醋酸乙烯酯酰化拆分反应的立体选择性,主要考察了突变株WB2、WB7、WB11、WB14在甲苯中催化选择性酯化的反应活性与立体选择性。结果表明：CAL-B突变株催化选择性酯化中,主要选择S构型底物醇反应,4种突变株均表现出相同的立体选择性,且WB7和WB11催化性能最佳;CAL-B野生型则主要选择R构型底物醇反应;这与水解拆分反应的结果基本一致。论文还进行了动力学实验,测定了两种CAL-B突变株WB2、WB11催化不同浓度乙酸苏合香酯的初始反应速率,计算出酶促动力学常数Km与kcat,并与野生型对比分析。

关键词： CAL-B定点突变底物结合口袋立体选择性手性仲醇手性酯

酿酒酵母醛酮还原酶Gre2的结构与功能研究

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酿酒酵母醛酮还原酶Gre2的结构与功能研究

作者：鲍张智中国科学技术大学

学位级别：硕士

在生物体内,存在多种醛酮类物质,它们往往是在机体收到外界压力胁迫产生的。它们往往能够改变机体的正常的代谢活动,或是直接对机体产生毒害作用。为了应对这种压力刺激的作用,生物机体内往往产生相应的对抗措施,减少压力作用导致的中... 详细信息

在生物体内,存在多种醛酮类物质,它们往往是在机体收到外界压力胁迫产生的。它们往往能够改变机体的正常的代谢活动,或是直接对机体产生毒害作用。为了应对这种压力刺激的作用,生物机体内往往产生相应的对抗措施,减少压力作用导致的中间产物或具有毒害作用的代谢产物的积累。在这一过程中发挥作用的蛋白被称为应激蛋白。本文中所研究的酿酒酵母Gre2蛋白是一种应激蛋白,它是具有醛酮还原酶功能的氧化还原酶。氧化还原酶类一般分属于四个大的家族:长链醇脱氢酶家族,短链脱氢酶/还原酶家族（即SDR家族）,中链脱氢酶家族（MDR家族）和Aldo-Keto还原酶家族（即AKR家族）。由Gre2的一级序列和活性位点的保守性可把Gre2蛋白归类为SDR家族的成员。 Gre2蛋白质在压力诱导的情况下表达量大幅度升高。作为醛酮还原酶它可以催化多种二酮类、α-酮酯、β-酮酯、脂肪族和芳香族醛类、脂肪族酮类和羟基酮类发生还原反应,改变酿酒酵母体内的一些微环境,起到如抑制酵母出丝、解毒的作用。此外,Gre2能催化手性化合物的生成,它有可能在手性药物或手性化合物的生产中起着重要作用。在本文中,我们成功构建了Gre2的重组质粒,经表达和纯化后得到了Gre2的重组蛋白,并对其进行了晶体的初筛和优化。最终收集到了Gre2的apo form和Gre2与NADPH复合物的两套X-射线晶体衍射数据。我们采用分子置换法解析了Gre2和Gre2-NADPH的结构。其三维结构分为两个结构域,N-端结构域主要由Rossmann折叠构成,C-端结构域主要是由α+β的折叠模式。通过Gre2 apo form的结构与Gre2-NADPH复合物的结构的比较,我们发现,NADPH进入Gre2蛋白质分子的结合沟槽以后,Gre2两个结构域相互靠近,使得结合NADPH的中间沟槽变窄,这种“Induce fit”效应帮助蛋白质形成了更完善的底物结合口袋。同时NADPH上的烟酰胺环位于口袋的底部,也属于底物结合口袋的一部分。结合口袋的形成可以使得Gre2分子更容易的结合底物小分子,有利于催化反应的发生。 Gre2作为SDR家族的成员,其催化机制与SDR其它家族成员是非常相似的。Gre2拥有一个保守的催化三联体结构,它是由Ser126-Tyr165-Lys169三个氨基酸残基组成的。其中126位丝氨酸、165位酪氨酸可以与底物分子形成氢键,并在反应过程中提供质子,169位的赖氨酸残基则为催化反应的发生提供了一个碱性的环境。通过与SDR家族的其它同源结构的比较,我们发现Gre2相对而言具有较大的底物结合口袋,这一特点有利于Gre2分子结合更多种不同的底物,这为Gre2的底物多样性提供了结构上的解释。

关键词：酿酒酵母醛酮还原酶晶体结构底物结合口袋短链脱氢酶/还原酶家族复合物结构

探究卤醇脱卤酶HheC催化过程中四个Loop环的协同构象变化

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探究卤醇脱卤酶HheC催化过程中四个Loop环的协同构象变化

作者：赵智鹏电子科技大学

学位级别：硕士

卤醇脱卤酶(HHDHs)通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇水解转化为环氧化物,也可以接受不同的亲核试剂如CN、N、NO等催化环氧化物的开环反应,在处理有机卤化物污染物和合成手性药物中间体方面有着极高的研究价值。其中卤醇脱卤酶HheC的活... 详细信息

卤醇脱卤酶(HHDHs)通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇水解转化为环氧化物,也可以接受不同的亲核试剂如CN、N、NO等催化环氧化物的开环反应,在处理有机卤化物污染物和合成手性药物中间体方面有着极高的研究价值。其中卤醇脱卤酶HheC的活性中心包埋在酶分子内部,由四个Loop片段环绕而成,包括底物结合口袋和卤离子结合位点。先前的研究表明:1.卤离子的释放是催化脱卤反应中的限速步骤;***3片段为卤离子结合位点区域,在催化过程中对卤离子的结合和释放起到了关键作用,且该过程伴随有构象变化的发生;***4片段也被证明对催化活性和热稳定性有着显著调控作用。目前对Loop1和Loop2区域并没有进行深入探索,且对整个酶活性中心的构象变化的结构基础也没有具体阐述。本文通过实验手段与计算机技术相结合对酶催化过程中的构象变化和卤离子通道结构动力学进行较为系统研究,从蛋白质柔性变化的角度对上述关键问题进行了阐述。通过丙氨酸扫描找到Loop1和Loop2上对活性影响较大的关键位点D80,I81,F82,P84,F86,T134,W139和L142,其中D80A,I81A,F82A三个突变体无明显活性;其余五个位点突变为丙氨酸后活性均有2倍以上的显著提升。构建关键位点的饱和突变文库并进行活性筛选,结果表明D80,I81,F82三个位点未检测到有明显活性的突变体,表明这三个氨基酸对酶发挥催化功能的重要性;其余五个位点的饱和突变文库中筛选到了活性有不同程度提升的突变体。为了进一步探究构象变化对酶活性的影响,将位于同一Loop环上的关键位点优势突变体进行叠加,得到了一系列酶活性提高6-15倍的叠加优势突变体。通过分子动力学(MD)模拟技术对上述优势突变体的三维结构进行优化,同时对氨基酸之间的相互作用力进行分析。结果表明:关键位点的丙氨酸突变体P84A,F86A,T134A,W139A和L142A以及W139的一系列优势突变体的活性中心柔性增加,推测可能是通过减小残基侧链,使得活性空间变大,且与周围氨基酸的相互作用减弱,有利于蛋白质构象发生改变,进而导致酶的催化活性大大升高。该推断在多个活性提高的叠加突变体中(如P84A-F86A)也得到进一步证明。综上所述,底物结合口袋或者卤离子结合位点处Loop的柔性改变是酶活性升高的主要原因。通过对分子动力学模拟得到卤离子从活性中心释放到溶剂中的运动轨迹进行分析得到了处于不同时刻的Br-位置,得到其周围可能相互作用的氨基酸,并对卤离子的释放通道进行预测。结果发现Loop1区域上的F82-P84位点,Loop3区域上的P175-L178和Y185-Y187位点,Loop4的W249以及F12位点,对卤离子释放起到了关键作用。三维结构的比对也表明,这些位点在卤离子释放前后构象发生了较大改变。由此得出,这些氨基酸可能参与卤离子释放过程中所伴随的构象变化,相关研究可以对后续的卤醇脱卤酶改造奠定了理论基础。

关键词：卤醇脱卤酶HheC 蛋白质柔性构象变化丙氨酸扫描底物结合口袋卤离子释放通道分子间相互作用

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赖氨酸羟化酶的构效分析及分子改造研究

赖氨酸羟化酶的构效分析及分子改造研究

作者：朱梦露天津科技大学

学位级别：硕士

4-羟基赖氨酸是一种高度通用的药物中间体,可用于合成许多重要的药物,如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂和HIV蛋白酶抑制剂等,具有抗癌、抗菌和抗病毒等特性和作用。受自然环境因素的影响,在自然界中的4-羟基赖氨酸存在量很少,而传统的... 详细信息

4-羟基赖氨酸是一种高度通用的药物中间体,可用于合成许多重要的药物,如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂和HIV蛋白酶抑制剂等,具有抗癌、抗菌和抗病毒等特性和作用。受自然环境因素的影响,在自然界中的4-羟基赖氨酸存在量很少,而传统的化学合成的方法由于存在环境污染以及合成条件和步骤较为困难等问题,因此也很难实现规模化的生产;由此,通过生物酶法催化来生成4-羟基赖氨酸成为目前研究的热点。本论文鉴定了来源于Niastella koreensis的赖氨酸4-羟化酶(NkLH4)(Gen Bank ***99100.1),对其进行了蛋白表达纯化、产物鉴定、酶学性质表征等研究;同时对该酶进行了构效分析以及分子改造等研究。(1)将来源于Niastella koreensis的赖氨酸4-羟化酶(NkLH4),通过构建重组载体质粒的方法在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达。先后通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析,得到较高纯度(纯度>95%)的目的蛋白。通过研究该酶的酶学性质,得出NkLH4的最适催化缓冲液为HEPES缓冲液(p H=7.5),最适催化温度为25°C,最适催化底物为L-赖氨酸。通过高效液相色谱(HPLC)方法对催化产物进行鉴定,证明羟基化赖氨酸产物生成。(2)通过同源序列比对以及分析进化树系统,证明NkLH4是属于Fe(II)/αKG-GDOs酶家族的一种。以黄杆菌属细菌来源的L-赖氨酸4-双加氧酶KDO5(PDB ID:6EUO)作为模板对NkLH4进行同源建模,对NkLH4的结构进行了预测。通过对该酶的三维立体结构进行分析,得到了该酶的催化活性中心是由His173,Glu175和His309这三个氨基酸残基组成的面部催化三联体,其与活性中心的金属铁离子进行配位结合;辅因子αKG与面部催化三联体以及金属离子共同作用形成了八面体结构。(3)通过组合活性中心迭代饱和突变的方法,同时使用NDT简并密码子,对NkLH4构建了突变体文库,通过建立高通量筛选的方法,对突变体文库进行了快速筛选,获得了高活性突变体MT3(Q161N/T162A/F178Y/E260D)。相比较于WT,突变体MT3比酶活提高了4.16倍,K从0.65下降到0.09,k/K增加了24.97倍。(4)比较了WT和MT3催化活性口袋的差异,由于MT3的催化活性口袋构象更加的开放,对底物造成的阻遏作用会明显减少,使底物在MT3的构象中能够更加顺利的进入催化活性口袋。之后分别将底物L-赖氨酸,辅因子αKG和产物4-羟基赖氨酸对接到两个受体(WT和MT3)的催化活性中心,观察到了WT和MT3对这些配体所存在的不同的构象;将两个对接结构赖氨酸-WT和赖氨酸-MT3分别进行了300ns分子动力学模拟,结果表明,与WT相比,MT3对L-赖氨酸的结合能显著的增加(-36.58 vs.-52.78 kcal/mol)。同时比较了300 ns时间中底物赖氨酸在WT和MT3中不同的运动轨迹;在MT3中,由于氨基酸的突变(Q161N/T162A/F178Y/E260D)形成了一个更加开放的空间,导致氨基酸残基与底物之间的接触频率明显降低了约140倍,减少了其对底物的阻遏作用,导致MT3突变体的酶活性和催化效率更高。

关键词：赖氨酸4-羟化酶催化活性分子改造底物结合口袋分子动力学模拟

食线虫真菌体壁降解蛋白酶的晶体结构解析和催化活性的关键结构特征

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