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番茄正反交性状差异及小rna对其调控机制的初步研究

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番茄正反交性状差异及小RNA对其调控机制的初步研究

作者：孙倩浙江大学

学位级别：硕士

本实验进行了普通栽培番茄(Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom)和醋栗番茄(S. pimpinellifolium line WVa700)的种间远缘正反交,观察了正反交杂种的植物学差异性状,运用了AFLP (Amplified fragment length polymorphism)和MSAP (Methylation-sensitive amplification polymorphism)分子标记手段,探究了正反交杂种在基因上和DNA甲基化模式和水平上的差异;通过小rna测序,系统地分析了正反交杂种间的小rna差异,探索异源细胞质中小rna对正反交杂种差异性状的影响。本研究揭示了异源细胞质中小rna对远缘正反交杂种差异性状的调控作用,为阐明远缘正反交杂种性状差异的分子机制提供一种思路。主要结果如下：1.在普通栽培番茄和醋栗番茄的正反交杂种Micro-Tom×WVa700和WVa700xMicro-Tom之间,果形指数、单果重和株高3个植物学性状存在显著性差异。与两亲本相比,Micro-Tom×WVa700具有较大的叶面积、较大的冠幅和较小的果形指数,WVa700xMicro-Tom具有较大的叶长和较小的果形指数。2.采用AFLP分子标记技术分析正反交杂种在遗传上差异,结果显示,68个条带(4.3%)仅在Micro-Tom×WVa700显示变异,16个(1.01%)条带仅在WVa700xMicro-Tom中显示变异,两者存在显著性差异(P小rna的高通量测序技术分析正反交杂种间小rna的表达差异以及其靶基因的表达差异, 结果显示, 在Micro-Tom×WVa700和WVa700×Micro-Tom中,已知的76个mirnas的表达水平呈现很大的不同,3个mirna (miR172e-3p、miR482a、miR5081)在Fl杂种和亲本间有显著的差异表达。对这76个差异表达的mirnas进行靶基因预测,有410个靶基因出现。对靶基因的基因功能进行分析,结果显示这些靶基因参与了许多代谢过程,并且和蛋白相关。在远缘杂交过程中,不同表达的mirnas通过负调控其靶基因对正反交杂种差异表型和超亲表型起重要作用。此外,比较了远缘杂交过程中小rna的种类变化,结果显示在正反交后代中,小rna的种类减少了,甚至部分消失了。与WVa700相比,Micro-Tom的细胞质中小rna具有更强的缓冲能力。

关键词：番茄正反交表型差异 DNA甲基化细胞质效应小rna 缓冲能力

左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达的影响

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中国病原生物学杂志 2012年第2期7卷 94-97,128页

作者：宋娟楚雍烈西安交通大学免疫与病原生物学系陕西西安710061 法国里昂第一大学法国里昂69008

目的研究左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达的影响及对细菌生长的作用。方法分别在不同抑菌浓度左氧氟沙星干扰情况下,培养金黄葡萄球菌实验株RN6390和RN1HG001,提取rna,用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测不同菌株中rnaⅢ、R... 详细信息

目的研究左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达的影响及对细菌生长的作用。方法分别在不同抑菌浓度左氧氟沙星干扰情况下,培养金黄葡萄球菌实验株RN6390和RN1HG001,提取rna,用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测不同菌株中rnaⅢ、RsaA、RsaE、RsaG、RsaH的含量,比较不同抑菌浓度左氧氟沙星作用下小rna的表达差异。结果在MH培养液和BH培养液中左氧氟沙星对RN6390和RN1HG001的MIC均为0.25μg/ml。5种小rna中,rnaⅢ的表达量最多,RsaG最少;当左氧氟沙星浓度≥1/4MIC时,开始对金黄葡萄球菌的生长产生明显抑制作用,5种小rna的表达均开始下降;在RN6390菌株,1/16 MIC和1/8 MIC的左氧氟沙星能促进RsaH表达。结论不同浓度左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达具有抑制或者促进作用,提示除了其本身具有的阻碍细菌DNA合成的功能外还可能影响细菌基因的转录。

关键词：金黄葡萄球菌左氧氟沙星小rna qRT-PCR

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Northern印迹检测小rna

中国细胞生物学学报 2010年第2期32卷 195-196页

作者：陆明华刘默芳中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所rna研究技术平台上海200031

Northern印迹是一种常用的rna定性和定量分析方法。与mrna等大分子rna类似，microrna等小分子rna也可以通过电泳级分、转膜、杂交等Northern印迹操作进行定性、定量的分析。下面与大家分享我们实验室小rna Northern印迹的一些经验。

关键词： Northern 小rna 印迹 microrna 检测定量分析方法小分子rna mrna

双生病毒侵染引起的本氏烟（Nicotiana benthamiana）小rna群体变异

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双生病毒侵染引起的本氏烟（Nicotiana benthamiana）小RNA群体变...

作者：闫成海浙江大学

学位级别：硕士

本氏烟作为研究病原物与宿主互作的模式生物,同时也是双生病毒感染的主要宿主之一。双生病毒在我国的快速蔓延,对作物生产造成了严重的经济损失,研究其与植物宿主间的互作关系变得越来越重要。双生病毒TYLCCNV单独侵染植物并不造成症状,... 详细信息

本氏烟作为研究病原物与宿主互作的模式生物,同时也是双生病毒感染的主要宿主之一。双生病毒在我国的快速蔓延,对作物生产造成了严重的经济损失,研究其与植物宿主间的互作关系变得越来越重要。双生病毒TYLCCNV单独侵染植物并不造成症状,而TYLCCNV及其卫星I)NA(TYLCCNB)共同侵染则会造叶片卷曲、黄化、花叶等症状。本研究利用TYLCCNV侵染(对照)、TYLCCNV和其β卫星TYLCCNB共同侵染以及TYLCCNV和无义突变后的TYLCCNB (mβ)共同侵染本氏烟后深度测序获得的small rna表达数据,第一次在全基因组水平上对双生病毒侵染前后本氏烟体内small rna群体的变化进行了深入研究。本研究共使用了来自三组文库的479万多条特异读序用于mirna和phased sirna的鉴定。通过生物信息学方法,共预测出了392个可能的nirna基因和一批phased sirna。对TYLCCNV和TYLCCNB侵入后本氏烟mirna群体的表达水平研究发现,有148个mirna基因显著上调表达,有31个mirna基因显著下调。对检测到的mirna*的研究发现, mirna*的表达水平和mirna基本一致,但上调或者下调幅度要大于mirna。93%的mirna基因(265个)可以在本氏烟基因集中找到共1346个靶基因,对这些靶基因进行功能聚类分析,发现有接近50%的靶基因富集在绑定和催化相关的GO子目录下,说明了mirna在转录过程中发挥着重要的作用。对27个未预测到靶基因的mirna基因研究发现,22个核苷酸的miR7122在3个库中都具有较高的表达量,其可能潜在的作用是介导tasirna形成,该途径可能是不同于拟南芥中miR173、 miR390和miR828介导的ta-sirna形成途径。通过比较β和mβ侵染后的rnirna群体变化,发现在β卫星侵染中上调或者下调的mirna,在mβ中大部分出现了回复现象。这种现象暗示着,双生病毒通过srna途径上调或者下调一些基因的表达而致病;而本氏烟在抵抗双生病毒侵染过程中,可能通过降低β卫星的活性来减少病毒带来的伤害。

关键词：双生病毒本氏烟小rna mirna sirna

鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小rna的筛选、鉴定与功能的初步研究

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鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小RNA的筛选、鉴定与功能的初...

作者：王红朵安徽大学

学位级别：硕士

研究背景鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)鼠疫菌共含有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1质粒为鼠疫菌和假结核耶尔森氏菌所共有,pMT1与pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中外源性获得的,为鼠疫菌所特... 详细信息

研究背景鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)鼠疫菌共含有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1质粒为鼠疫菌和假结核耶尔森氏菌所共有,pMT1与pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中外源性获得的,为鼠疫菌所特有,与鼠疫菌的致病性密切相关。细菌中除了蛋白类的调控因子之外,还存在许多发挥调控作用的非编码rna(non-coding rna),在细菌中也称作小rna(small rna,小 rna)。小rna作为调节子,可参与细菌内铁代谢、糖代谢、群体感应、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的调控,对原核生物生理和毒力发挥着重要的调节作用。本研究利用高通量测序技术对在不同条件下生长的鼠疫菌提取它的总rna进行转录组测序,新发现了104个小rna,其中包括pMT1与pPCP1质粒上的多个小rna,而这两个质粒又是鼠疫菌在进化过程中获得的,因此验证pMT1与pPCP1质粒上小rna的功能是鼠疫菌致病机制研究的重要组成部分。本研究旨在利用Northern blot验证新发现的小rna,并构建小rna的基因缺失株,通过一系列的表型筛选实验,初步探究了小rna对鼠疫菌生存能力和致病能力的影响。结果与讨论：(1) 利用Northern blot实验方法共确定了10个小rna的存在,分别为sRl8、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143,又对本次确定的小rna和前期验证的部分小rna做了大小和Hfq依赖性的验证。验证大小的小rna有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15个,这些小rna的大小基本和预测结果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表达量高于Hfq突变株,因此这些小rna的稳定表达依赖于Hfq蛋白,sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突变株中的表达量几乎一样,且sR503和sR147在野生株中的表达量低于突变株,这些小rna的稳定表达不依赖于Hfq蛋白。(2)采用基于λRed重组系统的基因突变技术,共成功构建了16株小rna缺失株分别是ΔsR4338、ΔsR4339、ΔsR4340、ΔsR3457、ΔsR3446、ΔsR6143、ΔsR378、ΔsR3383、ΔsR3440、ΔsR18、ΔsR6094、ΔsR3411、ΔsR6106、ΔsR6097、ΔsR3425和ΔsR3438。同时在缺失株的基础上成功构建了一株过表达株,即pBAD-sR3383。(3)利用表型和毒力实验,验证这些小rna对鼠疫菌的生理和毒力的调控关系。在生物膜形成方而,sR3446缺失后,鼠疫菌的菌落表而比野生株光滑,因此sR3446可能正调控鼠疫菌生物膜的形成。当sR3425、sR3383、sR3457和sR6143缺失后,鼠疫菌菌落表而变得更加粗糙,因此这几个小rna可能负调控鼠疫菌生物膜的形成。基于此我们又进行了结晶紫实验,对生物膜形成情况做定量分析,结果显示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143对鼠疫菌生物膜形成的调控与菌落表面褶皱实验结果基本一致。我们通过在正常条件、高盐条件和酸性条件下培养鼠疫菌野生株和小rna突变株分析不同菌株在胁迫条件下生长速率的变化,从而验证小rna对鼠疫菌生存能力的影响,结果显示只有ΔsR3425缺失株在这三种条件下的生长速率均低于野生株,因此sR3425能够增强鼠疫菌应对外界环境变化的能力。我们通过小鼠攻毒实验验证了小rna对鼠疫菌毒力的影响,利用软件GraphPad Prism 5对实验结果进行分析并计算鼠疫菌野生株和小rna突变株生存曲线差异的P值,当P值≤0.05时认为两者的差异有统计学意义,结果显示：ΔsR3440、ΔsR3383、ΔsR378、Δ sR6094、4 sR3411、Δ sR4339和ΔsR6097的P值分别为0.0258、0.0075、0.0004、0.0003、0.0267、0.0156和0.0143,因此我们认为这些小rna能够影响鼠疫菌的毒力。

关键词：鼠疫菌小rna 生物膜毒力

立枯丝核菌AG-1的比较转录组和小rna研究

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立枯丝核菌AG-1的比较转录组和小RNA研究

作者：王嫣然四川农业大学

学位级别：硕士

立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1是一类重要的植物病原菌,寄主能够达到近50种,包括水稻、玉米、大麦、大豆、莴苣、番茄等多种重要粮油作物及蔬菜水果。由Rhizoctonia solani AG-1IA引起的水稻纹枯病是水稻的三大病害之一,在我国发... 详细信息

立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1是一类重要的植物病原菌,寄主能够达到近50种,包括水稻、玉米、大麦、大豆、莴苣、番茄等多种重要粮油作物及蔬菜水果。由Rhizoctonia solani AG-1IA引起的水稻纹枯病是水稻的三大病害之一,在我国发生面积非常广阔、流行性极强且频率高,造成的产量损失大。该病可从苗期到穗期都对水稻产生危害,并且以抽穗前后时期最严重,主要侵染水稻的叶片和叶鞘,也会侵入茎秆并蔓延到穗部,造成倒伏或整株枯死,或导致稻株不能够正常地抽穗,成为水稻稳产高产不可忽视的障碍,如何有效控制Rhizoctonia solani AG-1的发生与危害非常值得关注。本研究的目的在于从病原菌基因组比较转录水平和侵染过程的小rna表达调控水平寻求病害侵染和发生机制的可能性依据,为病原菌的有效防治提供可靠的理论依据。为此,一方面,我们从细胞学上观察并比较立枯丝核菌1类融合群AG-1IA、IB、IC的侵染寄主的过程和特点,通过Illumina GA II技术完成3个亚群的转录组测序、组装和注释,并对3个亚群转录组进行比较和分析,同时侧重对这3个亚群转录本的转录表达致病因子分泌小蛋白进行预测和比较分析,试图寻找转录特点与它们的致病特异性之间的相关性,比较分析并验证不同亚种中分泌致病小蛋白在致病机制中的差异和特点;另一方面,我们研究AG-1IA在侵染水稻过程中6个不同时期小rna的差异表达特点,预测并分析与致病基因表达调控相关的小rna和靶基因,从小rna负调控致病靶基因方面解析病原菌侵染寄主的过程和特点。本研究主要包括以下结论：1、通过致病性测定、侵染过程和侵染结构的显微观察,我们观察到接种病原菌不同融合亚群IA、IB和IC到不同寄主时,出现病斑的大小、特点不同;其中,比较分析侵染过程中产生的侵染结构：侵染垫和附着胞,以及菌丝的直接侵入和从气孔侵入的侵染特征差异。2、在转录组分析过程中,分别获得平均长度为75bp的6,367,931个reads (IATS),6,038,800个reads (IBTS)和5,104,515个reads(ICTS)的cDNA文库;测序后经过组装分别得到17,020,336bp、17,354,840bp和14,807,518bp的序列,以及21,542、20,487和18,503个转录本。其中,14,124,358bp的序列在IA基因组中预测到。3、运用3种预测方法对IA、IB和IC的转录组序列进行综合预测并获得20,732(96.24%)、19,827(96.78%)和17,938(96.95%)个ORFs。与多个数据库比对得到在IA、IB和IC分别有11129(53.68%)、10886(54.90%)和10161(56.65%)个转录本可比对到已知基因,并进行了基因的KOG分类,及致病性相关的功能蛋白的分析。4、在转录组数据验证过程中,我们选取了部分蛋白进行PCR验证,与测序结果基本一致,说明组装结果的可靠性。同时对转录表达预测到编码与致病性存在高度关联的富半胱氨酸的分泌小蛋白的基因进行克隆和诱导表达,并进行对寄主的HR生物活性检测。5、侵染寄主小RAN分析方面,我们得到IA营养生长时期的以及侵染各时期(10h、18h、24h、32h、48h、72h)的小rna预测数目。其中,侵染时期2(18h)的总小rna数最多,是其他侵染时期的8到9倍。统计各个时期小rna的大小分布,长度从18到28nt,峰值在23或24nt。将这些序列比对到基因组,发现除未注释的srna外最多的是rrna。与基因组比较,各个时期的小rna在基因组的分布趋势相似。6、通过软件预测获得264条新mirna,对这些新mirna进行靶基因预测,结果发现靶基因功能主要为binding、catalytic activity、cell、cell part、cellular process和metabolic process六类。7、对样品中表达的已知mirna进行统计,分析样品两两之间的表达差异,形成表达模式聚类分析图,推测这些发生了显著或极显著差异表达的已知mirna可能通过其上调或下调的差异性表达参与到侵染水稻的过程。8、完成对差异表达的mirna的靶基因预测和GO分析,发现病原菌在侵染的不同阶段mirna的调节差异。

关键词：立枯丝核菌AG-1 Illumina测序转录组小rna

铝毒害对雪柑和酸柚根系小rna差异表达的影响

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铝毒害对雪柑和酸柚根系小RNA差异表达的影响

作者：周洋飞福建农林大学

学位级别：硕士

在酸性土壤上,铝(Al)毒是限制植物生长的主要因素,微摩尔水平的Al就可以迅速抑制植物根系的生长。柑橘主要种植于为热带、亚热带和温带地区的酸性土壤中,容易遭受Al毒危害。本研究以Al处理(1m M Al Cl3·6H2O)和对照(0m M Al Cl3·6H2O... 详细信息

在酸性土壤上,铝(Al)毒是限制植物生长的主要因素,微摩尔水平的Al就可以迅速抑制植物根系的生长。柑橘主要种植于为热带、亚热带和温带地区的酸性土壤中,容易遭受Al毒危害。本研究以Al处理(1m M Al Cl3·6H2O)和对照(0m M Al Cl3·6H2O)处理15周的雪柑和酸柚实生苗为试验材料,从生理生化和分子水平研究了两个不同柑橘品种耐铝性差异的可能机制,得出以下三点结论:***对雪柑和酸柚实生苗生长的影响与对照相比,Al处理雪柑和酸柚的植株变矮小,侧根数量减少,并且酸柚的症状更明显。Al处理显著降低了酸柚实生苗茎、叶、地上部和全株的干重,显著提高了酸柚的根冠比,而对雪柑实生苗没有明显的影响。***对雪柑和酸柚根茎叶生理生化的影响与对照相比,Al处理增加了雪柑和酸柚根、茎、叶的Al含量,并且酸柚茎、叶中Al含量的增加幅度均高于雪柑;显著降低了雪柑和酸柚根、茎、叶的磷(P)含量,并且雪柑根叶中P含量均高于酸柚;Al处理降低了酸柚根的S含量,但显著提高雪柑茎和叶的S含量;Al处理显著增加酸柚根中O2.-、H2O2和TBARS的含量,但对雪柑的影响不明显。***处理对雪柑和酸柚根系mi rnas的差异表达及与mi rna代谢相关基因表达的影响通过Illumina测序,本研究从Al处理雪柑和酸柚根系中分离了12个和16个差异表达的mi rnas,经过靶基因预测、基因GO分析和pathway通路等生物信息学分析后得出不同柑橘品种耐Al能力差异的可能原因归纳如下:(a)下调mi R160的表达,促进不定根和侧根的发育;(b)下调mi R477、mi R397和mi R398的表达,上调与逆境胁迫响应和信号转导相关靶基因的表达(SGT1、PLC和AAO);(c)降低mi R3627的表达,增加柠檬酸的分泌;(d)降低mi R482和mi R172的表达,增强植物碳水化合物代谢和硫代谢;(e)提高HEN1、SE1、AGO1、HASTY1、HYL1和HESO1的表达,更灵活的调控mi rna的代谢。总之,本研究探讨了不同柑橘耐铝性差异的生理生化和分子机制,研究结果为进一步分析柑橘耐铝机制提供了思路,为柑橘高产优质栽培提供科学依据。

关键词：柑橘耐Al 元素含量小rna 调控

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实时荧光定量PCR方法检测小rna

中国细胞生物学学报 2010年第3期32卷 359-360页

作者：贺小宏刘默芳兰州大学生命科学院兰州730000 中科院上海生命科学研究院生化细胞所rna研究技术平台上海200031

Real—time Quantitative PCR Detecting System，即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检测系统，简称定量PCR（qPCR）。荧光定量PCR-般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧... 详细信息

Real—time Quantitative PCR Detecting System，即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检测系统，简称定量PCR（qPCR）。荧光定量PCR-般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR（以SYBRGreen I为例）方法对小rna进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小rna的优点为：实验设计简单，一般需要一条特异性反转录引物，一条特异性正向PCR引物，反向PCR引物可通用于所有小rna分析，无需象TaqMan方法那样专门设计探针；实验成本相对较低；可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术，而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下：

关键词：荧光定量PCR PCR方法小rna 检测系统实时定量 PCR引物非特异性 TaqMan

3型猪源呼肠孤病毒的小rna深度测序技术鉴定及其TaqMan qPCR检测方法建立和应用

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3型猪源呼肠孤病毒的小RNA深度测序技术鉴定及其TaqMan qPCR检测...

作者：武松山东北农业大学

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世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒... 详细信息

世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒检测方法鉴定未知病毒或新出现的病毒周期长、耗费较大量人力物力。小rna深度测序技术属于二代测序技术,在对病毒没有了解的情况下便可以完成对未知病毒或者新型病毒的鉴定,并且有利于进一步建立该病毒的特异性诊断方法。哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)在自然界分布广泛,人和动物感染MRV非常普遍,可引起呼吸道、肠道症状和心肌炎。动物源分离的MRV毒株与能够引起人类疾病的MRV毒株亲缘关系很近,对公共安全存在重大威胁。为了对MRV-3进行流行病学调查、病原诊断和防控提供技术支持,实现对MRV-3毒株检测监控。本研究通过小rna深度测序技术对未知病毒样本小rna测序共获得0.73G Reads,Q30在95.46以上;去除宿主的小rna后,经组装和去冗余后该样品分别得到758条病毒uniq contig序列;病毒contig序列比对核酸和蛋白库数据库,得到了234条病毒contig。最终检测出了19条病毒序列,11条为MRV(其中MRV-1、MRV-2、MRV-3和MRV-4分别为1、3、6和1条),其余8条分别为α乳头瘤病毒、鲤疱疹病毒、巨细胞病毒、慢病毒、绵羊疱疹病毒、蓝舌病毒、副流感病毒和猪瘟病毒。由于MRV的S1基因决定血清型,所以本研究选择MRV-3的S1基因985～1130 bp处设计引物和TaqMan探针,构建阳性质粒标准品,建立了针对MRV-3毒株的TaqMan RTqPCR检测方法。结果显示Ct值与阳性质粒标准品浓度在1.50×107～1.50×100 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.994;该方法最适引物浓度和TaqMan探针浓度分别为0.4μmol/L和0.2μmol/L;特异性实验结果表明此方法仅对MRV-3毒株进行扩增;本研究建立的TaqMan RT-qPCR敏感性优于常规PCR,其最低检测浓度达到1.50×10-1 copies/μL;重复性实验证明本方法重复性和稳定性好;通过临床样品的检测证明了本研究建立的检测方法效果较好,优于国标T/CALAS 50-2017所推荐的常规PCR和传统PCR方法,可以用于临床检测。综上所述,本文应用小rna深度测序技术快速对临床样品进行病毒的鉴定,在此基础上建立了MRV-3毒株的TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,为检测MRV-3病毒株提供了技术手段。

关键词：哺乳动物呼肠孤病毒小rna深度测序技术小rna TaqMan实时荧光定量PCR检测方法