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荧光探针法和疏水相互作用层析法分析蛋白表面疏水性

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荧光探针法和疏水相互作用层析法分析蛋白表面疏水性

作者：余晶梅浙江大学

学位级别：硕士

蛋白表面疏水性是蛋白质的重要特性之一,对于维持蛋白质的稳定构象及生物活性有着重要作用,同时又是疏水作用为主的层析分离蛋白质方法的重要依据。了解蛋白质在不同条件下表面疏水特性的变化,有助于理解其结构变化和生理活性,对于优化... 详细信息

蛋白表面疏水性是蛋白质的重要特性之一,对于维持蛋白质的稳定构象及生物活性有着重要作用,同时又是疏水作用为主的层析分离蛋白质方法的重要依据。了解蛋白质在不同条件下表面疏水特性的变化,有助于理解其结构变化和生理活性,对于优化蛋白分离过程也有指导意义。本文利用荧光探针法和疏水相互作用层析(HIC)法,探究不同因素对蛋白表面疏水性的影响,得到一些规律性认识。主要结果如下：首先以8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐(ANS)为荧光探针,优选了测定体系的pH值和ANS浓度,测定蛋白质的表面疏水性指数S0,考察了温度、盐、变性剂、辛酸钠(NaCA)等对牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白(bIgG) So的影响。发现温度对BSA和bIgG表面疏水性的影响呈现相反的规律。不同盐对蛋白表面疏水性的影响与相关离子的Hofmeister序列位置相关,稳液盐和中性盐存在时蛋白质的S0值大于离液盐条件下的S0值。BSA和bIgG的表面疏水性受十二烷基磺酸钠(SDS)的影响存在较大差异。盐酸胍浓度升高,BSA的S0值明显减小,而bIgG的S0值先增大后减小。NaCA浓度提高,BSA的S0值逐渐减小,而bIgG的S0值则几乎没有变化。运用荧光光谱法进一步分析荧光探针-蛋白质的结合作用,比较多种数据处理方法。结果表明,Scatchard非线性方程适合分析BSA-ANS及IgG-ANS体系,获得结合位点数分别为5.8和10.7,结合常数分别为3.37×106M-1和3.34×104M-1。利用Adair公式分析BSA-ANS体系,不仅获得结合位点数5,还可得到各位点相应的结合常数。采用疏水相互作用层析法,以Phenyl Sepharose6FF为层析介质,选取牛血清白蛋白(BSA)、牛免疫球蛋白(bIgG)和溶菌酶为模型蛋白,测定不同条件下蛋白的容量因子k',表征蛋白的表面疏水性变化。发现三种蛋白质的lnk'随着(NH4)2SO4和NaCl浓度升高而增大,随NaSCN浓度增大而减小。基于优先相互作用理论计算得到的三种蛋白质在稳液盐(NH4)2SO4和中性盐NaCl存在时的水分子释放数为正值,而离液盐NaSCN条件下,水分子释放数为负值。相同浓度Na2SO4、(NH4)2SO4NaCl、 NH4Cl及NaSCN溶液,BSA和bIgG对应的k’依次减小。pH在3-8范围内,对于BSA和溶菌酶,pH值越接近等电点,k’值越大,而bIgG的k’值则随pH的升高而增大。三种蛋白质的k’值受盐酸胍浓度影响的整体趋势相同,均随盐酸胍浓度的升高而减小。辛酸钠浓度从0升高至75mM, BSA的k’值先减小后增大,而bIgG的k’值则保持在1.7左右。随着乙醇添加量的增大,三种蛋白质的k’值均不断减小。比较荧光探针法测定的S0和疏水相互作用层析法测得的k’,发现二者具有较好的相关性。不同NaCl、(NH4)2SO4浓度以及不同盐类存在时,BSA和bIgG的S0能与容量因子较好地对应。BSA的S0随盐酸胍浓度的变化情况与k’值的变化一致。保持辛酸钠/蛋白质的浓度比相同,荧光探针法测得的辛酸钠浓度0～4.5mM范围内的S0值与辛酸钠浓度为0～50mM时BSA的k’值变化规律相同。结果表明,荧光探针测定的蛋白质在不同溶液中的表面疏水性指数在一定程度上可以预测蛋白质在疏水层析柱上的保留行为。本文利用荧光探针法和疏水相互作用层析法考察了不同因素对蛋白表面疏水性的影响,得到了一些规律性的认识。一方面充分了解蛋白质的表面疏水特性,有助于提高蛋白质的稳定性,为蛋白质的贮存和配方优化提供指导;另一方面,对于疏水结合起主导作用的疏水相互作用层析和疏水性电荷诱导层析等蛋白分离过程,表面疏水性信息有助于预测蛋白质的保留行为,改善分离过程,提高分离效率。

关键词：蛋白质表面疏水性荧光探针表面疏水性指数疏水相互作用层析容量因子

Andrews型M-估计GM(1,1)模型在色谱保留值研究中的应用

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计算机与应用化学 1999年第3期16卷 191-194页

作者：李峰李永干关大任山东省滨州地区环保监测站山东省滨州师专计算机科学系山东大学理论化学研究室

提出了Ａｎｄｒｅｗｓ型Ｍ估计ＧＭ（１，１）灰色模型，并用此模型对８种多环芳烃化合物容量因子与流动相组成之间的关系进行了关联。结果表明，该模型较常规ＧＭ（１，１）模型具有更好的抗干扰性能和受异常值影响小的优点，因此它... 详细信息

提出了Ａｎｄｒｅｗｓ型Ｍ估计ＧＭ（１，１）灰色模型，并用此模型对８种多环芳烃化合物容量因子与流动相组成之间的关系进行了关联。结果表明，该模型较常规ＧＭ（１，１）模型具有更好的抗干扰性能和受异常值影响小的优点，因此它可以取代常规ＧＭ（１，１）模型。

关键词： Andrews 液相色谱容量因子色谱保留值

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超临界流体色谱提纯冬凌草甲素实验研究

超临界流体色谱提纯冬凌草甲素实验研究

作者：张艳稳天津大学

学位级别：硕士

冬凌草甲素是冬凌草中的萜类药用有效成分,具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤之功效。传统制备工艺以冬凌草为原料,采用有机溶剂进行提取,然后采用层析、重结晶等方法进一步精制。工艺流程冗长,操作繁杂费时,使用丙酮、氯仿等... 详细信息

冬凌草甲素是冬凌草中的萜类药用有效成分,具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤之功效。传统制备工艺以冬凌草为原料,采用有机溶剂进行提取,然后采用层析、重结晶等方法进一步精制。工艺流程冗长,操作繁杂费时,使用丙酮、氯仿等有机溶剂,不能适应日趋严格的环保要求。本课题针对传统工艺提取冬凌草甲素存在的问题,采用超临界流体技术对冬凌草甲素的提取和分离过程开展了实验研究。首先对冬凌草甲素的超临界流体萃取(SFE)过程的工艺条件进行了研究。通过分析不同夹带剂对SFE过程中冬凌草甲素提取率的影响,选择水含量为10%的乙醇/水混合溶液作为夹带剂;通过正交实验得到以下SFE冬凌草甲素适宜的工艺条件:压力35 MPa,温度328.15 K,夹带剂流量4 mL/min,CO2流量25 g/min;各因素对提取率的影响程度为:夹带剂流量>萃取压力>萃取温度>CO2流量;冬凌草甲素的提取率达到0.402%。采用石油醚和乙酸乙酯萃取的方法对SFE提取液进行了预处理,解决了超临界流体色谱(SFC)过程色谱峰分离度差、拖尾严重等问题,冬凌草甲素含量(溶液脱除溶剂后在固相物中的含量)由8.06%提高到19.94%。首次采用了SFC技术对冬凌草提取液进行了分离纯化。通过SFC分离冬凌草甲素的实验研究,确定了冬凌草提取液样品进行SFC分离操作较适宜的工艺条件:色谱柱为极性氰基柱(250 mm×9.4 mm, 5μm),改性剂为甲醇(加入量8%),CO2流量18 g/min,温度313.15 K,压力12 MPa,紫外检测器波长238 nm。在此实验条件下,冬凌草甲素的容量因子为7.23,冬凌草甲素峰与相邻组分峰A的分离度为1.45,冬凌草甲素产品纯度达到84.4%。在实验研究的基础上,利用分子模拟的MD方法完成了scCO2/CH3OH二元混合流体密度的预测;采用五参数平均晶格场模型,对冬凌草甲素容量因子的实验值与密度和温度进行了关联,得到R 2= 0.903 > 0.9,Fc= 7.23 > F0.01,说明采用五参数平均晶格场模型,能够对scCO2/甲醇为流动相的SFC分离冬凌草甲素过程的容量因子变化规律进行较好的描述;得到SFC分离冬凌草甲素容量因子与温度和密度关联的模型方程:

关键词：冬凌草甲素超临界流体萃取超临界流体色谱容量因子分离度

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高效液相色谱法测定杜仲中京尼平甙酸

光谱实验室 2004年第4期21卷 715-718页

作者：陈晓青贺前锋李宇萍中南大学化学化工学院长沙市岳麓区410083 广州美晨集团中药保健室

ODS- C18色谱柱 (2 0 0 mm× 4 .6 mm,5 μm) ,甲醇 -水 -冰乙酸 (12∶ 87∶ 1)为流动相 ,高效液相色谱法测定了杜仲中京尼平甙酸的含量 ,考察了流动相组成、酸性添加剂对色谱分离效果的影响 ,流速 1.0 m L/ min时 ,京尼平甙酸的容量因... 详细信息

ODS- C18色谱柱 (2 0 0 mm× 4 .6 mm,5 μm) ,甲醇 -水 -冰乙酸 (12∶ 87∶ 1)为流动相 ,高效液相色谱法测定了杜仲中京尼平甙酸的含量 ,考察了流动相组成、酸性添加剂对色谱分离效果的影响 ,流速 1.0 m L/ min时 ,京尼平甙酸的容量因子 k′在 2— 3之间 ,分离度大于 1,保留时间为 6 .9min,样品分析时间在 30 min之内 ,满足色谱分析要求。京尼平甙酸在 0 .0 36— 1.36 mg/ m L时 ,色谱峰面积与样品量呈良好的线性关系 ,线性方程为 A=6 375 6 +132 72 6 0 C,相关系数 r=0 .9996。

关键词：杜仲高效液相色谱法京尼平甙酸容量因子

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超临界流体色谱提纯青蒿素的实验研究

超临界流体色谱提纯青蒿素的实验研究

作者：庞斐天津大学

学位级别：硕士

青蒿素是附加值较高的药用有效成分,具有抗疟疾、抗肿瘤等药理作用,是我国唯一获得国际承认的抗疟新药。传统青蒿素分离提纯工艺存在提取率不高、步骤繁杂、溶剂损耗高、产品中溶剂残留多等问题,不能实现绿色清洁生产。超临界流体(SCF)... 详细信息

青蒿素是附加值较高的药用有效成分,具有抗疟疾、抗肿瘤等药理作用,是我国唯一获得国际承认的抗疟新药。传统青蒿素分离提纯工艺存在提取率不高、步骤繁杂、溶剂损耗高、产品中溶剂残留多等问题,不能实现绿色清洁生产。超临界流体(SCF)具有气体的低黏度和高扩散性,又兼有与液体相近的密度和溶解能力。超临界流体萃取(SFE)和超临界流体色谱(SFC)技术则是利用了SCF的特殊性质而发展起来的对环境友好的、高效新型的化工分离提纯技术,现已应用于天然药物和食品等的提取精制。本文将SFC技术首次应用于青蒿提取液中青蒿素的提纯。本文选择甲醇、乙醇、乙酸乙酯和正己烷为SFE青蒿的夹带剂,通过筛选,确定了SC-CO2/乙酸乙酯为较适宜的萃取剂,并确定了萃取时间为2.5小时。采用该方法进行青蒿的SFE操作,青蒿素的提取率是采用纯SC-CO2为萃取剂的2.06倍。青蒿提取液的SFC提纯制备实验,选用了非极性的Zorbax SB-C18(9.4×250mm I.D.,5μm)色谱柱为固定相,SC-CO2为流动相,通过考察CO2流速对青蒿素峰和相邻色谱峰分离度的影响,以及压力和温度对青蒿素容量因子和分离度的影响,确定了较适宜的SFC提纯制备条件为:CO2流速22g·min-1,柱温313.15K,柱压11MPa,进样量0.05mL,紫外检测器波长203nm。在此工艺条件下提纯青蒿提取液,得到质量百分含量为74.825%的青蒿素结晶。完成了SFC提纯制备青蒿素过程中保留值规律的有关研究。选用平均晶格场模型,根据实验结果,利用MATLAB,求解了模型中的基本参数,并对青蒿素的容量因子与密度和温度进行了关联,得到如下模型方程:通过不同操作条件下青蒿素容量因子的计算值和实验值的比较表明:计算值和实验值的平均相对偏差为6.002%,二者吻合较好;说明平均晶格场模型能够很好的描述以SC-CO2为流动相的SFC提纯过程中,青蒿素容量因子的变化规律。

关键词：青蒿素夹带剂超临界流体制备色谱容量因子分离度

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旱改水对土壤铜含量及其有效性的影响研究

中国生态农业学报 2004年第3期12卷 68-71页

作者：丁维新陈冬峰刘元昌中国科学院南京土壤研究所南京210008

旱改水对土壤Cu含量及其有效性的影响研究结果表明 ,代换态铜是土壤中Cu的强度因子 ,而晶形铁结合态铜和残留态铜为植物无效态铜且需经形态转化才有效 ,其他形态铜既是容量因子也是强度因子 ,其有效程度大致为无定形铁结合态铜 >有机结... 详细信息

旱改水对土壤Cu含量及其有效性的影响研究结果表明 ,代换态铜是土壤中Cu的强度因子 ,而晶形铁结合态铜和残留态铜为植物无效态铜且需经形态转化才有效 ,其他形态铜既是容量因子也是强度因子 ,其有效程度大致为无定形铁结合态铜 >有机结合态铜 >氧化锰结合态铜 >碳酸盐结合态铜。旱改水促进碳酸盐结合态铜、氧化锰结合态铜尤其是残留态铜向代换态铜、无定形铁结合态铜和有机态铜转化 ,提高土壤铜有效性和可移动性 ,并使Cu淋溶损失。

关键词：旱改水土壤铜含量有效性容量因子

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超临界流体色谱分离茄尼醇的实验研究

超临界流体色谱分离茄尼醇的实验研究

作者：徐晓芳天津大学

学位级别：硕士

超临界流体具有气体的高扩散性和低粘度,又兼有与液体相近的密度和溶解能力的特性。超临界流体色谱是以超临界流体作为流动相的色谱分离过程,是一种对环境友好的、高效的、新型的化工分离技术,适合于天然产物,药物,热敏性物质等的分离... 详细信息

超临界流体具有气体的高扩散性和低粘度,又兼有与液体相近的密度和溶解能力的特性。超临界流体色谱是以超临界流体作为流动相的色谱分离过程,是一种对环境友好的、高效的、新型的化工分离技术,适合于天然产物,药物,热敏性物质等的分离和微量杂质的脱除。茄尼醇作为附加值较高的药用有效成分,具有抗菌、消炎和止血等药理作用,是合成维生素K和辅酶Q等的重要原料。传统茄尼醇分离工艺存在提取率低,步骤繁杂,溶剂损耗高,产品中溶剂残留多等问题。本文首次将超临界流体色谱技术应用于烟叶提取物中茄尼醇的分离。首先利用SC-CO/乙醇作为萃取剂,萃取烟叶中的茄尼醇。由于烟叶提取物中含有的部分杂质会污染色谱柱,使SFC分离操作不能正常进行。采用皂化和脱蜡方法对茄尼醇提取液进行预处理,脱除了影响SFC分离操作的杂质。茄尼醇的超临界流体色谱分离研究采用ZORBAX SB-C18(250mm×9.4mm I.D., 5μm)色谱柱为固定相,SC-CO/甲醇作为流动相,考察了流动相流速和改性剂含量对分离度的影响,以及温度和压力对茄尼醇容量因子,茄尼醇与相邻色谱峰组分分离度和选择性因子的影响。通过SFC分离,茄尼醇含量由7.93%提高到47.98%。在实验研究的基础上,采用简化的五参数平均晶格场模型,对SFC分离茄尼醇的容量因子进行了关联。模型关联的平均相对误差为4.87%,与实验值吻合较好。

关键词：茄尼醇超临界流体色谱容量因子改性剂

磺胺类药物的 HPLC 参数 log k'与生物活性之间的关系

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中国药科大学学报 1982年第2期 1-9页

作者：张胜强安登魁吴如金盛龙生南京药学院药物分析教研室南京药学院药物分析教研室 1981届研究生

本文研究了磺胺类药物的 HPLC 参数 log k’与辛醇/水分配系数的对数值 log P 的关系以及 log k’与磺胺类药物体外抑制大肠杆菌活性的关系。通过对这两个关系的比较,提出可用色谱参数 log k’代替 Hansch 方程中的iog P 进行磺胺类药... 详细信息

本文研究了磺胺类药物的 HPLC 参数 log k’与辛醇/水分配系数的对数值 log P 的关系以及 log k’与磺胺类药物体外抑制大肠杆菌活性的关系。通过对这两个关系的比较,提出可用色谱参数 log k’代替 Hansch 方程中的iog P 进行磺胺类药物构效关系的研究。同时指出,对于所试验的磺胺类药物来说,log k’可以成为一个较好的疏水性参数。

关键词：磺胺类药物高效液相色谱法容量因子

肽的高效液体色谱——反相色谱上移动相的选择

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化学学报 1981年第Z1期 741-747页

作者：胡振元夏立钧朱慕珏徐杰诚陈玲玲钱翠鹤中国科学院上海有机化学研究所

以二肽Ala-Phe(1)、酸性三肽Ala-Phe-Asp(2)、碱性三肽His-Ala-Phe(3)和四肽His-Ala-Phe-Asp(4)为对象,考察以堆积硅珠为基体的十六烷基键合的反相液体色谱担体上,移动相条件(包括有机调节剂浓度、介质酸度和配对离子性质)对色谱保留的... 详细信息

以二肽Ala-Phe(1)、酸性三肽Ala-Phe-Asp(2)、碱性三肽His-Ala-Phe(3)和四肽His-Ala-Phe-Asp(4)为对象,考察以堆积硅珠为基体的十六烷基键合的反相液体色谱担体上,移动相条件(包括有机调节剂浓度、介质酸度和配对离子性质)对色谱保留的影响.从实验结果发现有机调节剂(甲醇)的浓度不仅影响保留值,而且也会影响选择性.介质的pH对保留的影响最为显著,中性肽、酸性肽或碱性肽各显示有特征关系.因此,pH不仅影响保留值也影响选择性.此外,不同阳或阴配对离子对肽的色谱保留也有显著影响,这种影响与肽的结构也密切相关.

关键词：反相色谱移动相磷酸钾盐缓冲液甲醇容量因子甲醇浓度一元醇保留值离子化高效液体色谱