检索结果-南通市图书馆

作者：孙嘉遥江苏大学

学位级别：硕士

目的:小rna SbfR是本课题组通过Solexa高通量测序技术首次在伤寒沙门菌中发现的一个非编码rna,相关分子特性分析结果显示,SbfR可能是一反式编码rna。本论文旨在初步探索SbfR在伤寒沙门菌中发挥的调节作用和机制,为后续研究SbfR靶基因及... 详细信息

目的:小rna SbfR是本课题组通过Solexa高通量测序技术首次在伤寒沙门菌中发现的一个非编码rna,相关分子特性分析结果显示,SbfR可能是一反式编码rna。本论文旨在初步探索SbfR在伤寒沙门菌中发挥的调节作用和机制,为后续研究SbfR靶基因及作用机制奠定基础。方法:1.伤寒沙门菌转录组分析:将SbfR缺陷株(ΔSbfR+p BAD)和SbfR回补株(ΔSbfR+p BAD-SbfR)培养至对数期(OD600≈0.4),加入L-阿拉伯糖诱导后提取细菌总rna,加入荧光素进行逆转录,标记后的c DNA与全基因组芯片杂交,扫描并进行数据分析,比较SbfR缺陷株和回补株基因表达谱差异。选择部分差异表达基因进行q RT-PCR,验证基因芯片结果。2.q RT-PCR分析基因表达:分别提取各菌株总rna并逆转录为c DNA,进行q RT-PCR实验,检测基因的m rna水平。3.细菌在不同温度下的生长曲线测定:分别在37°C和42°C培养SbfR缺陷株和回补株,每隔1h检测OD600值,以OD600数值作纵坐标,以时间作横坐标,绘制SbfR缺陷株和回补株的生长曲线,比较SbfR对细菌在两种温度下生长情况的影响。***片段分部回补株构建:分别构建连有SbfR前69nt和后69nt片段的重组载体,所用质粒为p BAD/Myc-His A,并将重组载体电转入ΔSbfR,制备前69nt和后69nt SbfR片段回补株。5.细菌动力实验:将空载体株(WT+p BAD)、SbfR缺陷株、SbfR回补株及SbfR片段分部回补株分别培养至对数期,用接种针蘸取菌液点种于LB半固体动力板,置于37°C孵箱过夜,测量细菌圈直径,分析SbfR对细菌动力的影响。***-blot检测Flj B表达水平:将空载体株、SbfR缺陷株和SbfR回补株培养至对数期,收集全菌蛋白,用兔抗Flj B抗血清进行Western-blot实验,检测各菌株Flj B表达水平。*** La细胞侵袭实验:将空载体株、SbfR缺陷株和SbfR回补株培养至对数期,与He La细胞共孵育90min,弃去培养液。一半细胞孔中加入Triton裂解细胞,涂板培养,计数菌落数为粘附水平;一半细胞孔中加入庆大霉素培养90min后,加入Triton裂解细胞,涂板培养,计数菌落数为侵袭水平。8.生物膜形成实验:在TSB培养基中分别培养空载体株、SbfR缺陷株、SbfR回补株及SbfR片段分部回补株至对数期,转种至96孔板,30°C静置4天,洗去浮游细菌并用结晶紫对生物膜染色,30%冰醋酸洗脱后595nm比色测定。结果:1.基因芯片分析结果显示,SbfR缺陷株与回补株之间共99个基因表达水平存在差异;q RT-PCR结果与基因芯片分析数据相比,基因变化趋势一致。2.生长曲线测定结果表明,在37°C条件下SbfR缺陷株与回补株的生长情况一致,而在42°C条件下回补株的生长明显慢于缺陷株。3.成功构建SbfR前69nt片段和后69nt片段的回补株(ΔSbfR+p BAD-F69,ΔSbfR+p BAD-L69)。4.动力实验结果表明,与空载体株相比,SbfR缺陷株动力下降,回补株动力恢复;两部分SbfR片段回补株动力均恢复到空载体株水平,且与SbfR全长回补株动力水平一致。5.与空载体株相比,SbfR缺陷株Flj B表达水平下降,回补株Flj B表达水平恢复。6.与空载体株相比,SbfR缺陷株对He La细胞的侵袭能力下降,回补株的侵袭能力恢复。7.与空载体株相比,SbfR缺陷株的生物膜形成能力下降,回补株的形成能力恢复。两部分SbfR片段回补株生物膜形成能力均部分恢复,与空载体株水平一致,但比SbfR全长回补株弱。***缺陷株hsl S、hsl T、htp G、fli A、flj B、sop E等基因的转录水平低于SbfR回补株;flh D的转录水平高于SbfR回补株;prg J、fim A、csg A、yih P、rfa D、bcs A、wca A、bap A等基因的转录水平与SbfR回补株的差异无统计学意义。结论:srna SbfR参与伤寒沙门菌热应激条件下生长、动力、侵袭、生物膜形成等方面的调节,抑制热应激条件下细菌生长,促进细菌动力、侵袭和生物膜形成能力。SbfR前69nt和后69nt回补株均可独立完成全长SbfR对细菌动力的促进作用,但在形成生物膜能力方面两种部分回补株分别发挥全长SbfR的部分调控作用。

关键词：伤寒沙门菌小rna SbfR 生长动力侵袭生物膜形成

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第29次南极考察队员肠道菌群研究与红景天小rna测序数据的分析

第29次南极考察队员肠道菌群研究与红景天小RNA测序数据的分析

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作者：许剑涛北京协和医学院

学位级别：硕士

南极大陆是世界上最冷、最干燥的大陆,我国每年都会派遣考察队去南极进行科学考察研究。第29次中国南极考察队于2012年11月5日乘坐雪龙号从中国上海出发,2012年12月1日抵达中山站。度夏队员于2013年3月8日开始返程;越冬队员于2013年12... 详细信息

南极大陆是世界上最冷、最干燥的大陆,我国每年都会派遣考察队去南极进行科学考察研究。第29次中国南极考察队于2012年11月5日乘坐雪龙号从中国上海出发,2012年12月1日抵达中山站。度夏队员于2013年3月8日开始返程;越冬队员于2013年12月18日离开南极,在中山站居住一年,2014年2月6日返回中国北京。本研究中,我们在三个时间点对15名中山站越冬队员收集了静脉血和粪便样本,3月15日(越冬前)在中山站进行了第一次取样,7月15日冬季(极夜)第二次和12月5日(极昼)第三次采样。对粪便样本提取了 DNA,进行了16SrDNA测序,并进行了生物信息学分析。研究发现,以越冬前作为对照,队员们的肠道菌群的多样性发生了明显变化,α多样性显著降低,β多样性显著改变。同时研究还发现,极端环境下,人体肠道中多类菌群丰富度发生显著变化,共筛选出123类(鉴定到属)变化菌群。研究过程中,检测到人体中炎症因子(TNF α及IL1β)在越冬期间表达会显著升高,并且有一些菌属的变化与炎症因子TNF-α与IL1-β的变化显著相关,提示了这些属类的菌群与炎症的相关性。越冬队员居留南极一年以上,感官和情感长期剥夺,适应不良,易得“南极越冬综合征”等应激性疾病。对南极考察队员生理心理适应性的研究,不仅为极地医学防治提供数据资料,也将南极特殊环境作为生理学研究的天然实验室,探讨一些重要的生命科学问题。中药的作用,长期以来在实践中不断被人们认可,但中药疗效的作用机制一直以来还未有被科学界广泛接受的解析。小rna(small rna)通常指长度小于200个核苷酸的非编码rna,它们通常在动植物中参与转录后基因表达调控。而植物来源的小rna能否进入人体一直以来存在巨大的争议。最近的研究表明,植物中的小rna可能具有跨物种的功能:外源植物miR-168a显示特异性靶向哺乳动物LDLRAP1。虽然具有争议性证据的问题已经提出,这些实验结果可能是由于污染,但更多的研究已经扩展了哺乳动物中植物功能的小rna列表。金银花编码的非典型miR-2911直接针对甲型流感病毒;来自植物,细菌和真菌的小rna在人血浆中是普遍存在的。一些报告还表明,小rna(如miR-486-5p和miR-29)在肺纤维化中具有抗纤维化作用。在本课题中,我们提取了新鲜中药植物(红景天)及用其处理的A549细胞的rna;用新鲜中药植物(红景天)提取的rna对老鼠连续灌胃3d,并在之后多时间点(12 h、24 h和48 h)对鼠的肺组织进行了 rna提取;还对新鲜中药植物(红景天)进行熬煮,人体连续服用中药汤汁7 d后多时间点(0h和24 h)抽取的人血进行rna提取;加上未受处理的A549细胞及鼠肺作为对照提取的rna,共计9例样本都进行了小rna测序。我们对测序数据通过生物信息学的算法计算筛选,找出了中药植物(红景天)来源的,并可能进入人体或鼠肺的小rna,为这种观点提示了可能性,并为进一步分析、实验验证及功能研究提供了基础。

关键词：南极 16S rDNA测序肠道菌群中药小rna 生物信息学

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鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小rna的筛选、鉴定与功能的初步研究

鼠疫耶尔森氏菌外源获得性质粒编码小RNA的筛选、鉴定与功能的初...

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作者：王红朵安徽大学

学位级别：硕士

研究背景鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)鼠疫菌共含有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1质粒为鼠疫菌和假结核耶尔森氏菌所共有,pMT1与pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中外源性获得的,为鼠疫菌所特... 详细信息

研究背景鼠疫是一种自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶尔森氏菌(以下简称鼠疫菌)鼠疫菌共含有3个质粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1质粒为鼠疫菌和假结核耶尔森氏菌所共有,pMT1与pPCP1质粒则是鼠疫菌在进化过程中外源性获得的,为鼠疫菌所特有,与鼠疫菌的致病性密切相关。细菌中除了蛋白类的调控因子之外,还存在许多发挥调控作用的非编码rna(non-coding rna),在细菌中也称作小rna(small rna,小 rna)。小rna作为调节子,可参与细菌内铁代谢、糖代谢、群体感应、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的调控,对原核生物生理和毒力发挥着重要的调节作用。本研究利用高通量测序技术对在不同条件下生长的鼠疫菌提取它的总rna进行转录组测序,新发现了104个小rna,其中包括pMT1与pPCP1质粒上的多个小rna,而这两个质粒又是鼠疫菌在进化过程中获得的,因此验证pMT1与pPCP1质粒上小rna的功能是鼠疫菌致病机制研究的重要组成部分。本研究旨在利用Northern blot验证新发现的小rna,并构建小rna的基因缺失株,通过一系列的表型筛选实验,初步探究了小rna对鼠疫菌生存能力和致病能力的影响。结果与讨论：(1) 利用Northern blot实验方法共确定了10个小rna的存在,分别为sRl8、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143,又对本次确定的小rna和前期验证的部分小rna做了大小和Hfq依赖性的验证。验证大小的小rna有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15个,这些小rna的大小基本和预测结果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表达量高于Hfq突变株,因此这些小rna的稳定表达依赖于Hfq蛋白,sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突变株中的表达量几乎一样,且sR503和sR147在野生株中的表达量低于突变株,这些小rna的稳定表达不依赖于Hfq蛋白。(2)采用基于λRed重组系统的基因突变技术,共成功构建了16株小rna缺失株分别是ΔsR4338、ΔsR4339、ΔsR4340、ΔsR3457、ΔsR3446、ΔsR6143、ΔsR378、ΔsR3383、ΔsR3440、ΔsR18、ΔsR6094、ΔsR3411、ΔsR6106、ΔsR6097、ΔsR3425和ΔsR3438。同时在缺失株的基础上成功构建了一株过表达株,即pBAD-sR3383。(3)利用表型和毒力实验,验证这些小rna对鼠疫菌的生理和毒力的调控关系。在生物膜形成方而,sR3446缺失后,鼠疫菌的菌落表而比野生株光滑,因此sR3446可能正调控鼠疫菌生物膜的形成。当sR3425、sR3383、sR3457和sR6143缺失后,鼠疫菌菌落表而变得更加粗糙,因此这几个小rna可能负调控鼠疫菌生物膜的形成。基于此我们又进行了结晶紫实验,对生物膜形成情况做定量分析,结果显示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143对鼠疫菌生物膜形成的调控与菌落表面褶皱实验结果基本一致。我们通过在正常条件、高盐条件和酸性条件下培养鼠疫菌野生株和小rna突变株分析不同菌株在胁迫条件下生长速率的变化,从而验证小rna对鼠疫菌生存能力的影响,结果显示只有ΔsR3425缺失株在这三种条件下的生长速率均低于野生株,因此sR3425能够增强鼠疫菌应对外界环境变化的能力。我们通过小鼠攻毒实验验证了小rna对鼠疫菌毒力的影响,利用软件GraphPad Prism 5对实验结果进行分析并计算鼠疫菌野生株和小rna突变株生存曲线差异的P值,当P值≤0.05时认为两者的差异有统计学意义,结果显示：ΔsR3440、ΔsR3383、ΔsR378、Δ sR6094、4 sR3411、Δ sR4339和ΔsR6097的P值分别为0.0258、0.0075、0.0004、0.0003、0.0267、0.0156和0.0143,因此我们认为这些小rna能够影响鼠疫菌的毒力。

关键词：鼠疫菌小rna 生物膜毒力

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结核病患者血清小rna表达谱型特征及其编码基因的染色体定位

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实用医学杂志 2010年第23期26卷 4264-4266页

作者：钟球周琳云径平李海成钱明陈涛广东省结核病防治研究所广州市510630 中山大学肿瘤防治中心广州市510060

目的:了解结核病患者血清小rna(srna)的表达特征及其编码基因的染色体分布,以探讨结核病发生、发展的调控机制。方法:应用离心柱层析法提取血清总rna,采用Solexa深度测序技术对结核病患者和健康人群血清srna进行测序,对长度10～30nt的s... 详细信息

目的:了解结核病患者血清小rna(srna)的表达特征及其编码基因的染色体分布,以探讨结核病发生、发展的调控机制。方法:应用离心柱层析法提取血清总rna,采用Solexa深度测序技术对结核病患者和健康人群血清srna进行测序,对长度10～30nt的srna的表达进行分析;并将测得的所有srna序列与人类基因组进行比对,确定其在人类染色体上的定位。结果:对27例结核病患者和25例健康对照者血清srna进行了检测与分析,在10～30nt长度范围内,结核病患者不同长度血清srna的表达丰度呈近似正态分布,健康人群则呈明显的负偏态分布;结核病患者血清srna编码基因主要位于染色体chr17、chr8、chr22、chr9、chrun-g1000220的正义链和chr11、chr8的负义链上,健康人群血清rna编码基因主要位于染色体chr17、chr22、chrun-g1000220的正义链和chr8的负义链上。结论:结核病患者有其特定的血清srna表达谱,其编码基因亦呈现特定的染色体分布。

关键词：结核小rna 染色体

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左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达的影响

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中国病原生物学杂志 2012年第2期7卷 94-97,128页

作者：宋娟楚雍烈西安交通大学免疫与病原生物学系陕西西安710061 法国里昂第一大学法国里昂69008

目的研究左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达的影响及对细菌生长的作用。方法分别在不同抑菌浓度左氧氟沙星干扰情况下,培养金黄葡萄球菌实验株RN6390和RN1HG001,提取rna,用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测不同菌株中rnaⅢ、R... 详细信息

目的研究左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达的影响及对细菌生长的作用。方法分别在不同抑菌浓度左氧氟沙星干扰情况下,培养金黄葡萄球菌实验株RN6390和RN1HG001,提取rna,用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测不同菌株中rnaⅢ、RsaA、RsaE、RsaG、RsaH的含量,比较不同抑菌浓度左氧氟沙星作用下小rna的表达差异。结果在MH培养液和BH培养液中左氧氟沙星对RN6390和RN1HG001的MIC均为0.25μg/ml。5种小rna中,rnaⅢ的表达量最多,RsaG最少;当左氧氟沙星浓度≥1/4MIC时,开始对金黄葡萄球菌的生长产生明显抑制作用,5种小rna的表达均开始下降;在RN6390菌株,1/16 MIC和1/8 MIC的左氧氟沙星能促进RsaH表达。结论不同浓度左氧氟沙星对金黄葡萄球菌小rna表达具有抑制或者促进作用,提示除了其本身具有的阻碍细菌DNA合成的功能外还可能影响细菌基因的转录。

关键词：金黄葡萄球菌左氧氟沙星小rna qRT-PCR

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双生病毒侵染引起的本氏烟（Nicotiana benthamiana）小rna群体变异

双生病毒侵染引起的本氏烟（Nicotiana benthamiana）小RNA群体变...

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作者：闫成海浙江大学

学位级别：硕士

本氏烟作为研究病原物与宿主互作的模式生物,同时也是双生病毒感染的主要宿主之一。双生病毒在我国的快速蔓延,对作物生产造成了严重的经济损失,研究其与植物宿主间的互作关系变得越来越重要。双生病毒TYLCCNV单独侵染植物并不造成症状,... 详细信息

本氏烟作为研究病原物与宿主互作的模式生物,同时也是双生病毒感染的主要宿主之一。双生病毒在我国的快速蔓延,对作物生产造成了严重的经济损失,研究其与植物宿主间的互作关系变得越来越重要。双生病毒TYLCCNV单独侵染植物并不造成症状,而TYLCCNV及其卫星I)NA(TYLCCNB)共同侵染则会造叶片卷曲、黄化、花叶等症状。本研究利用TYLCCNV侵染(对照)、TYLCCNV和其β卫星TYLCCNB共同侵染以及TYLCCNV和无义突变后的TYLCCNB (mβ)共同侵染本氏烟后深度测序获得的small rna表达数据,第一次在全基因组水平上对双生病毒侵染前后本氏烟体内small rna群体的变化进行了深入研究。本研究共使用了来自三组文库的479万多条特异读序用于mirna和phased sirna的鉴定。通过生物信息学方法,共预测出了392个可能的nirna基因和一批phased sirna。对TYLCCNV和TYLCCNB侵入后本氏烟mirna群体的表达水平研究发现,有148个mirna基因显著上调表达,有31个mirna基因显著下调。对检测到的mirna*的研究发现, mirna*的表达水平和mirna基本一致,但上调或者下调幅度要大于mirna。93%的mirna基因(265个)可以在本氏烟基因集中找到共1346个靶基因,对这些靶基因进行功能聚类分析,发现有接近50%的靶基因富集在绑定和催化相关的GO子目录下,说明了mirna在转录过程中发挥着重要的作用。对27个未预测到靶基因的mirna基因研究发现,22个核苷酸的miR7122在3个库中都具有较高的表达量,其可能潜在的作用是介导tasirna形成,该途径可能是不同于拟南芥中miR173、 miR390和miR828介导的ta-sirna形成途径。通过比较β和mβ侵染后的rnirna群体变化,发现在β卫星侵染中上调或者下调的mirna,在mβ中大部分出现了回复现象。这种现象暗示着,双生病毒通过srna途径上调或者下调一些基因的表达而致病;而本氏烟在抵抗双生病毒侵染过程中,可能通过降低β卫星的活性来减少病毒带来的伤害。

关键词：双生病毒本氏烟小rna mirna sirna

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Northern印迹检测小rna

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中国细胞生物学学报 2010年第2期32卷 195-196页

作者：陆明华刘默芳中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所rna研究技术平台上海200031

Northern印迹是一种常用的rna定性和定量分析方法。与mrna等大分子rna类似，microrna等小分子rna也可以通过电泳级分、转膜、杂交等Northern印迹操作进行定性、定量的分析。下面与大家分享我们实验室小rna Northern印迹的一些经验。

关键词： Northern 小rna 印迹 microrna 检测定量分析方法小分子rna mrna

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十字花科黑腐病菌中十个小rna的功能鉴定

十字花科黑腐病菌中十个小RNA的功能鉴定

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作者：李良贤广西大学

学位级别：硕士

细菌小rna,也叫非编码rna,是一类大小处于50～500 nt之间的rna分子。细菌小rna可以独立地行使一些特定的功能,但是不具备编码蛋白的能力,与核糖体rna和转运rna有明显的差异。小rna广泛存在于各种生物中,对细胞的生理过程起着重要的调节... 详细信息

细菌小rna,也叫非编码rna,是一类大小处于50～500 nt之间的rna分子。细菌小rna可以独立地行使一些特定的功能,但是不具备编码蛋白的能力,与核糖体rna和转运rna有明显的差异。小rna广泛存在于各种生物中,对细胞的生理过程起着重要的调节作用。研究表明,它们作为转录后调控因子在细菌的糖代谢、碳源代谢、群体感应、应激反应、细胞运动和致病性等方面发挥着重要的调控作用。目前,小rna的鉴定工作以及对其功能进行研究是当前微生物学研究领域的前沿和热点。目前,有效鉴定小rna方法已经成功建立,已经成功鉴定了近1000个细菌小rna,但是它们的生物学功能几乎没有被确定。小rna在植物病原细菌致病过程中的作用和重要性仍然需要更深入的研究。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,下文简称为Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的病原菌,它是研究病原菌与植物相互作用领域的一个极其重要的模式菌株。近来,本课题组采用rna深度测序(rna-seq)方法,对Xcc 8004菌株在MMX基本培养基中生长至对数期时表达的小rna进行了鉴定,结果发现了500多个候选。但是这些候选小rna的生物学功能仍不清楚。本研究选取了十个候选小rna作为研究对象,首先采用三引物RT-PCR法确证它们的存在,然后分别构建这十个候选小rna的缺失突变体和过量表达株,然后对构建成功的缺失突变体和过量表达株的相应表型均进行检测和分析讨论从而得知它们具有怎么的生物学功能。三引物RT-PCR结果分析得知这十个候选小rna的确是真实存在的。然后,通过链特异性RT-PCR的方法,我们可以进一步得知这十个小rna的主要转录方向。目前,本研究已成功构建了这10个目的小rna的9个缺失突变体和10个过量表达菌株,然后,对成功构建的所有缺失突变体和过量表达株均进行了一系列的表型检测,分别为：(1)在丰富培养基和基本培养基内的生长情况、(2)胞外多糖产量和胞外酶活性、(3)游动性、(4)生物膜形成、(5)在非寄主植物上引起的高敏反应(HR反应)、(6)在寄主植物上的致病能力等表型进行了检测,然后把检测的所有表型与野生型菌株和带有空的过量表达载体pBBad18K的野生型菌株的表型作出了相应的比较和分析。结果发现：(1)小rna sRXcc-50的缺失突变体DM50在丰富培养基中的生长稳定期的菌体密度小于野生型菌株;(2)小rna sRXcc-49、sRXcc-51、sRXcc-52、sRXcc-55的缺失突变体DM49、DM51、 DM52、DM55在基本培养基中的对数期和稳定期的菌体密度明显小于野生型菌株;(3)小rna sRXcc-53的过量表达株OE53在基本培养基中的对数期和稳定期的菌体密度明显低于对照组WT/pBBad18K;(4)小rna sRXcc-55的过量表达株OE55在基本培养基中的对数期和稳定期的菌体密度明显高于对照组WT/pBBad18K;(5)小rna sRXcc-49的缺失突变体DM49在辣椒叶片上出现HR反应的时间比野生型Xcc 8004早;(6)小rna sRXcc-52、sRXCC-55、sRXCC-56的过量表达株OE 52、OE 55、ROE56在辣椒叶片上出现HR反应的时间比对照组WT/pBBad18K早;(7)其它的缺失突变体和过量表达株的所有表型检测结果几乎与对照菌株的完全一样。检测结果表明：(1)小rna sRXCC-49、sRXCC-50、sRXCC-51、sRXCC-52、 sRXCC-53、sRXCC-55与Xcc的生长有关;(2)小rna sRXCC-49、sRXCC-52、 sRXCC-55、sRXCC-56在Xcc8004的过敏反应中可能起着重要的调控作用。综上所述,本工作验证了十个Xcc候选小rna的存在,确定了它们的转录方向,并对它们的生物学功能进行了鉴定。结果发现了六个小rna (sRXCC-49、sRXCC-50、sRXCC-51、sRXCC-52、sRXCC-53、sRXCC-55)与生长有关,四个(sRXCC-49、sRXCC-52、sRXCC-55、sRXCC-56)与HR反应有关。这些结果增加了人们在小rna功能研究领域的知识,为深入探讨小rna在Xcc中的具有怎样的功能以及如何参与机理调控提供了重要的素材。

关键词：十字花科黑腐病菌小rna 功能鉴定过量表达缺失

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立枯丝核菌AG-1的比较转录组和小rna研究

立枯丝核菌AG-1的比较转录组和小RNA研究

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作者：王嫣然四川农业大学

学位级别：硕士

立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1是一类重要的植物病原菌,寄主能够达到近50种,包括水稻、玉米、大麦、大豆、莴苣、番茄等多种重要粮油作物及蔬菜水果。由Rhizoctonia solani AG-1IA引起的水稻纹枯病是水稻的三大病害之一,在我国发... 详细信息

立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG-1是一类重要的植物病原菌,寄主能够达到近50种,包括水稻、玉米、大麦、大豆、莴苣、番茄等多种重要粮油作物及蔬菜水果。由Rhizoctonia solani AG-1IA引起的水稻纹枯病是水稻的三大病害之一,在我国发生面积非常广阔、流行性极强且频率高,造成的产量损失大。该病可从苗期到穗期都对水稻产生危害,并且以抽穗前后时期最严重,主要侵染水稻的叶片和叶鞘,也会侵入茎秆并蔓延到穗部,造成倒伏或整株枯死,或导致稻株不能够正常地抽穗,成为水稻稳产高产不可忽视的障碍,如何有效控制Rhizoctonia solani AG-1的发生与危害非常值得关注。本研究的目的在于从病原菌基因组比较转录水平和侵染过程的小rna表达调控水平寻求病害侵染和发生机制的可能性依据,为病原菌的有效防治提供可靠的理论依据。为此,一方面,我们从细胞学上观察并比较立枯丝核菌1类融合群AG-1IA、IB、IC的侵染寄主的过程和特点,通过Illumina GA II技术完成3个亚群的转录组测序、组装和注释,并对3个亚群转录组进行比较和分析,同时侧重对这3个亚群转录本的转录表达致病因子分泌小蛋白进行预测和比较分析,试图寻找转录特点与它们的致病特异性之间的相关性,比较分析并验证不同亚种中分泌致病小蛋白在致病机制中的差异和特点;另一方面,我们研究AG-1IA在侵染水稻过程中6个不同时期小rna的差异表达特点,预测并分析与致病基因表达调控相关的小rna和靶基因,从小rna负调控致病靶基因方面解析病原菌侵染寄主的过程和特点。本研究主要包括以下结论：1、通过致病性测定、侵染过程和侵染结构的显微观察,我们观察到接种病原菌不同融合亚群IA、IB和IC到不同寄主时,出现病斑的大小、特点不同;其中,比较分析侵染过程中产生的侵染结构：侵染垫和附着胞,以及菌丝的直接侵入和从气孔侵入的侵染特征差异。2、在转录组分析过程中,分别获得平均长度为75bp的6,367,931个reads (IATS),6,038,800个reads (IBTS)和5,104,515个reads(ICTS)的cDNA文库;测序后经过组装分别得到17,020,336bp、17,354,840bp和14,807,518bp的序列,以及21,542、20,487和18,503个转录本。其中,14,124,358bp的序列在IA基因组中预测到。3、运用3种预测方法对IA、IB和IC的转录组序列进行综合预测并获得20,732(96.24%)、19,827(96.78%)和17,938(96.95%)个ORFs。与多个数据库比对得到在IA、IB和IC分别有11129(53.68%)、10886(54.90%)和10161(56.65%)个转录本可比对到已知基因,并进行了基因的KOG分类,及致病性相关的功能蛋白的分析。4、在转录组数据验证过程中,我们选取了部分蛋白进行PCR验证,与测序结果基本一致,说明组装结果的可靠性。同时对转录表达预测到编码与致病性存在高度关联的富半胱氨酸的分泌小蛋白的基因进行克隆和诱导表达,并进行对寄主的HR生物活性检测。5、侵染寄主小RAN分析方面,我们得到IA营养生长时期的以及侵染各时期(10h、18h、24h、32h、48h、72h)的小rna预测数目。其中,侵染时期2(18h)的总小rna数最多,是其他侵染时期的8到9倍。统计各个时期小rna的大小分布,长度从18到28nt,峰值在23或24nt。将这些序列比对到基因组,发现除未注释的srna外最多的是rrna。与基因组比较,各个时期的小rna在基因组的分布趋势相似。6、通过软件预测获得264条新mirna,对这些新mirna进行靶基因预测,结果发现靶基因功能主要为binding、catalytic activity、cell、cell part、cellular process和metabolic process六类。7、对样品中表达的已知mirna进行统计,分析样品两两之间的表达差异,形成表达模式聚类分析图,推测这些发生了显著或极显著差异表达的已知mirna可能通过其上调或下调的差异性表达参与到侵染水稻的过程。8、完成对差异表达的mirna的靶基因预测和GO分析,发现病原菌在侵染的不同阶段mirna的调节差异。

关键词：立枯丝核菌AG-1 Illumina测序转录组小rna

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实时荧光定量PCR方法检测小rna

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中国细胞生物学学报 2010年第3期32卷 359-360页

作者：贺小宏刘默芳兰州大学生命科学院兰州730000 中科院上海生命科学研究院生化细胞所rna研究技术平台上海200031

Real—time Quantitative PCR Detecting System，即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检测系统，简称定量PCR（qPCR）。荧光定量PCR-般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧... 详细信息

Real—time Quantitative PCR Detecting System，即实时定量核酸扩增检测系统，也称为实时定量基因扩增检测系统，简称定量PCR（qPCR）。荧光定量PCR-般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR（以SYBRGreen I为例）方法对小rna进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小rna的优点为：实验设计简单，一般需要一条特异性反转录引物，一条特异性正向PCR引物，反向PCR引物可通用于所有小rna分析，无需象TaqMan方法那样专门设计探针；实验成本相对较低；可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术，而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下：

关键词：荧光定量PCR PCR方法小rna 检测系统实时定量 PCR引物非特异性 TaqMan

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