检索结果-南通市图书馆

作者：巫坚广西大学

学位级别：硕士

细菌小rna (small rnas, srnas),也称为非编码rna(non-coding rnas, ncrnas)和调控rna (Regulatory rna),是一类大小通常在50～500nt之间,不编码蛋白,但是具有独立功能的rna分子。研究表明,细菌小rna参与了细胞糖代谢、金属离子转运、... 详细信息

细菌小rna (small rnas, srnas),也称为非编码rna(non-coding rnas, ncrnas)和调控rna (Regulatory rna),是一类大小通常在50～500nt之间,不编码蛋白,但是具有独立功能的rna分子。研究表明,细菌小rna参与了细胞糖代谢、金属离子转运、群体感应、致病、以及包括对酸碱等环境胁迫应答等多方面的细胞生理过程。最近十几年来,由于有效鉴定小rna方法的建立,越来越多的细菌小rna被鉴定,目前已经发现了上千个细菌小rna,但只有少数细菌小rna的生物学功能被确定。十字花科黑腐病菌,也叫野油菜黄单胞菌致病变种(Xanthomonas campestris ***, Xcc)是引起十字花科植物(其中包括重要的蔬菜如萝卜、白菜、甘蓝及重要的油料作物油菜等)发生黑腐病的病原菌。为了寻找Xcc中参与酸碱胁迫应答的小rna,本实验室之前通过采用高通量深度测序方法,初步鉴定了500多个表达受酸碱影响的候选小rna,但这些候选小rna是否真正存在、表达是否真的受酸碱影响、以及它们的生物学功能还需要进一步研究。在本研究中,我们从中选取了十个候选小rna(重新命名为sRXCC-25到sRXCC-34)作为研究对象,首先采用三引物RT-PCR法证实它们的存在,然后用半定量RT-PCR方法确定它们的表达是否受受酸碱影响,最后通过构建它们的过量表达株和缺失突变体并进行表型分析来确定它们的生物学功能。三引物RT-PCR结果证明这十个小rna是真实存在的。接着我们还用链特异PCR方法确定了它们的转录方向。半定量RT-PCR结果显示,所有十个目的小rna的表达均受到酸影响,其中五个小rna(sRXCC-26至sRXCC-30)的表达同时还受到碱的影响。到目前为止我们已经获得了所有十个目的小rna(sRXCC-25到sRXCC-34)的过量表达株(分别命名为OE25到OE34),以及六个小rna(sRXCC-25)、 sRXCC-29、sRXCC-30、sRXCC-31、sRXCC-33和sRXCC-34)的缺失突变体(分别命名为DM25、DM29、DM30、DM31、DM33和DM34)。我们对所构建的所有缺失突变体和过量表达株的以下表型：(1)对酸碱的耐受能力、(2)胞外多糖产量和胞外酶活性、(3)对SDS和NaCl的耐受力、(4)对重金属的耐受能力、(5)游动能力、(6)生物膜形成、(7)生长、(8)在寄主植物上的致病力、以及(9)在非寄主植物上引起高敏反应(HR反应)能力等表型进行了检测,并和野生型菌株和带有空的过量表达载体pBBad18K的野生型菌株的表型进行分析比较。结果显示,除了在平板检测实验中,所有十个目的小rna的过量表达株对Zn2+和Ni2+的耐受力均比带有空的过量表达载体的野生型菌株(WT/pBBad18K)的明显下降外,其余所有完成检测的过量表达株和缺失突变体的全部检测表型和对照菌株一致。这些结果表明,这十个小rna在Xcc对Zn2+和Ni2+的耐受过程中起重要作用。综上所述,本工作验证了十个表达受酸碱影响的Xcc小rna,并发现它们参与了Xcc对Zn2+和Ni2+的耐受过程。这些结果为研究小rna在Xcc中的功能和作用机理提供了有用的材料。

关键词：十字花科黑腐病菌小rna 功能酸碱胁迫过量表达缺失

铝毒害对雪柑和酸柚根系小rna差异表达的影响

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铝毒害对雪柑和酸柚根系小RNA差异表达的影响

作者：周洋飞福建农林大学

学位级别：硕士

在酸性土壤上,铝(Al)毒是限制植物生长的主要因素,微摩尔水平的Al就可以迅速抑制植物根系的生长。柑橘主要种植于为热带、亚热带和温带地区的酸性土壤中,容易遭受Al毒危害。本研究以Al处理(1m M Al Cl3·6H2O)和对照(0m M Al Cl3·6H2O... 详细信息

在酸性土壤上,铝(Al)毒是限制植物生长的主要因素,微摩尔水平的Al就可以迅速抑制植物根系的生长。柑橘主要种植于为热带、亚热带和温带地区的酸性土壤中,容易遭受Al毒危害。本研究以Al处理(1m M Al Cl3·6H2O)和对照(0m M Al Cl3·6H2O)处理15周的雪柑和酸柚实生苗为试验材料,从生理生化和分子水平研究了两个不同柑橘品种耐铝性差异的可能机制,得出以下三点结论:***对雪柑和酸柚实生苗生长的影响与对照相比,Al处理雪柑和酸柚的植株变矮小,侧根数量减少,并且酸柚的症状更明显。Al处理显著降低了酸柚实生苗茎、叶、地上部和全株的干重,显著提高了酸柚的根冠比,而对雪柑实生苗没有明显的影响。***对雪柑和酸柚根茎叶生理生化的影响与对照相比,Al处理增加了雪柑和酸柚根、茎、叶的Al含量,并且酸柚茎、叶中Al含量的增加幅度均高于雪柑;显著降低了雪柑和酸柚根、茎、叶的磷(P)含量,并且雪柑根叶中P含量均高于酸柚;Al处理降低了酸柚根的S含量,但显著提高雪柑茎和叶的S含量;Al处理显著增加酸柚根中O2.-、H2O2和TBARS的含量,但对雪柑的影响不明显。***处理对雪柑和酸柚根系mi rnas的差异表达及与mi rna代谢相关基因表达的影响通过Illumina测序,本研究从Al处理雪柑和酸柚根系中分离了12个和16个差异表达的mi rnas,经过靶基因预测、基因GO分析和pathway通路等生物信息学分析后得出不同柑橘品种耐Al能力差异的可能原因归纳如下:(a)下调mi R160的表达,促进不定根和侧根的发育;(b)下调mi R477、mi R397和mi R398的表达,上调与逆境胁迫响应和信号转导相关靶基因的表达(SGT1、PLC和AAO);(c)降低mi R3627的表达,增加柠檬酸的分泌;(d)降低mi R482和mi R172的表达,增强植物碳水化合物代谢和硫代谢;(e)提高HEN1、SE1、AGO1、HASTY1、HYL1和HESO1的表达,更灵活的调控mi rna的代谢。总之,本研究探讨了不同柑橘耐铝性差异的生理生化和分子机制,研究结果为进一步分析柑橘耐铝机制提供了思路,为柑橘高产优质栽培提供科学依据。

关键词：柑橘耐Al 元素含量小rna 调控

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十字花科黑腐病菌十二个小rna的功能鉴定

十字花科黑腐病菌十二个小RNA的功能鉴定

作者：覃振萍广西大学

学位级别：硕士

细菌小rna (small ***),又被称为非编码小rna (non-coding rna,ncrnas),是指大小一般在50-500nt之间,不编码蛋白质,能独立行使一定的功能但又不同于核糖体rna(rrna)和转运rna(trna)的rna分子。研究发现小rna广泛存在于各种生物中,它们... 详细信息

细菌小rna (small ***),又被称为非编码小rna (non-coding rna,ncrnas),是指大小一般在50-500nt之间,不编码蛋白质,能独立行使一定的功能但又不同于核糖体rna(rrna)和转运rna(trna)的rna分子。研究发现小rna广泛存在于各种生物中,它们作为转录后调控因子在细菌的碳源代谢、铁代谢、群体感应、应激反应、以及致病过程等过程中发挥重要的调控作用。目前,尽管小rna在动物/人的病原细菌的致病过程中的重要性已得到充分确认,但它们在植物病原细菌的致病过程中的作用还未被广泛认知。最近,本实验室采用rna深度测序(deep rna sequencing)方法在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris ***,Xcc)8004菌株(以下称Xcc8004),中进行了小rna鉴定,发现了几百个候选小rna,其中80多个已经通过Northern杂交及RT-PCR(reverse transcription-PCR验证。为了研究这些小rna的功能,在本研究中通过构建缺失突变体及过量表达株的方式.研究了十二个小rna(srna-Xcc7,***-Xcc14. srna-Xcc15,***-Xcc17和srna-Xcc18的生物学功能。到目前为止已经获得了四个小rna (***-Xcc8. srna-Xcc9和srna-Xcc10的缺失突变体以及九个小rna(srna-Xcc9,srna-Xcc11, srna-Xcc12, srna-Xcc13, srna-Xcc14, srna-Xcc15, srna-Acc6, srna-Xcc17和srna-Xcc18)的过量表达株,并分别检测了这些小rna缺失突变体和过量表达株在基本培养基上的生长状况、胞外酶活性、胞外多糖产量、致病性、HR反应、游动能力和聚集生长情况、金属离子耐受性、耐渗透压能力、对蛋白质变性剂的耐受能力等表型。结果发现：(1) srna-Xcc9的缺失突变体及其过表达株的致病力比野生型菌株显著下降;(2) srna-Xcc9的过量表达株的胞外淀粉酶及胞外蛋白酶活性比野生型菌株显著下降,但其它表型与野生型菌株无明显差异;(3) srna-Xcc17的过量表达株的胞外淀粉酶活性比野生型菌株显著下降,其它表型与野生型菌株无明显差异;(4) srna-Xcc7, srna-Xcc8, srna-Xcc10的缺失突变体,及srna-Xcc11, srna-Xcc12, srna-Xcc13, srna-Xcc14, srna-Xcc15, srna-Xcc16, srna-Xcc18的过量表达株的表型和野生型菌株无明显差异。这些结果说明：(1)小rna srna-Xcc9可能参与Xcc的致病以及胞外淀粉酶和胞外蛋白酶的产生过程;(2)小rna srna-Xcc17可能参与Xcc的胞外淀粉酶的产生过程。本研究为深入研究srna-Xcc9, srna-Xcc17的功能以及其作用机理奠定了的基础

关键词：小rna 十字花科黑腐病菌缺失突变体过量表达株功能

拟南芥种子发育过程小rna深度测序数据的分析

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拟南芥种子发育过程小RNA深度测序数据的分析

作者：陈冬菊福建农林大学

学位级别：硕士

小分子非编码rna,包括microrna (mirna)和sirna,在植物的转录后水平上起着重要的调控作用。利用深度测序技术检测模式植物中重要的小rna,分析它们的表达模式和功能,是当前发现和研究植物小rna的一条重要途径。为了探究小rna,(特别是miR... 详细信息

小分子非编码rna,包括microrna (mirna)和sirna,在植物的转录后水平上起着重要的调控作用。利用深度测序技术检测模式植物中重要的小rna,分析它们的表达模式和功能,是当前发现和研究植物小rna的一条重要途径。为了探究小rna,(特别是mirna)在拟南芥种子发育中所起到的作用,本研究对拟南芥种子三个发育时期(9 DAP,12 DAP,15 DAP)的小rna深度测序数据进行生物信息学分析,主要结果如下：(1)三个种子发育时期的样品经SOLiD测序共获得8,630,738条能完全定位到拟南芥基因组上的小rna序列,其中2,799,643条为唯一序列,表明拟南芥种子发育过程中存在复杂的小rna群体。(2)对小rna的长度及种类进行分析,发现24 nt长度的小rna的数量最多,其中已知的mirna基因的读段数占到了总序列数的28.66%,表明有许多的已知mirna在种子发育过程中表达。(3)对已知的拟南芥mirna进行鉴定,共发现了115个mirna,它们属于157个不同的mirna基因,并且鉴定到103个mirna*。(4)用生物信息学方法共预测到88个新的mirna和40个mirna*以及187个可能的靶基因。(5)对三个种子发育时期的样本进行统计检验,发现45个mirna基因存在差异表达,其中35个属于保守的mirna家族,暗示这些保守的mirna基因在拟南芥种子发育过程中起到了重要的调控作用。(6)将预测的新mirna与其可能的靶基因在三个种子发育时期的表达水平进行比较分析,发现13个新的mirna基因与12个可能的靶基因之间的表达水平存在负相关关系。根据靶基因的注释,推测这些新的mirna可能通过调控靶基因的表达而影响种子的发育。

关键词：深度测序小rna mirna 拟南芥种子发育表达模式

日本三角涡虫转录组、再生表达谱及小rna谱的鉴定与分析

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日本三角涡虫转录组、再生表达谱及小RNA谱的鉴定与分析

作者：秦云飞郑州大学

学位级别：硕士

组织的再生一直是现代发育生物学中一个神秘的话题。正是由于研究再生的一些动物,如水螅或涡虫并不是标准的实验室模式生物才滞后了对再生的研究,因此利用现代分子遗传学技术来研究再生机制受到了部分制约。目前,再生被认为与胚胎发育... 详细信息

组织的再生一直是现代发育生物学中一个神秘的话题。正是由于研究再生的一些动物,如水螅或涡虫并不是标准的实验室模式生物才滞后了对再生的研究,因此利用现代分子遗传学技术来研究再生机制受到了部分制约。目前,再生被认为与胚胎发育过程具有相似的分子机制。而涡虫再生是再生中研究最受关注的课题之一,因为其体内具有丰富的被称作neoblasts的干细胞群使得它在失去的身体部分组织后能表现出非凡的再生能力,而正是这种超强的再生能力,使得它日益成为研究再生和干细胞生物学的经典模式生物。在近几年中,新一代测序技术作为高通量序列测定的主要方法,大大提高了基因的发现的效率,速度和准确度。通过Illina系统来对生物体的转录组进行测序时,一般需要具有完整基因组信息,使得测序所产生的短片段能依据基因组信息有效地被组装和定位。转录组测序技术目前已经应用到人类,酵母,小鼠和拟南芥等模式生物中,从而开创了对整个转录组基因表达量分析和突变等的研究。Illumina的技术还可以利用特定的软件,用生物信息学软件来对没有参考基因组信息的物种进行从头组装和注释。此外,高通量测序技术在DGE系统和小rna的测序中也有着很广泛的应用。在本次实验中,我们报道了日本三角涡虫转录组高通量测序的信息。通过测序,我们一共获得了11,913,548条转录组的短序列,通过一系列组装后,这些短序列被组装成37,218条unigeneso之后,我们又通过不同的蛋白数据库对这止匕unigenes进行组装。据我们所知,本次实验是对三角涡虫转录组的首次研究。此外,我们还基于标签的数字基因表达系统（DGE）研究了在不同再生时期下涡虫转录水平的变化情况。我们在研究涡虫再生过程中转录水平变化的检测时是通过使用基于短标签的DGE系统,我们选取了三个不同的再生时期：再生0天,再生1天和再生3天。最终,我们每组分别获得了超过350万个short tags,并确定了在各个再生阶段中的差异表达标签。在对这些标签序列与参考基因序列对比后,我们得到了数以百计的差异变化的基因。本实验结果为研究涡虫再生转录信息的变化提供了一个相当全面的基因背景,对于研究涡虫再生具有深远的意义。近年来,小分子rna分子在许多方面受到越来越多的关注和研究,其中也包括在再生和干细胞生物学等领域。在本实验中,我们通过高通量测序手段大规模的克隆和鉴定了正常和再生的日本三角涡虫小rna （srna）信息。序列分析表明,在涡虫中18nt到40nt之间的srna主要是microrna （mirna）和pirna。本实验一共搜寻到了209条保守的mirna和12个新的mirna,并对新的mirna进行了实验鉴定。我们还比较了再生组和正常组的mirna和pirna的表达境况,进行了序列的差异性分析,并得出了一些再生差异性的序列。值得注意的是,我们还根据mirna和其靶mrna的负相关关系,针对差异的mirna,构建了涡虫靶预测的信息库,提高了靶预测的准确性。本次实验也是首次针对srna对日本三角涡虫进行再生的研究。

关键词：涡虫日本三角涡虫再生高通量测序转录组数字基因表达谱小rna

非编码小rna介导的OsSPL基因家族调控网络探究

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非编码小RNA介导的OsSPL基因家族调控网络探究

作者：王睿南京农业大学

学位级别：硕士

SQUAMOSA promoter-binding-like(SPL)编码一类植物中特异的转录因子家族,是调控植物生长发育、抗逆抗病的重要调控因子。水稻中已经发现19个SPL转录因子,在调控水稻分蘖、种子发育、穗型建成,逆境响应等生命过程中发挥了关键的作用。mi... 详细信息

SQUAMOSA promoter-binding-like(SPL)编码一类植物中特异的转录因子家族,是调控植物生长发育、抗逆抗病的重要调控因子。水稻中已经发现19个SPL转录因子,在调控水稻分蘖、种子发育、穗型建成,逆境响应等生命过程中发挥了关键的作用。mirna156对OsSPL的保守调控揭示了小rna对OsSPL调控的重要作用。近年来,陆续发现mirna529、mirna535也能够靶向OsSPL基因,表明了 OsSPL上游的调控复杂性。从降解组验证结果来看,除了 3个mirna家族之外,仍存在其他的非编码rna能够调控OsSPL基因。因此,本研究从127个小rna测序数据中检测到162,412个不同的小rna序列,利用17个降解组测序数据,检测到其中3,173个不同小rna对OsSPL的切割活性。基于降解组测序数据,对这些小rna及其切割位点进行了统计分析,并构建了以小rna和OsSPL靶标关系为核心的调控网络,以期获得可利用的调控模块并发掘其潜在的育种应用价值。主要研究结果如下:1、通过传统的基于小rna(以mirna为例)表达分析方法挖掘功能小rna存在容易忽略无表达特征但存在靶基因的mirna的缺陷,本文采用了基于降解组测序的小rna数据挖掘策略。首先将有差异表达但没有发现靶基因的mirna设计为假阳性个体,发现靶基因但没有检测出差异表达的设计为假阴性个体,并以此评估计算其ROC曲线,发现其在3个示例物种中该方法均表现出较高的假阴性,且ROC曲线下面积均在0.5以下。而基于降解组测序数据则可以调控活性变化来衡量小rna的功能,避免了依赖于表达分析造成的假阴性,同时还能提供具体的切割值和位置,为揭示小rna的功能和作用机制奠定基础。2、对来自不同实验的127个公共小rna测序数据进行数据清洗,统计各个文库的组织来源,处理方法,测序深度等基本信息。通过分类,共整理出来自根,茎,叶,幼苗,种子,幼花,幼穗等7个组织中的小rna测序数据,本研究只保留降解组验证切割评级在Cat以上,且存在任一数据集中检测到读数大于1的小rna。将初步筛选后小rna去冗余并计算表达量,凡能检测到读数值的都进行保留,并以“srna#n”形式进行简单不重复命名,其中n为1～162,412的不重复整数。在psrnaTarget平台上预测小rna-OsSPL靶向关系(Small rna-Target Interaction,STI),获取预测的调控关系信息,再利用所有已有的降解组文库对这些预测关系进行验证,获得包括3,173序列不同的小rna、共3460对不同的切割关系,以此为基础构建网络并分析。3、对不同OsSPL家族成员小rna切割位点多样性及切割活性比较,发现不同OsSPL在不同组织间存在降解丰度和小rna切割位点差异,并依据检测到切割丰度的降解组数量,进行不同成员间保守和特异,及组织特异和保守的STI和位点的分类。由此发现其中以mirna156为主的microrna在2个以上组织中都能够检测到切割活性,尽管并未检测到可以切割所有的OsSPL,但仍然能够靶标到大量OsSPL,特异性差;其他small rna则具有较高的组织特异性和OsSPL特异性,如phasirna,其大部分在花、穗等生殖器官中切割更为活跃;OsSPL15受到大量冗余小rna的特异调控。4、以降解组间保守的OsSPL3和OsSPL8为例,我们发现部分OsSPL存在组织间的调控模式差异,即不同切割位点的组合,如OsSPL3;其他则并没有表现出切割模式的差异,总在同一个小区间内发生切割,如OsSPL8。5、对基于降解组的小rna-OsSPL关系进行共表达验证:利用bowtie将这些小rna重新比对到基因组,并整理为小rna的位置注释文件,再以小rna位置注释文件为索引,用ShortStack计算小rna在特定样本中的表达,计算了它们与OsSPL共表达相关系数,从表达方面来补充说明小rna调控OsSPL的复杂多变:以cytoHubba筛选出的边界权重最高的50关键节点为例,mirna表达大多与OsSPL呈负相关,其他sirna则多与OsSPL呈正相关。6、从三千份水稻重测序数据平台(RFGB)中查找发生在小rna切割位置的SNPs,从RFGB中获取对应单倍型的表型信息,包括籽粒大小,穗长,千粒重等11个不同的水稻性状。以OsSPL14/IPA1和OsSPL18为例,IPA1中检测到一个尚未被利用在小rna切割位点附近发生的SNP,且对千粒重、籽粒长短、幼苗株高高低等性状产生影响;而在OsSPL18中一个已经报道与粒重有关的SNP也被检测到发生在小rna切割位置附近,且籼粳差异较大。

关键词：小rna OsSPL 切割位点降解组调控网络

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伤寒沙门菌小rna T64的相关功能研究

伤寒沙门菌小RNA T64的相关功能研究

作者：徐慧江苏大学

学位级别：硕士

目的:随着生物信息学预测和分子生物学技术的不断发展,在细菌基因组内发现了越来越多的小rna(small rna,srna),其作为基因表达的调控因子,在细菌的生命活动中发挥着关键作用。T64为本研究组在伤寒沙门菌中新发现的srna,其基因位置和表... 详细信息

目的:随着生物信息学预测和分子生物学技术的不断发展,在细菌基因组内发现了越来越多的小rna(small rna,srna),其作为基因表达的调控因子,在细菌的生命活动中发挥着关键作用。T64为本研究组在伤寒沙门菌中新发现的srna,其基因位置和表达特性都已经在前期研究中得到论证,本论文拟对该小rna在伤寒沙门菌中的相关功能进行探究。方法:1.T64高表达菌株的制备。根据前期研究获得的srna T64基因序列,在转录起始端和终止端处分别设计上下游引物,扩增获得编码T64的基因片段,经Nco I和Hind III双酶切,与同样双酶切的质粒pBAD/Myc-His A定向连接,并导入大肠杆菌DH5α。筛选出阳性克隆,从中提取重组质粒电击导入伤寒沙门菌野生株,作为srna T64高表达菌株。2.在hfq基因缺陷株中高表达T64。提取携带编码T64的基因片段的重组质粒,电转导入伤寒沙门菌hfq基因缺陷株,在hfq基因缺陷株中诱导T64高表达。3.T64高表达菌株生长曲线测定。将T64高表达菌株和空质粒对照株分别在TSB中振荡培养,每隔1 h检测1次菌液的OD600值,连续测量10 h。以生长时间为横坐标,OD600值为纵坐标绘制生长曲线,比较T64高表达菌株和空质粒对照株的生长情况。4.T64高表达菌株的动力实验。将T64高表达菌株和空质粒对照株培养至对数期(OD600 0.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5 h,以诱导T64表达,分别取T64高表达菌株和空质粒对照株的1μl菌液点种于含0.3%琼脂糖的LB或TSB半固体培养基,37°C培养12 h后测量动力圈直径,比较细菌的动力。5.实时荧光定量pcr检测基因转录水平。细菌经过培养后,以trizol法提取总rna,用特异性引物进行逆转录及实时荧光定量pcr,分析野生株在不同培养基中培养时t64的表达差异,以及t64高表达菌株中生物膜形成相关靶基因的转录水平变化。6.生物膜形成实验。将细菌培养至对数期(od6000.4),加入0.2%(w/v)的阿拉伯糖继续培养0.5h,以诱导t64表达,取菌液接种于96孔板,30°c静置4天,结晶紫染色后570nm比色定量。7.刚果红实验。过夜培养的t64高表达菌株和空质粒对照株菌液离心收菌,用pbs重悬菌体沉淀并调节菌量一致。滴种5μl重悬液到刚果红平板上,28°c静置3天,观察菌苔形态。结果:1.酶切、pcr验证和序列分析结果显示,成功构建阳性重组载体pbad-t64,并将其导入***野生株,成功制备srnat64高表达菌株(wt+pbad-t64)。***验证结果显示,伤寒沙门菌hfq基因缺陷株中成功导入了pbad-t64,即菌株Δhfq+pbad-t64制备成功。3.生长曲线结果表明,在一定时间内,t64高表达菌株生长速度明显快于空载体对照株。4.动力实验表明,在tsb半固体培养基中,t64高表达菌株的动力较空质粒对照株稍稍减弱;而在lb半固体培养基中,两者动力几乎无差别。5.荧光定量pcr结果显示,野生株在lb和tsb两种培养基中培养时t64的表达量有差异,在tsb中t64的表达量明显升高;在t64高表达菌株中,生物膜形成相关靶基因fimy、pilp、stcb和stgd转录均上调。6.生物膜形成实验结果显示,t64高表达菌株的生物膜形成能力强于空载体对照株;回补T64基因后,T64缺陷株生物膜形成能力基本恢复;hfq基因缺陷株即使高表达T64也难以形成生物膜。7.刚果红实验结果显示,T64高表达菌株和空质粒对照株都只能形成光滑和白色的菌苔,未展现出与生物膜形成对应的菌落形态。结论:伤寒沙门菌小rna T64的表达受到培养条件的影响,高表达T64后能促进细菌的生长,并且能在一定程度上抑制细菌的动力。T64有助于伤寒沙门菌形成生物膜并促进生物膜形成相关基因的表达,但不足以消除hfq基因缺失对生物膜形成的抑制作用。

关键词：伤寒沙门菌小rna T64 生长动力生物膜形成

3型猪源呼肠孤病毒的小rna深度测序技术鉴定及其TaqMan qPCR检测方法建立和应用

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3型猪源呼肠孤病毒的小RNA深度测序技术鉴定及其TaqMan qPCR检测...

作者：武松山东北农业大学

学位级别：硕士

世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒... 详细信息

世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒检测方法鉴定未知病毒或新出现的病毒周期长、耗费较大量人力物力。小rna深度测序技术属于二代测序技术,在对病毒没有了解的情况下便可以完成对未知病毒或者新型病毒的鉴定,并且有利于进一步建立该病毒的特异性诊断方法。哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)在自然界分布广泛,人和动物感染MRV非常普遍,可引起呼吸道、肠道症状和心肌炎。动物源分离的MRV毒株与能够引起人类疾病的MRV毒株亲缘关系很近,对公共安全存在重大威胁。为了对MRV-3进行流行病学调查、病原诊断和防控提供技术支持,实现对MRV-3毒株检测监控。本研究通过小rna深度测序技术对未知病毒样本小rna测序共获得0.73G Reads,Q30在95.46以上;去除宿主的小rna后,经组装和去冗余后该样品分别得到758条病毒uniq contig序列;病毒contig序列比对核酸和蛋白库数据库,得到了234条病毒contig。最终检测出了19条病毒序列,11条为MRV(其中MRV-1、MRV-2、MRV-3和MRV-4分别为1、3、6和1条),其余8条分别为α乳头瘤病毒、鲤疱疹病毒、巨细胞病毒、慢病毒、绵羊疱疹病毒、蓝舌病毒、副流感病毒和猪瘟病毒。由于MRV的S1基因决定血清型,所以本研究选择MRV-3的S1基因985～1130 bp处设计引物和TaqMan探针,构建阳性质粒标准品,建立了针对MRV-3毒株的TaqMan RTqPCR检测方法。结果显示Ct值与阳性质粒标准品浓度在1.50×107～1.50×100 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.994;该方法最适引物浓度和TaqMan探针浓度分别为0.4μmol/L和0.2μmol/L;特异性实验结果表明此方法仅对MRV-3毒株进行扩增;本研究建立的TaqMan RT-qPCR敏感性优于常规PCR,其最低检测浓度达到1.50×10-1 copies/μL;重复性实验证明本方法重复性和稳定性好;通过临床样品的检测证明了本研究建立的检测方法效果较好,优于国标T/CALAS 50-2017所推荐的常规PCR和传统PCR方法,可以用于临床检测。综上所述,本文应用小rna深度测序技术快速对临床样品进行病毒的鉴定,在此基础上建立了MRV-3毒株的TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,为检测MRV-3病毒株提供了技术手段。

关键词：哺乳动物呼肠孤病毒小rna深度测序技术小rna TaqMan实时荧光定量PCR检测方法

玉米小rna种内变异的遗传机制全基因组分析

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玉米小RNA种内变异的遗传机制全基因组分析

作者： Abdul Saboor Khan 华中农业大学

学位级别：硕士

长度为18-30个核苷酸(nt)的小rna(s rnas)广泛存在于动物、植物以及真菌中,是一类重要的rna分子,在生物体的众多生物过程中发挥了至关重要的作用。早在上世纪80年代,人们就已经对s rna进行研究,发现s rnas是通过内切酶DICERLIKE(DCL)加... 详细信息

长度为18-30个核苷酸(nt)的小rna(s rnas)广泛存在于动物、植物以及真菌中,是一类重要的rna分子,在生物体的众多生物过程中发挥了至关重要的作用。早在上世纪80年代,人们就已经对s rna进行研究,发现s rnas是通过内切酶DICERLIKE(DCL)加工产生。1999年在植物中首次发现和基因转录后沉默相关的s rnas。随后大量研究表明,s rnas可以在转录、转录后或翻译水平上通过与靶基因序列互补配对的方式调控基因表达,从而参与植物的生长发育、代谢进程以及响应各种胁迫反应的信号通路调控,具有重要的生物学意义。s rnas在植物中存在广泛的变异,且在同一物种内不同材料之间的变异也广泛存在,并有报道s rnas在种内变异可能与物种内的表型变异紧密相关。然而我们对种内s rnas变异的类型与变异的内在分子机制还不清楚,这些限制了我们对植物表型变异的理解与分子育种的实践应用。为了系统鉴定s rnas的种内变异类型并解析其变异的分子机制,我们收集了两个玉米优良自交系B73和Mo17叶片组织的深度s rnas测序数据,并收集了一个具有广泛遗传变异的玉米关联群体(338份优良自交系)相关时期叶片的s rnas测序数据。该s rnas数据集包涵了15.530亿条有效s rnas序列。经过序列的质量筛选,我们获得了18～26nt的3.087亿条高质量的s rnas序列。在我们获取的B73和Mo17叶片组织深度s rnas数据集中,有1.546亿条s rnas序列被特异地定位到B73参考基因组中,1.541亿条s rnas序列特异地定位到Mo17玉米基因组,s rnas序列分别覆盖了B73和Mo17基因组的6.98%和7.06%。依s rnas在基因组中的分布来看,在B73中,38.47%的s rna分布在基因间区,其次30.37%是基因区域;而在Mo17的基因组中,s rnas有42.78%分布于基因间区,基因区域占比28.43%。s rnas在B73和Mo17基因组中不同区域的分布存在一定的差异。基于表达丰度(RPM)大于等于0.6并在至少60个不同的自交系中同时检测到的标准,我们共获得了339797条特异的s rnas,其中,B73基因组中检测到171813条s rnas,Mo17中检测到167984 s rnas,同时在两个基因组中都检测到的s rnas有156422条。进一步分析发现,B73和Mo17之间的s rnas表达发生了一定程度的变化。在B73和Mo17的基因组中,分别发现了15391和11562条种内特异表达的s rnas,同时,鉴定到3537条差异表达的s rnas。为了解析B73和Mo17之间的种内s rnas变异的分子机制,我们在具有广泛遗传变异的关联群体中对1999条B73和Mo17之间具有两倍及以上差异表达的s rnas进行了全基因组的表达关联分析,共鉴定到72671个与种内s rnas变异显著关联的基因组SNP位点。进一步的关联位点去冗余分析,获得了5744个影响s rna变异的反式e QTL。这些e QTL在玉米10条染色体中分布具有一定的偏好性,其中,第8号染色体鉴定到最多的e QTL(1633个),其次是第2(1077)、1(731)号染色体中,第10(183)号染色体中鉴定到的e QTL最少。为了挖掘控制玉米全基因组种内s rnas变异的关键调控因子,我们通过Mont Carl模拟分析发现,这5744个e QTL中的反式e QTL显著富集于26.37 Mb基因组区间内,其中调控大量s rna变异的25个反式e QTL热点集中在2.2Mb的基因组区间内。在这些反式e QTL热点中,chr1,chr2和chr8上分布了三个主要的e QTL热点。在chr8号染色体的e QTL热点区域,有13个基因与其调控的469条种内变异s rnas中的428条具有表达上的显著相关性。值得注意的是,469条被chr8号染色体的e QTL热点调控的s rnas大都为24nt的s rnas,存在显著的s rnas长度富集。这些24nt的s rnas主要与chr8号染色体的e QTL热点区域的三个基因具有表达相关性。这三个基因分别是Zm00001d008982,Zm00001d008983,Zm00001d008984,这3个基因可能主要参与了24nt s rnas的合成与调控途径。同理,在chr2号染色体的e QTL热点调控了180条s rnas的表达变异,其中,75条s rnas为22nt的s rnas。而这些22nt长度的s rnas主要与chr2号染色体的e QTL的热点区域的一个功能未知的基因具有显著的表达相关。通过类似的关联分析与表达丰度相关分析,我们共鉴定到十个可以调控s rnas表达变异的功能基因位

关键词：玉米小rna 全基因组关联研究表达变异数量性状基因位点 eQTL反式热点

家蚕细胞中RISC复合物结合小rna的分离、鉴定与分析

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家蚕细胞中RISC复合物结合小RNA的分离、鉴定与分析

作者：周芳浙江理工大学

学位级别：硕士

rna诱导沉默复合物(RISC, rna-induced silencing complex)是一类复合体效应器，介导rna沉默，主要由小rna和Argonaute(AGO)蛋白组成。AGO是其核心催化元件。小rna是一类非编码rna分子，在生物体内的种类很多，主要包括mirna、sirna和pi... 详细信息

rna诱导沉默复合物(RISC, rna-induced silencing complex)是一类复合体效应器，介导rna沉默，主要由小rna和Argonaute(AGO)蛋白组成。AGO是其核心催化元件。小rna是一类非编码rna分子，在生物体内的种类很多，主要包括mirna、sirna和pirna。在特殊的环境或压力作用下，能诱导产生多种小rna，并通过与mrna靶标的碱基配对影响蛋白翻译或mrna的稳定性[1]。我们将Bombxy mori argonaute2(BmAGO2)基因克隆到pIEx-1昆虫表达载体中，利用pIEx-1自身的Sca I酶切位点和转移载体pFastBacHTb融合后成功和bamcid重组获得表达BmAGO2蛋白的重组病毒ie1-bacmid-BmAGO2。本系统中蛋白的表达采用杆状病毒极早期基因ie1的启动子驱动，ie1启动子驱动的基因表达在细胞感染病毒后的9小时就能检测到蛋白的表达，在17小时已经获得高效表达，MTT法检测细胞活力基本正常，可进行AGO蛋白结合小rna的分离。重组病毒ie1-bacmid-BmAGO2侵染BmN细胞，在早期开始表达BmAGO2蛋白，利用His单抗(鼠IgG作阴性对照)免疫共沉淀HIS-BmAGO2蛋白，Western blotting在His单抗免疫共沉淀产物中检测到HIS-BmAGO2蛋白，而在鼠IgG免疫共沉淀产物中没有检测到HIS-BmAGO2蛋白。提取的免疫共沉淀产物rna与BmN总rna相比，免疫共沉淀分离出的小rna在18bp0bp有较高的富集，在这段区域内，片段长度约为20nt、27nt和33nt的条带尤为明显;阴性对照IgG免疫共沉淀分离rna中没有看到rna条带。高通量测序法测定对免疫共沉淀产物提取出的小rna进行测序，阴性对照结合rna含量少，不符合测序要求。测序结果显示获得11,691,441条小rna序列，包含813,702条特异性序列，单条特异性序列的丰度高达5,731,905，低至1。这些序列来源没有染色体偏好性;分析获得的相关小rna的长度分布图，显示三个峰值分别在20nt、27nt和33nt，此结果与rna电泳分析结果一致。对特异性序列进行分析时，长度为32nt和33nt序列明显减少，但长度为20nt和27nt小rna包含大量不同低丰度序列，而且，这些序列5’首个核苷酸序列对“U”有强烈的偏好性，第10位对“A”有偏好性，显示pirna的特征。通过生物信息学分析显示测出的小rna种类丰富，包括trna-, transposable element(TE)-,rrna-, snorna-, snrna-derived small rnas, mirnas和pirnas。在与BmAGO2蛋白结合的小rna中trna来源小rna(tRFs)丰度极高。Northern blotting验证了tRFs和rrna来源的小rna，tRFs主要来源于trna的5’或3’末端序列，且通过对反密码子环区、D环区和TψC环区特异性剪切产生，令人感兴趣的是tRFs具有明显的病毒感染相关性。大部分tRFs尤其是5′tRFs，只在感染BmNPV的细胞中表达，在正常细胞中不表达，其功能机制还有待进一步研究。本实验通过免疫共沉淀和高通量测序方法分离和鉴定了家蚕BmAGO2结合小rna，为进一步研究家蚕小rna的功能打下基础。

关键词： RISC BmAGO2 小rna 免疫共沉淀 tRF BmN细胞