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实时pcr仪中温度控制的计算与模拟

中国生物医学工程学报 2007年第2期26卷 195-198页

作者：刘长波冯继宏北京工业大学生命科学与生物工程学院生物医学工程中心 100022

本研究自行设计了一个pcr反应池的模型,并对该反应池和反应样品的温度进行了理论计算,在此基础上进行了温度场动态分布仿真分析,仿真结果与理论计算相吻合,为自行设计的实时pcr仪的研发提供了理论基础。

关键词：温度控制实时pcr 有限元分析

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登革病毒实时荧光pcr快速检测技术研究

卫生研究 2006年第6期35卷 736-738页

作者：刘建军阳帆何建凡陈家敏何雅青杨洪深圳市疾病预防控制中心深圳518020

目的建立TaqmanMGB实时荧光pcr技术快速检测登革病毒。方法利用TaqmanMGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光pcr通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光... 详细信息

目的建立TaqmanMGB实时荧光pcr技术快速检测登革病毒。方法利用TaqmanMGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光pcr通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光pcr检测登革病毒的快速方法。并对8份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT-pcr及荧光pcr扩增。结果RT-pcr检测8份临床血清标本，2份阳性，阳性率为25％。实时荧光pcr检测登革病毒cDNA灵敏度为0．17pg／μl，病毒液灵敏度为10^-5TCID50与乙脑病毒无交叉反应，检测8份临床血清标本，5份阳性，阳性率为62．5％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论TaqmanMGB实时pcr检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。

关键词：登革病毒 RT-pcr Taqman MGB 实时pcr

采用实时pcr技术比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2009年第2期27卷 130-134页

作者：陈盛霞吴亮沈玉娟章秋霞李婷婷姜旭淦徐馀信曹建平中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025 江苏大学基础医学与医学技术学院镇江212013

目的比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA的效果。方法将分离纯化的隐孢子虫卵囊分别加入美国Promega公司(简称Promega)和上海捷瑞公司(简称捷瑞)基因组DNA纯化试剂盒的裂解液、2%TritonX-100和5%异硫氰酸胍,同时联合使用冻融法、蛋白酶K... 详细信息

目的比较不同方法提纯隐孢子虫卵囊DNA的效果。方法将分离纯化的隐孢子虫卵囊分别加入美国Promega公司(简称Promega)和上海捷瑞公司(简称捷瑞)基因组DNA纯化试剂盒的裂解液、2%TritonX-100和5%异硫氰酸胍,同时联合使用冻融法、蛋白酶K法和声裂法裂解卵囊,用试剂盒法或Chelex-100法提纯卵囊基因组DNA,用实时pcr测定隐孢子虫卵囊囊壁蛋白(COWP)基因拷贝数,以Promega试剂盒为参照比较不同纯化方法的提纯效果。结果Promega试剂盒的裂解液裂解隐孢子虫卵囊的效果最好,纯化所得卵囊COWP基因拷贝数可达(6.45～9.86)×106;其他依次为捷瑞试剂盒的裂解液[(2.38～3.69)×106]、5%异硫氰酸胍[(1.27～21.29)×105]和2%TritonX-100[(2.06～866.70)×103]。冻融法+蛋白酶K法+声裂法提纯隐孢子虫卵囊DNA效果最佳,其次为冻融法+声裂法和蛋白酶K法+声裂法,冻融法+蛋白酶K法效果最差。结论冻融法+蛋白酶K法+声裂法联合使用能使卵囊DNA的提纯效率达到最大,捷瑞基因组DNA纯化试剂盒和5%异硫氰酸胍裂解法提纯隐孢子虫卵囊DNA可获得与Promega试剂盒相近的效果。

关键词：隐孢子虫卵囊实时pcr DNA 提纯

应用Taqman实时pcr法检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌

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卫生研究 2014年第2期43卷 177-183页

作者：闫琳王晓英郭云昌裴晓燕余东敏杨大进国家食品安全风险评估中心北京100022

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时pcr方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时pcr法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时pcr进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。... 详细信息

目的建立敏感快速的检测猪肉中单核细胞增生李斯特菌的实时pcr方法。方法以hlyA基因为靶标,建立并验证实时pcr法的特异性。选用单核细胞增生李斯特菌CMCC 54004,制备不同浓度的纯菌液,用实时pcr进行检测,制作标准曲线并计算扩增效率。进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g猪肉样本1.3×100、1.3×101、1.3×102、1.3×103、1.3×104、1.3×105和1.3×106CFU。分别在增菌0、4、8、12、18、24、30、36和46 h取1 ml培养液,提取DNA进行实时pcr检测,并用pcr和传统方法进行检测,比较3种方法检测的敏感性和特异性。采集24份市售猪肉样本,用这3种方法进行检测,进一步比较三者的阳性检出率。结果建立的实时pcr法特异性好,对纯菌液的检出限为1.3×103CFU/ml。人工染菌样本增菌24 h后,实时pcr检出限1.3 CFU/25 g,pcr及传统方法达到这一检出限需要增菌46 h。根据增菌24 h的检测结果,建立实时pcr样本标准曲线。24份猪肉样本,实时pcr检出17份阳性,阳性率70.83%(17/24),与pcr和传统方法的阳性率一致。根据所得的样本标准曲线,对检测样本进行定量分析,确定了阳性样本中初始含量菌。结论所建立的实时pcr具有快速简便、敏感特异等优点,整个操作可在27 h内完成,适用于猪肉中单核细胞增生李斯特菌的快速定量检测。

关键词：实时pcr 单核细胞增生李斯特菌检测猪肉

实时pcr和cycling probe技术检测母血浆游离胎儿DNA筛选重型β地中海贫血胎儿

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南方医科大学学报 2008年第7期28卷 1210-1213页

作者：陈熙任景慧郭辉林琳华姚秋璇暨南大学第二临床医学院／深圳市人民医院广东深圳518020

目的通过检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA来筛选重型β-地中海贫血胎儿。方法选择行产前基因诊断的夫妇6对,孕妇孕周23-26周。血液学检查:胎儿的父亲均为β-地中海贫血17M/N型,孕妇本人为携带除17M/N型之外的另一β-地中海贫血突变类型... 详细信息

目的通过检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA来筛选重型β-地中海贫血胎儿。方法选择行产前基因诊断的夫妇6对,孕妇孕周23-26周。血液学检查:胎儿的父亲均为β-地中海贫血17M/N型,孕妇本人为携带除17M/N型之外的另一β-地中海贫血突变类型。针对CD17(A→T)无义突变,设计β-珠蛋白肽链上该等位基因的一对特异性引物和通过cycling probe法分别设计检测正常基因序列和基因突变位点的两条荧光探针,分别用FAM和HEX荧光标记。结合RT-pcr技术检测孕妇外周血中游离胎儿DNA,诊断胎儿是否遗传了其父亲的β地中海贫血17M/N碱基突变位点。同时与脐血血液学检查所诊断的胎儿地贫基因型对照。结果提取的6例孕妇血浆DNA模板中有3例同时显示FAM和HEX荧光信号值阳性结果,即这3例孕妇的胎儿遗传了父亲β-珠蛋白肽链上CD17位点的突变碱基(A→T)。另外3例孕妇血浆DNA模板的FAM信号值阳性,HEX信号值阴性,即所孕胎儿没有遗传父亲的CD17位点的突变碱基。结论利用RT-pcr和cycling probe技术检测孕妇外周血中的游离胎儿DNA可用来筛选患重型地中海贫血的胎儿。

关键词：实时pcr 游离胎儿DNA β-地中海贫血产前诊断

大鼠血管组织血管紧张素原基因表达的实时pcr定量分析

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中国应用生理学杂志 2005年第2期21卷 231-234页

作者：暴军香赵锦荣白玉杰张立藩第四军医大学航空航天生理学教研室第四军医大学基因诊断研究所陕西西安710032

目的:探讨大鼠血管组织血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)低丰度mRNA表达的实时pcr定量分析方法,并将其用于检测模拟失重大鼠基底和股动脉血管组织AGTmRNA的表达。方法:提取8周模拟失重(SUS)与对照组(CON)大鼠血管组织的总RNA,进行反... 详细信息

目的:探讨大鼠血管组织血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)低丰度mRNA表达的实时pcr定量分析方法,并将其用于检测模拟失重大鼠基底和股动脉血管组织AGTmRNA的表达。方法:提取8周模拟失重(SUS)与对照组(CON)大鼠血管组织的总RNA,进行反转录后,对目的基因AGT与内参照基因GAPDH的mRNA进行实时pcr分析。应用TaqMan MGB探针,测出上述mRNA实时pcr反应的放大效率(E)及阈循环数Ct,再依据一定数学模型由E与Ct得出经GAPDH归一化的AGTmRNA表达变化。结果:与CON相比,SUS大鼠基底动脉组织AGTmRNA表达增加240%,而股动脉组织则降低66%。结论:本工作为定量检测大鼠血管组织低丰度mRNA表达提示了一种特异、灵敏、精确、重复性好的简便方法。

关键词：模拟失重血管局部肾素-血管紧张素系统基因表达实时pcr

分子信标-实时pcr法快速检测双歧杆菌的研究

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微生物学通报 2007年第6期34卷 1163-1168页

作者：王超孟祥晨东北农业大学乳品科学教育部重点实验室食品学院哈尔滨150030

为建立双歧制品中双歧杆菌快速、敏感、特异的检测方法,根据双歧杆菌16SrRNA/16SrDNA基因设计合成了双歧杆菌属特异性引物和分子信标探针,建立了快速检测双歧杆菌的分子信标-实时pcr检测方法,并对反应条件进行优化。检测方法重复性好,... 详细信息

为建立双歧制品中双歧杆菌快速、敏感、特异的检测方法,根据双歧杆菌16SrRNA/16SrDNA基因设计合成了双歧杆菌属特异性引物和分子信标探针,建立了快速检测双歧杆菌的分子信标-实时pcr检测方法,并对反应条件进行优化。检测方法重复性好,批内和批间变异系数均小于5%;特异性强,扩增曲线呈现明显的S型,无非特异性扩增;灵敏度高,是普通pcr的100倍,对纯双歧杆菌DNA的检出限为5.7fg/pcr反应体系,纯双歧杆菌菌液的检出限为2×103CFU/mL;线形范围宽,起始模板数在2×108CFU/mL～2×104CFU/mL之间具有良好的线性关系,相关系数大于97%。该方法具有灵敏、特异、简便和快速的特点,可用于对双歧杆菌原位菌数的定量检测。

关键词：双歧杆菌分子信标实时pcr 探针检测

稻曲病菌分生孢子实时pcr定量检测方法的建立及初步应用

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中国水稻科学 2012年第4期26卷 500-505页

作者：郑静张震姜华王艳丽柴荣耀邱海萍毛雪琴王教瑜杜新法赖朝晖孙国昌浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华321004 浙江省植物有害生物防控重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地/浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所浙江杭州310021 浙江省象山县植物保护检疫站浙江象山315700

根据稻曲病菌核糖体转录间隔区(ITS)序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时pcr定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性... 详细信息

根据稻曲病菌核糖体转录间隔区(ITS)序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时pcr定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性好,最低可检出24fg的稻曲病菌基因组DNA模板量;以梯度稀释分生孢子液提取的基因组DNA为模板,建立孢子数量常用对数值与Ct值的线性关系,理论上最低可检测出0.67个分生孢子。对3个时间点的田间孢子捕捉样品进行检测,结果显示不同月份间稻曲病菌孢子数量存在差异。

关键词：稻曲病菌分生孢子实时pcr 核糖体转录间隔区

双重实时pcr快速同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第12期24卷 1004-1007页

作者：扈庆华郑薇薇石晓路李庆阁王冰庄志雄刘小立贺连华吴平芳 518020 深圳市疾病预防控制中心厦门大学生命科学学院

目的建立改良分子信标双重实时pcr同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(T... 详细信息

目的建立改良分子信标双重实时pcr同时检测霍乱弧菌和副溶血弧菌的快速方法,应用于霍乱监测、副溶血弧菌食物中毒的快速诊断和海产品检验。方法根据GenBank公布的霍乱弧菌肠毒素基因A亚单位(ctxA)和副溶血弧菌的耐热直接溶血毒素基因(TDH)的保守序列,分别设计引物和改良分子信标探针,以10种细菌作对照,建立双重实时pcr改良分子信标检测体系,应用于副溶血弧菌食物中毒快速诊断和霍乱监测。结果改良分子信标双重实时pcr反应体系DNA灵敏度为102.4～166.6fgμl,菌液灵敏度为32～64CFUml或3～6CFUpcr反应体系,无交叉反应。此反应体系同时检测40株副溶血弧菌和50株霍乱弧菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对3起细菌性食物中毒共48份样品和100份海产品进行检测,9份副溶血弧菌实时pcr阳性,其中7份副溶血弧菌细菌培养阳性,其余样品都为阴性。从样品处理到检测结果仅需1天时间。结论改良分子信标双重实时pcr检测体系快速、灵敏度高、特异性强,可用于霍乱和副溶血弧菌食物中毒的快速诊断,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。

关键词：实时pcr 副溶血弧菌霍乱弧菌同时检测食物中毒快速诊断改良分子信标 DNA 保守序列