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尖孢镰刀菌西瓜专化型分子检测技术的建立及其效应子的初步鉴定

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尖孢镰刀菌西瓜专化型分子检测技术的建立及其效应子的初步鉴定

作者：曹月霞中国农业科学院

学位级别：硕士

目前,对于西瓜枯萎病的防治主要依靠化学药剂,但药剂残留严重,危害人类的健康,破坏全球环境。因此,加快西瓜枯萎病致病机理的研究是寻找有效防治方法的重要前提。效应子基因在病原菌侵染植物过程中起到关键的作用,对效应子基因进行初步... 详细信息

目前,对于西瓜枯萎病的防治主要依靠化学药剂,但药剂残留严重,危害人类的健康,破坏全球环境。因此,加快西瓜枯萎病致病机理的研究是寻找有效防治方法的重要前提。效应子基因在病原菌侵染植物过程中起到关键的作用,对效应子基因进行初步功能研究,有助于在分子水平上了解病原菌的致病机制,为西瓜枯萎病菌的防治提供理论依据。本研究主要包括以下几个方面:1.在对全基因组测序和重测序的基础上,基于生物信息学分析结果,筛选出115个西瓜专化型的特异基因组片段。对其中2个最长的基因组片段设计引物,经过常规PCR反应,筛选并鉴定出FOW-2F/FOW-2R、FOW-3F/FOW-3R、FOW-4F/FOW-4R和FOW-6F/FOW-6R引物,可快速检测出西瓜枯萎病菌。结合西瓜枯萎病菌特异性引物和尖孢镰刀菌通用引物,设计一个双重PCR体系,可准确、快速检测出FOW;2.在全基因组测序的基础上,对基因组进行组装和注释。其中,FOW1的N50达到了2.16M。通过生物信息学分析,筛选出FOW1可能的分泌蛋白有137个。再用BLASTZ对FOW0、FOW1和FOW2进行比较基因组分析,鉴定出FOW1可能的效应子有27个。再使用Kasaculator软件计算基因组区域受到的选择压力,有7个受到正选择压力的影响;3.利用FOW1美国标准菌株侵染西瓜感病品种,对侵染前、后的植株根部提取RNA,进行转录组测序。结合基因组分析和转录组分析,以及和CS-20、黄瓜和甜瓜的同源基因比较分析,比较培养状态下的RNA-seq数据,鉴定出14个差异表达的基因;4.经q RT-PCR验证分析,FOW1A2929、FOW1A0400、FOW1A8150、FOW1A2121和FOW1A5310效应子的表达量明显上调,可能是致病效应子。综上所述:本研究利用双重PCR快速检测出FOW;通过比较基因组分析,对FOW1的致病相关蛋白进行分析,预测出候选效应子;通过基因组和转录组分析,预测出FOW1A候选效应子,并利用q RT-PCR实验验证了预测结果。这些研究发现均为西瓜种植区的病害诊断和西瓜枯萎病菌的防治等工作提供了理论依据。

关键词：尖孢镰刀菌西瓜专化型西瓜枯萎病分子检测效应子生物信息学分析

稻秸蓝藻混合厌氧发酵沼液及其化学物质对尖孢镰刀菌西瓜专化型生长的影响

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生态学报 2012年第14期32卷 4585-4592页

作者：刘爱民徐双锁蔡欣卢存龙彭鹏安徽师范大学生命科学学院生态环境与生态安全安徽省高校重点实验室重要生物资源的保护和利用研究安徽省重点实验室芜湖241000

研究稻秸与蓝藻(1∶1)混合厌氧发酵的沼液及其微量化学成分对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusaruim oxysporum ***,FON)的孢子萌发、孢子数量、菌丝生长的影响。结果表明:40%浓度的发酵沼液即可100%抑制孢子萌发,20%浓度的沼液即可达到98.74%... 详细信息

研究稻秸与蓝藻(1∶1)混合厌氧发酵的沼液及其微量化学成分对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusaruim oxysporum ***,FON)的孢子萌发、孢子数量、菌丝生长的影响。结果表明:40%浓度的发酵沼液即可100%抑制孢子萌发,20%浓度的沼液即可达到98.74%的抑制菌体产生孢子,100%浓度的沼液显著抑制气生菌丝的生长;进一步GC-MS分析发现沼液有机物成分中烷类较多,存在微量的四氯化碳(CCl4)、六氯乙烷(C2Cl6)、1,1-二乙氧基乙烷(CH3CH(OCH2CH3)2)3种化学物质;三者都具有显著的抑菌效果,且随浓度的增加而增大,尤其CH3CH(OCH2CH3)2的抑菌效果最好;0.75%浓度的3种化学物质对孢子萌发的抑制率即可达到100%;在培养基中分别加入CCl4、C2Cl6、CH3CH(OCH2CH3)2的浓度为1.00%时,镰刀菌的产孢数量分别降低了5.67%、18.05%、8.72%;培养4d,三者对尖孢镰刀菌西瓜专化型气生菌丝生长的抑制效果均达到90.40%,效果显著。研究表明沼液中确实存在对病原微生物具有明显抑制作用的多种有效的化学成分,可作为防治病原菌的首选药剂。

关键词：尖孢镰刀菌西瓜专化型稻秸与蓝藻混合厌氧发酵沼液 CCl4 C2Cl6 CH3CH(OCH2CH3)2 抑菌率

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尖孢镰刀菌西瓜专化型真菌病毒多样性分析

尖孢镰刀菌西瓜专化型真菌病毒多样性分析

尖孢镰刀菌西瓜专化型携带Contg 1267真菌病毒分析

中国植物病理学会2019年学术年会

作者：韩涛梁佳媛陈垦西吴学宏中国农业大学植物保护学院

由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum ***）侵染引起的西瓜枯萎病是西瓜上发生最为广泛、最为严重的真菌病害之一。真菌病毒是指存在于真菌并能够在其中稳定复制的一类病毒,此类病毒主要分布在包括植物病原真菌在内的丝状真菌中... 详细信息

由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum ***）侵染引起的西瓜枯萎病是西瓜上发生最为广泛、最为严重的真菌病害之一。真菌病毒是指存在于真菌并能够在其中稳定复制的一类病毒,此类病毒主要分布在包括植物病原真菌在内的丝状真菌中,部分真菌病毒导致宿主植物病原真菌的致病力降低,具有一定的生防潜力。已有研究报道表明,尖孢镰刀菌甜瓜专化型（*** ***）中存在真菌病毒Fusarium oxysporum chrysovirus 1 （FocV1）,尖孢镰刀菌康乃馨专化型（*** ***）中存在真菌病毒Fusarium oxysporum *** virus （FodV1）。本研究采用高通量测序技术对90株尖孢镰刀菌西瓜专化型进行宏转录组检测,获得58个病毒相关信息,表明尖孢镰刀菌西瓜专化型中存在一定数量的真菌病毒资源;这些病毒的核酸类型呈现多样性,其中unclassified ssRNA占48.30%,+ssRNA占17.20%,dsRNA占13.80%,Retro-transcribing viruses占6.90%,dsDNA占6.90%,unclassified viruses占6.90%。通过序列比对和保守结构域的进化分析,明确这58个Contigs中有裸露病毒科（Narnaviridae）、双分病毒科（Partitiviridae）,以及植物病毒,如马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、帚状病毒科（Virgaviridae）（主要为烟草花叶病毒属Tobamovirus）;此外还有许多病毒的分类地位尚未明确。

关键词：西瓜枯萎病尖孢镰刀菌西瓜专化型高通量测序真菌病毒多样性

来源： cnki会议评论

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尖孢镰刀菌西瓜专化型携带Contg 1267真菌病毒分析

农杆菌介导尖孢镰刀菌西瓜专化型转化体系的建立及突变体筛选

中国植物病理学会2019年学术年会

作者：韩涛梁芷健陈垦西吴学宏中国农业大学植物保护学院

西瓜枯萎病（Fusarium wilt of watermelon）由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum ***）引起,并在西瓜上普遍发生的一种危害极大的真菌性病害。世界范围内已在多种镰刀菌中发现真菌病毒,其中大多数真菌病毒（已报道全基因组序... 详细信息

西瓜枯萎病（Fusarium wilt of watermelon）由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum ***）引起,并在西瓜上普遍发生的一种危害极大的真菌性病害。世界范围内已在多种镰刀菌中发现真菌病毒,其中大多数真菌病毒（已报道全基因组序列）主要来源于禾谷镰刀菌（***）。本研究通过高通量测序对90株尖孢镰刀菌西瓜专化型进行宏转录组检测,共获得58个病毒相关信息,并发现Contig 1267在大部分菌株中存在。为了探究含有Contig 1267真菌病毒在哪些菌株中存在,根据RNA病毒在复制过程中都会产生dsRNA复制体这一特性,通过提取并检测尖孢镰刀菌西瓜专化型的dsRNA,发现2018年从北京顺义地区采集的西瓜枯萎病病害样品中分离到一株尖孢镰刀菌西瓜专化型（编号为4-8）,其携带3条dsRNA片段,大小为2 300～4 000 bp。通过在NCBI网站上进行BLAST比对分析,3条dsRNA的部分cDNA序列分别与Alternavirus的真菌病毒相似性为30%～68%,但其分类地位尚未明确。选取含有Contig 1267真菌病毒的7株尖孢镰刀菌西瓜专化型,采用浸根法进行致病性试验,其平均发病率和平均病情指数均高于未含Contig 1267真菌病毒的菌株,但其致病力升高是否可能与Contig1267的存在有关还有待进一步研究进行确认。

关键词：西瓜枯萎病尖孢镰刀菌西瓜专化型 Contig 1267 致病力

来源： cnki会议评论

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河南农业科学 2012年第1期41卷 82-86页

作者：梁慎常高正赵卫星杨丽荣孙虎李晓慧杨帆全鑫徐小利薛保国河南省农业科学院园艺研究所河南郑州450002 河南省农业科学院植物保护研究所河南郑州450002

以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum ***)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮... 详细信息

以尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum ***)FO-11-06菌株为受体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,实现了农杆菌AGL1(含pATMT1)介导的西瓜枯萎病菌的转化,并研究了转化介质和pH值对转化效率的影响。结果表明:在25℃下,采用乙酰丁香酮(AS)浓度为200μmol/L、农杆菌OD600=0.15、尖孢镰刀菌分生孢子含量为1×106个/mL、pH值为5.1～5.8时可实现T-DNA的插入转化。当转化体系pH值为5.3时,转化效率最高,达到每106个分生孢子产生553个转化子。不同共转化介质对转化效率影响明显,玻璃纸和硝酸纤维素滤膜转化效率较高,每106个分生孢子获得551个和549个转化子,显著高于滤纸。通过转化,获得尖孢镰刀菌西瓜专化型转化子1 989个,对生长速度、菌落颜色和产孢量等性状进行分析,发现有46个性状特异的突变体。研究结果为进一步研究尖孢镰刀菌西瓜专化型的生长发育、致病机制和相关基因的功能奠定了基础。

关键词：尖孢镰刀菌西瓜专化型农杆菌 T-DNA插入转化转化效率

GFP标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染西瓜过程观察

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热带作物学报 2011年第10期32卷 1935-1939页

作者：李春强梁慧施夏亦荠彭明中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101 农业部热带作物生物技术重点实验室海南海口571101 香港浸会大学生物系

将绿色荧光蛋白基因转入西瓜尖孢镰刀菌FON中,并利用荧光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株侵染西瓜的过程。结果显示,转化子连续转接4代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入菌株FON中;利用GFP标记菌株在荧光共聚焦显微镜下观察... 详细信息

将绿色荧光蛋白基因转入西瓜尖孢镰刀菌FON中,并利用荧光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株侵染西瓜的过程。结果显示,转化子连续转接4代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入菌株FON中;利用GFP标记菌株在荧光共聚焦显微镜下观察其侵染西瓜苗的过程,发现在1/2 MS培养的西瓜苗中,FON经过48 h侵染即可进入西瓜的根维管束,第3天便进入茎维管束,第4天进入叶维管束(包括叶柄和叶脉);在土壤盆栽条件下,侵染后2 d FON进入西瓜的根维管束,第9天进入茎维管束,第11天进入叶维管束。培养基培养与土壤盆栽相比,培养基栽培FON侵染的速度更快。

关键词：尖孢镰刀菌西瓜专化型 GFP 西瓜侵染过程

外源酚酸对生防细菌拮抗尖孢镰刀菌西瓜专化型的影响

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农业科学研究 2022年第1期43卷 13-18页

作者：孙小涵马钰黄凯悦田彦梅顾欣宁夏大学农学院宁夏银川750021

为明确外源酚酸影响下生防细菌对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum ***,FON)的拮抗作用,在添加不同质量浓度邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的条件下,通过室内培养试验,定期测量FON和生防细菌菌落的直径,... 详细信息

为明确外源酚酸影响下生防细菌对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum ***,FON)的拮抗作用,在添加不同质量浓度邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸的条件下,通过室内培养试验,定期测量FON和生防细菌菌落的直径,结合对峙培养试验,计算不同外源酚酸影响下生防细菌对FON的抑菌率。结果表明:质量浓度为10~50 mg/L的邻苯二甲酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和混合酚酸对FON的生长均具有促进作用,对生防细菌的生物活性具有抑制作用;外源添加30 mg/L以上酚酸,可显著降低生防细菌的抑菌率,最高降幅达28.19%;生防细菌菌悬液浓度越低,酚酸对抑菌率的降低作用越强;混合酚酸对生防细菌的抑制作用较相同质量浓度的单一酚酸更强。在酚酸积累的环境中施用生防细菌应适当提高生防细菌浓度,以使生防细菌对病原菌的拮抗性保持在较高水平。

关键词：酚酸生防细菌尖孢镰刀菌西瓜专化型拮抗作用

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镰刀菌酸毒素对西瓜幼苗根细胞跨膜电位及叶细胞有关抗逆酶的抑制

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中国农业科学 2008年第9期41卷 2641-2650页

作者：吴洪生尹晓明刘东阳凌宁包蔚应蓉蓉朱毅勇郭世伟沈其荣南京农业大学资源环境学院

【目的】了解引起连作西瓜严重枯萎病的尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根和叶细胞有关生理功能的影响。【方法】用从尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株提取的真菌毒素镰刀菌酸处理西瓜幼苗,考察其对细胞根系跨膜电位和叶片中相关抗逆酶的影响。【结... 详细信息

【目的】了解引起连作西瓜严重枯萎病的尖孢镰刀菌毒素对西瓜幼苗根和叶细胞有关生理功能的影响。【方法】用从尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株提取的真菌毒素镰刀菌酸处理西瓜幼苗,考察其对细胞根系跨膜电位和叶片中相关抗逆酶的影响。【结果】高浓度镰刀菌酸处理西瓜幼苗12h后,根部细胞跨膜电位比对照下降61.9%～81.8%。不同浓度的毒素处理24h后,根系脱氢酶活性减少35.9%～90.9%。镰刀菌酸明显加速了叶片细胞膜脂质过氧化,24h后叶片丙二醛含量是对照的5.2～11.0倍。叶片中的苯丙氨酸解氨酶活性先增加,然后减少,6～12h活性最高,为对照的7.2～10.5倍。过氧化氢酶、超氧化物岐化酶、过氧化物酶也是先上升然后下降。过氧化氢酶活性在毒素处理3h后达到高峰,但再过3h后下降18.6%～52.5%。超氧化物岐化酶和过氧化物酶在毒素处理12h后达到最大,然后下降。叶片中的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在毒素处理后先快速上升,然后下降,最大活性分别出现在处理后12h和3h,分别是对照的10和15～30倍。【结论】镰刀菌酸强烈抑制了西瓜幼苗的根和叶细胞正常生理功能。破坏了叶片细胞的正常防卫系统和根细胞吸水和运输功能,引起细胞膜脂质过氧化生成大量的丙二醛,细胞结构遭受严重破坏,导致发病甚至细胞死亡。

关键词：镰刀菌酸细胞跨膜电位丙氨酸解氨酶还原氧系统脂质过氧化 β-1,3-葡聚糖酶几丁质酶根系脱氢酶西瓜尖孢镰刀菌西瓜专化型

西瓜尖孢镰刀菌FOV-135的绿色荧光蛋白基因转化

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福建农业学报 2009年第6期24卷 521-524页

作者：肖荣凤朱育菁李燕丹黄素芳刘波福建省农业科学院农业生物资源研究所福建福州350003

建立并优化了PEG～CaCl2介导的原生质体转化体系，成功地将绿色荧光蛋白基因转入到西瓜尖孢镰刀菌FOV-135菌株中。转化子连续转接5代能够稳定遗传，荧光强度良好，每微克质粒DNA可获得4～6个性状稳定的转化子。PCR验证也表明gfp基因已... 详细信息

建立并优化了PEG～CaCl2介导的原生质体转化体系，成功地将绿色荧光蛋白基因转入到西瓜尖孢镰刀菌FOV-135菌株中。转化子连续转接5代能够稳定遗传，荧光强度良好，每微克质粒DNA可获得4～6个性状稳定的转化子。PCR验证也表明gfp基因已转入到菌株FOV-135中。

关键词：尖孢镰刀菌西瓜专化型绿色荧光蛋白原生质体转化