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布氏锥虫来源内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的异源表达和活性鉴定

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食品与发酵工业 2018年第8期44卷 8-13页

作者：崔娟喜多岛敏彦王宁中西秀树高晓冬江南大学生物工程学院江苏无锡214122

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(Endo-β-N-acetylglucosaminidase,ENGase)是一类可以水解N-糖链中核心壳二糖之间β-1,4-糖苷键的糖苷内切酶,其中糖苷水解酶85家族(glycoside hydrolasefamilies 85,GH85)的ENGase除了水解活性之外还具有转糖基活性,能够以切除后再将均一的寡糖链转移到N-糖蛋白的β-N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)上的方式,改造医药糖蛋白的N-糖基化修饰。通过数据库检索,在布氏锥虫(Trypanosoma brucei)的基因组中找到了GH85家族ENGase的同源序列,并命名为Endo-Tb基因,对其克隆后在带有Nus融合蛋白的原核(***)表达载体上成功表达并纯化。检测到融合蛋白Nus-Endo Tb能够水解高甘露糖型和双天线的复合型糖链,但不能作用于三天线的复合型糖链。同时Nus-Endo Tb可以水解核糖核酸酶B和人类转铁蛋白上的N糖链。当用唾液酸糖肽(SGP)作为糖基供体,MU-GlcNAc作为糖基受体时,通过荧光基质底物四甲基伞形酮(MU)检测到Nus-Endo Tb具有转糖基活性。

关键词：内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶转糖基作用布氏锥虫 Nus-Endo Tb

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布氏锥虫C型凝集素类似蛋白的鉴定

中国预防兽医学报 2013年第10期35卷 825-828页

作者：张晶石星明齐仲强刘益民贾洪林杉本千寻中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黑龙江哈尔滨150001 白山市江源区牧业管理服务中心吉林白山134700 日本北海道大学人畜共患病研究中心日本北海道札幌001-0020 黑龙江省农业科学院博士后科研工作站黑龙江哈尔滨150001

C型凝集素在机体免疫系统中具有重要的作用。为了解布氏锥虫(***)基因组编码的C型凝集素类似蛋白(CLLPs),本研究在GeneDB数据库中通过软件鉴定了13种***基因组编码的CLLPs家族基因序列,并分析它们之间的遗传进化关系。同时,采用RT-PCR... 详细信息

C型凝集素在机体免疫系统中具有重要的作用。为了解布氏锥虫(***)基因组编码的C型凝集素类似蛋白(CLLPs),本研究在GeneDB数据库中通过软件鉴定了13种***基因组编码的CLLPs家族基因序列,并分析它们之间的遗传进化关系。同时,采用RT-PCR方法检测了其中3种CLLPs基因在血液阶段(BSF)***虫体内的转录。利用PCR扩增并在大肠杆菌中对所选3种基因进行表达,以表达的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。实验结果表明,本研究选择的3种CLLPs基因在BSF ***虫体内均能够进行转录;而通过间接免疫荧光检测表明所选的3种CLLPs基因中,只有一种CLLP(Tb5290)在***的BSF阶段和昆虫阶段(PCF)表达。本研究首次在***中鉴定了C型凝集素家族的新成员,为进一步了解CLLPs在***中的生物学功能的研究奠定了基础。

关键词：布氏锥虫 C型凝集素类似蛋白重组蛋白间接荧光抗体试验

布氏锥虫Trx-putative和Trx-like的抗氧化功能研究

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动物医学进展 2022年第1期43卷 23-30页

作者：李璇陈虹宇姜宁沈阳农业大学畜牧兽医学院辽宁沈阳110161

硫氧还蛋白(Trx)是一种氧化还原调节蛋白,参与锥虫抗宿主氧化,生物信息学分析发现Trx-putative和Trx-like含有与Trx一样的“Tioredoxin-like super family”结构域,为了阐明其抗氧化功能,通过原核表达方法获得其重组蛋白,重组蛋白免疫S... 详细信息

硫氧还蛋白(Trx)是一种氧化还原调节蛋白,参与锥虫抗宿主氧化,生物信息学分析发现Trx-putative和Trx-like含有与Trx一样的“Tioredoxin-like super family”结构域,为了阐明其抗氧化功能,通过原核表达方法获得其重组蛋白,重组蛋白免疫SD大鼠制备抗性血清,间接免疫荧光试验观察其在虫体内的表达情况,DTT/胰岛素还原法测定其二硫键异构酶活性,金属催化氧化法测定其体外保护DNA超螺旋活性,利用PCR点突变的方法分析其结构与功能的关系。结果显示,获得了纯度较高的重组蛋白,Trx-putative和Trx-like广泛分布于虫体胞质内;Trx-putative可以催化胰岛素二硫键的打开,而Trx-like不具备此功能;Trx-putative和Trx-like均可对氧化损伤的pUC19质粒产生保护,突变蛋白的二硫键异构酶活性显著降低,抗氧化作用减弱。这些结果提示布氏锥虫Trx-putative和Trx-like具有抗氧化功能。

关键词：布氏锥虫 Trx-putative Trx-like 二硫键异构酶活性抗氧化

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布氏锥虫马媾疫亚种体外培养的研究

中国兽医杂志 1991年第4期17卷 2-4页

作者：聂海洋方元叶万祥黄福林王元伦南京军区军事医学研究所南京军区总医院超微结构科

用小白鼠腹腔巨噬细胞滋养层系统和无细胞培养系统成功地培养了布氏锥虫马媾疫亚种。开始建立无细胞培养系统培养时,从第6天起每日补种少量滋养层细胞系统培养的虫体,于3周内逐步建立了适应于无细胞培养系统的锥虫群体。长期连续培养两... 详细信息

用小白鼠腹腔巨噬细胞滋养层系统和无细胞培养系统成功地培养了布氏锥虫马媾疫亚种。开始建立无细胞培养系统培养时,从第6天起每日补种少量滋养层细胞系统培养的虫体,于3周内逐步建立了适应于无细胞培养系统的锥虫群体。长期连续培养两种系统培养物的虫密度均可稳定保持在7—10.O×10~5/ml左右,虫体有规律地呈岛屿状密集分布。培养液内2—ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mM和20%,添加0.1mM次黄嘌呤可使培养物虫密度增加1倍左右,用烛罐可取代CO_2培养箱。体外连续培养120天。锥虫仍保持细长形态,具表面被膜,对小白鼠有感染性。

关键词：布氏锥虫马媾疫亚种体外培养

布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶的克隆表达纯化及活性测定

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中国生化药物杂志 2010年第1期31卷 14-18页

作者：姚璎杲光伟李大伟上海交通大学药学院上海200240

目的克隆布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶基因,并进行表达纯化及活性测定。方法通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中扩增出亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)基因,依次克隆入pBS-T克隆载体及pET21a(+)表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中通过条件优化... 详细信息

目的克隆布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶基因,并进行表达纯化及活性测定。方法通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中扩增出亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)基因,依次克隆入pBS-T克隆载体及pET21a(+)表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中通过条件优化后表达。表达产物用His-Bind亲和色谱纯化,并用免疫印迹进行鉴定。采用放射性同位素方法进行酶活性测定。结果PCR扩增得到3.2 kb的DNA片段,重组质粒pET21a(+)/LeuRS经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白的20%,纯化后蛋白纯度达85%,免疫印迹进行鉴定蛋白正确,酶活性测定计算出提纯物酶活性约为72 U/mL。结论已成功克隆表达纯化出布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶,并用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础。

关键词：布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶原核表达纯化酶活测定

布氏锥虫的需长醇-甘露糖转移酶可能定位于糙面内质网

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国际医学寄生虫病杂志 1994年第5期 239-240页

作者：许东红

非洲布氏锥虫不同表面糖蛋白所在的糖磷酸肌醇膜包含着几个甘露糖残基,磷酸长醇甘露糖被认为是它的前体。而磷酸长醇甘露糖本身可能是由一种需长醇-甘露糖转移酶所合成。本文将该酶的活性进行定性定位。实验结果显示:布氏锥虫甘露糖转... 详细信息

非洲布氏锥虫不同表面糖蛋白所在的糖磷酸肌醇膜包含着几个甘露糖残基,磷酸长醇甘露糖被认为是它的前体。而磷酸长醇甘露糖本身可能是由一种需长醇-甘露糖转移酶所合成。本文将该酶的活性进行定性定位。实验结果显示:布氏锥虫甘露糖转移酶可将GDP-[;C]甘露糖中甘露糖转移到磷酸

关键词：布氏锥虫 GDP 磷酸 RNA 磷化合物甘露糖转移酶微粒体

布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层培养布氏锥虫伊氏亚种

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中国兽医科技 1991年第4期21卷 10-12页

作者：聂海洋方元叶万祥王元伦南京军区军事医学研究所

用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层,以HEPES缓冲的添加20％兔或马血清、0.1％葡萄糖、0.2mmol 2-巯基乙醇、2mmol丙酮酸钠、0.1mmol次黄嘌呤(用马血清时)、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的含MEM非必需氨基酸的MEM培养液体外培养布氏锥... 详细信息

用小鼠腹腔巨噬细胞作滋养层,以HEPES缓冲的添加20％兔或马血清、0.1％葡萄糖、0.2mmol 2-巯基乙醇、2mmol丙酮酸钠、0.1mmol次黄嘌呤(用马血清时)、青霉素(100IU/ml)和链霉素(100μg/ml)的含MEM非必需氨基酸的MEM培养液体外培养布氏锥虫伊氏亚种获得成功。连续培养60天,培养虫体绝大多数仍保持细长形态,并对小鼠有很高感染性。文内还就实验方法和结果结合文献对一些问题作了讨论。

关键词：布氏锥虫体外培养小鼠巨噬细胞

布氏锥虫TatD-like DNase的表达与水解活性分析

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布氏锥虫TatD-like DNase的表达与水解活性分析

作者：陈虹宇沈阳农业大学

学位级别：硕士

布氏锥虫(Trypanosoma brucei,***)是一类具有广泛宿主的血液内寄生原虫,其三个亚种可以引起人类和动物的非洲锥虫病。人类的非洲锥虫病又叫作睡眠病(sleeping sickness),感染后期病人出现神经症状,嗜睡昏迷,如不及时治疗,死亡率高达百... 详细信息

布氏锥虫(Trypanosoma brucei,***)是一类具有广泛宿主的血液内寄生原虫,其三个亚种可以引起人类和动物的非洲锥虫病。人类的非洲锥虫病又叫作睡眠病(sleeping sickness),感染后期病人出现神经症状,嗜睡昏迷,如不及时治疗,死亡率高达百分之百;动物的非洲锥虫病也叫作那加那病(nagana),引起家畜营养不良,贫血消瘦,最后因极度衰竭而死,给畜牧业发展带来了巨大的经济损失。中性粒细胞在病原体感染部位分泌形成细胞外DNA网络(neutrophil extracellular traps,NETs)是机体捕获及杀伤入侵病原的重要先天性免疫机制。许多病原可通过表达和分泌DNase降解NETs中的DNA结构,从而逃避其免疫作用。我们对布氏锥虫基因组进行分析,发现布氏锥虫含有两个编码TatD-like DNase的基因,在锥虫种内具有高度保守的结构域,该蛋白质可能在锥虫的发育繁殖过程中起到重要作用,本课题的目的是研究布氏锥虫的TatD-like DNase是否和其他病原微生物的DNase一样,参与了虫体逃避宿主先天性免疫应答。首先先从NCBI数据库中获得布氏锥虫TatD-like DNase的两个基因序列(TbTatD-1155和TbTatD-1005),经过序列优化合成基因,将两个基因分别克隆到p GEX-4T-1和p ET-28a表达载体中,通过大肠杆菌表达系统制备重组蛋白质。以r TbTatD-1155-His和r TbTatD-1005-His为免疫原,分别免疫实验动物,制备多克隆抗体,通过亲和层析纯化特异性Ig G。利用制备的特异性Ig G,通过Western-blot和IFA实验对TbTatD-1155和TbTatD-1005在虫体中的表达和分布情况进行分析,发现两个蛋白质均表达在虫体的胞浆、细胞表面及鞭毛部位。将r TbTatD-1155-GST和r TbTatD-1005-GST分别与宿主DNA共同作用,进行功能分析,发现两种蛋白质均能够降解宿主DNA分子,具有脱氧核糖核酸酶活性。用PMA体外刺激中性粒细胞,产生NETs结构,分别加入r TbTatD-1155-GST和r TbTatD-1005-GST共同孵育,发现两种蛋白质均能够降解NETs中的DNA,破坏NETs结构。提示布氏锥虫的TatD可能参与虫体逃避宿主NETs产生的先天性免疫应答。本研究已经初步验证了布氏锥虫TatD-like DNase的分布及体外水解DNA和NETs的功能,为进一步研究该蛋白质与虫体致病的相关性和研究布氏锥虫的先天性免疫逃避机制奠定基础。

关键词：布氏锥虫免疫逃避 TatD-like DNase 多克隆抗体酶活性

布氏锥虫伊氏亚种体外培养的研究——布氏锥虫伊氏亚种的纯净培养

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中国兽医科技 1991年第5期21卷 5-8页

作者：方元聂海洋叶万祥王元伦黄福林南京军区后勤部军事医学研究所南京军区总医院

用无细胞培养系统培养我国3株水牛源布氏锥虫伊氏亚种取得成功。从开始培养的第7天起,向虫数已很少且不增殖的培养物中逐日补种少量滋养层细胞系统培养的培养日龄相同的同株锥虫,于10～17天间逐步建立了适应于无细胞系统的锥虫群体。整... 详细信息

用无细胞培养系统培养我国3株水牛源布氏锥虫伊氏亚种取得成功。从开始培养的第7天起,向虫数已很少且不增殖的培养物中逐日补种少量滋养层细胞系统培养的培养日龄相同的同株锥虫,于10～17天间逐步建立了适应于无细胞系统的锥虫群体。整个适应过程可分为4个阶段——一过性生长期、生长停滞期、初步适应期和完全适应期。至今已连续培养9个月,虫密度一般保持在1×10~6/ml左右,最高可达1.9×10~6/ml。锥虫在培养物内有规律地呈现岛屿状密集分布。长期培养的锥虫仍保持单一细长形态,具表面被膜、对小白鼠有致病力。对已适应于无细胞系统的锥虫,成功地进行了克隆、冻存、复苏后可直接继续培养。实验表明,培养液中2-ME和马血清的适宜浓度分别为0.3mmol和20％,添加0.1mmol次黄嘌呤可使虫密度增加约1倍。用烛罐可取代CO_2-培养箱。基础培养基贮存于-20℃,至少可使用76天。

关键词：锥虫布氏锥虫伊氏亚种培养