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人IL-35单克隆抗体制备及其在定量elisa检测方法中的应用

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生物工程学报 2019年第9期35卷 1723-1735页

作者：何峰容孙颖乐鑫刘勇刘梦元湖北大学生命科学学院生物催化与酶工程国家重点实验室湖北武汉430062 武汉云克隆科技股份有限公司湖北武汉430056 药物高通量筛选国家与地方联合工程研究中心湖北武汉430062

为了建立人白细胞介素-35 (IL-35)的定量elisa检测方法,RT-PCR克隆了人IL-35的IL-27EBI3亚基和IL-12p35亚基的编码基因,在大肠杆菌中实现了2个亚基的高效表达。以大肠杆菌表达的IL-27EBI3和IL-12p35重组蛋白作为免疫原,免疫BaLb/c小鼠,... 详细信息

为了建立人白细胞介素-35 (IL-35)的定量elisa检测方法,RT-PCR克隆了人IL-35的IL-27EBI3亚基和IL-12p35亚基的编码基因,在大肠杆菌中实现了2个亚基的高效表达。以大肠杆菌表达的IL-27EBI3和IL-12p35重组蛋白作为免疫原,免疫BaLb/c小鼠,选取阳性血清小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,用间接elisa和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选和克隆,获得了稳定分泌抗IL-27EBI3和抗IL-12p35单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在效价测定和特异性鉴定的基础上,进一步筛选出一株能稳定分泌抗IL-27EBI3单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B11和一株能稳定分泌抗IL-12p35单克隆抗体杂交瘤细胞株3A10,亚类鉴定两株单抗均为IgG1。应用单抗3B11和3A10建立了IL-35双抗夹心定量elisa检测方法,借助生物素-亲和素放大效应,该方法检测IL-35线性范围为3.12–200pg/mL,最低检测限为1.26pg/mL,与多种其他抗原的交叉反应率为0.1%,批内相对标准偏差(RSD)为5.1%–5.6%,批间RSD为5.6%–7.2%,添加回收率为89%–103%,达到定量分析的要求,为进一步组装IL-35定量elisa检测试剂盒打下了基础。

关键词：人白细胞介素IL-35 单克隆抗体定量elisa 试剂盒

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定量elisa中标准曲线平移的应用

亚太传统医药 2009年第8期5卷 151-152页

作者：陶芬湖北武警总队医院湖北武汉430061

目的:研究平移标准曲线法在elisa定量测定中的应用。方法:甲亢患者14例、甲减患者11例和体检正常者15例,取静脉血标本,分别使用fT4试剂盒、采取多标准法和平移标准法,进行5次质控血清、试验对象血清测定。结果:吸光度变化范围在0.15以内... 详细信息

目的:研究平移标准曲线法在elisa定量测定中的应用。方法:甲亢患者14例、甲减患者11例和体检正常者15例,取静脉血标本,分别使用fT4试剂盒、采取多标准法和平移标准法,进行5次质控血清、试验对象血清测定。结果:吸光度变化范围在0.15以内,同一浓度标准液吸光度间无显著性差异(P>0.05);多标准法和平移标准法测定质控血清、试验对象血清,结果无显著性差异(P>0.05);平移标准法的重复性、准确性均符合试验要求。结论:平移标准法可以在多种elisa定量测定中应用,结果准确可靠,并能节约成本。

关键词：定量elisa 标准曲线准确性医学检验

定量elisa检测小鼠血清中抗LDH-C4IgG2b抗体的水平

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昆明医学院学报 2001年第1期22卷 30-33页

作者：孙玲许金菊黄生民王晓蕾张永振曹筱梅贲昆龙中国科学院昆明动物研究所昆明650223

用定量elisa的方法检测背部携带分泌抗LDH -C4IgG2b抗体杂交瘤小鼠的血清中IgG2b抗体浓度 ,结果表明 :本法稳定 ,批间变异系数为 7 0 4%～ 13 30 % ,批内变异系数为 3 6 1%～ 10 2 0 % ;标准曲线相关性良好 ,相关系数从 0 96 2 884～ ... 详细信息

用定量elisa的方法检测背部携带分泌抗LDH -C4IgG2b抗体杂交瘤小鼠的血清中IgG2b抗体浓度 ,结果表明 :本法稳定 ,批间变异系数为 7 0 4%～ 13 30 % ,批内变异系数为 3 6 1%～ 10 2 0 % ;标准曲线相关性良好 ,相关系数从 0 96 2 884～ 0 996 795 ;灵敏度较高 ,最低检出浓度为 0 0 1mg/L ;

关键词：定量elisa LDH-C4 IgG2b 乳酸脱氢酶-C4 血清诊断单克隆抗体抗体

口蹄疫病毒非结构蛋白定量检测elisa方法的建立

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中国生物工程杂志 2009年第11期29卷 70-73页

作者：李永亮卢曾军杨苏珍田美娜谢宝霞刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点实验室国家口蹄疫参考实验室兰州730046 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室郑州450002

目的:利用口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体建立液相阻断elisa检测方法,进行定量检测口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白含量。方法:首先将工作浓度的3B单抗与待测病毒培养液过夜结合反应,然后取结合液转移至用3B蛋白包被好的酶标板上,用... 详细信息

目的:利用口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体建立液相阻断elisa检测方法,进行定量检测口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白含量。方法:首先将工作浓度的3B单抗与待测病毒培养液过夜结合反应,然后取结合液转移至用3B蛋白包被好的酶标板上,用标准3B蛋白做12个梯度做对照,同时设阴性对照和空白对照。通过回归分析算出口蹄疫病毒培养液中的非结构蛋白3B含量。结果:回归曲线呈典型的S形,符合4参数logit曲线拟合,相关系数R=0.99,检测范围为5～1500ng/ml,半数抑制浓度(Ic50)为130ng/ml。结论:该方法能特异、敏感的检测到病毒培养液中的非结构蛋白3B成分,并进行定量。

关键词：口蹄疫病毒单克隆抗体非结构蛋白定量elisa

定量检测百日咳黏附素的elisa法建立及初步应用

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中国新药杂志 2022年第9期31卷 854-858页

作者：祝传顺周振发洪禹薛莹刘冉唐林姚雷朱卫华北京智飞绿竹生物制药有限公司北京100176 北京市细菌性疫苗工程技术研究中心北京100176

目的:建立定量检测吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗(DTaP)生产过程中黏附素(pertactin,PRN)含量的方法。方法:以高效价兔抗PRN多克隆抗体为包被抗体,羊抗PRN多抗为检测抗体,采用辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体,建立双抗体夹心间接酶联... 详细信息

目的:建立定量检测吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗(DTaP)生产过程中黏附素(pertactin,PRN)含量的方法。方法:以高效价兔抗PRN多克隆抗体为包被抗体,羊抗PRN多抗为检测抗体,采用辣根过氧化物酶标记的兔抗羊抗体,建立双抗体夹心间接酶联免疫吸附试验(elisa)法测定PRN抗原的含量并进行方法学验证。结果:建立的elisa法在3.906 25~500 ng·mL^(-1)PRN浓度区间有最佳线性,相关系数r> 0.95;该法对PRN检测有良好的特异性;实验内和实验间检测250,60,15 ng·mL^(-1)浓度下PRN含量,变异系数为1.987%~9.785%、回收率为93.1%~103.5%。该法精密度和准确度较好,该法的定量限度为15 ng·mL^(-1)。同时探讨了建立的双抗体夹心elisa法的初步应用,测定了PRN纯化步骤的回收率以及联合疫苗中PRN组分的含量和吸附率。结论:建立的elisa法可有效检测百日咳疫苗纯化过程中PRN的含量,为DTaP生产过程的质量控制奠定了重要基础。

关键词：酶联免疫吸附测定百日咳黏附素质量控制定量elisa

静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)原料血浆筛选用试剂盒(elisa)的确定及其定量检测方法的建立、验证及应用

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中国生物制品学杂志 2021年第11期34卷 1344-1351页

作者：周志军邢延涛梁小龙肖龙曾双迎李璞邓琨王月喻剑虹李陶敬胡勇韩韧李策生国药集团武汉血液制品有限公司湖北武汉430207 北京天坛生物制品股份有限公司北京100024

目的通过比较特异性、敏感度、线性范围对目前市售的5家新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒(厂家A、B、C、D、E)进行筛选,建立定量检测方法并验证,用于静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)所需原料血浆的检测。方法将已知有中和活性的新型冠状病... 详细信息

目的通过比较特异性、敏感度、线性范围对目前市售的5家新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒(厂家A、B、C、D、E)进行筛选,建立定量检测方法并验证,用于静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)所需原料血浆的检测。方法将已知有中和活性的新型冠状病毒康复者恢复期血浆作为内控标准品,进行2倍系列稀释共7个稀释度(S1~S7),按照5个厂家试剂盒说明书操作,比较最高浓度S1的吸光值,用四参数拟合曲线比较5家试剂盒的线性范围;用候选的3家试剂盒初步建立定量检测方法并检测部分有代表性的阴性和阳性样本,比较结果的相关性;综合考虑选定一家试剂盒,将内控标准品进行系列稀释检测,确定其稀释度赋值,拟合标准曲线建立定量检测方法,并验证其线性范围、准确度和精密度,用于建立血浆筛查的模式。结果内控标准品的线性范围显示,厂家A可用倍比6个稀释度,S1吸光值为2.8;厂家B可用5个倍比稀释度,S1吸光值为2.4;厂家C可用5个倍比稀释度,S1吸光值为1.4;厂家D可用倍比3个稀释度,S1吸光值为3.3;厂家E可用5个倍比稀释度,S1吸光值为3.3。线性范围相近的厂家A、B、E试剂盒利用内控标准品建立了定量检测方法,曲线的决定系数R^(2)和各稀释度的回收率均符合要求,厂家A检测有代表性的阴性样本本底较高,特异性不好;3家试剂盒与中和试验检测有代表性的阳性样本结果的相关性均>0.9。选定用厂家B试剂盒,用其3个批次试剂盒4次检测的内控标准品的稀释度赋值为32,四参数拟合曲线线性成立,稀释度的线性范围为1~16,R^(2)>0.99,准确度、精密度符合要求。建立了单孔检测的筛浆模式,确定了复测样品的稀释度。结论厂家B试剂盒优化为定量检测试剂盒,经验证后可用于静注COVID-19人免疫球蛋白原料血浆的筛选。

关键词：原料血浆静注COVID-19人免疫球蛋白定量elisa 验证筛查模式

口蹄疫病毒非结构蛋白3AB双抗体夹心elisa方法的建立

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生物工程学报 2020年第11期36卷 2357-2366页

作者：付元芳何伟孙普杨林包慧芳曹轶梅白兴文李平花李冬陈应理刘磊卢曾军刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070

抗原纯净度是口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白(Non-structural protein,NSP)抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗... 详细信息

抗原纯净度是口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)灭活疫苗质量检验的一项重要内容,一般采用疫苗2–3次免疫动物后,检测非结构蛋白(Non-structural protein,NSP)抗体是否阳转,判断疫苗抗原的纯净度。文中旨在建立定量检测FMD灭活疫苗抗原中NSP 3AB含量的elisa方法,为疫苗质量控制提供参考方法。利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)NSP 3A单克隆抗体和辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标记的3B单克隆抗体,建立定量检测NSP 3AB含量的双抗体夹心elisa检测方法。采用原核表达并纯化的3AB蛋白作为标准品,标准品系列稀释,绘制标准曲线,以标准品与未加抗原的阴性对照吸光值(OD)的比值大于2.0的标准品最低浓度为最低检测限。标准品浓度介于4.7–600.0 ng/mL之间时,测得的OD值与浓度呈线性相关,回归曲线呈直线,相关系数R2=0.99,确定最低检测限为4.7 ng/mL。检测12份未纯化灭活抗原中3AB蛋白含量介于9.3–200.0 ng/mL之间;而纯化后的病毒抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限;33份来自不同厂家的成品疫苗抗原中9份疫苗抗原3AB蛋白含量在9.0–74.0 ng/mL之间,其余24份疫苗抗原中3AB蛋白残留量低于最低检测限。检测3AB蛋白含量的双抗体夹心elisa方法能够特异、敏感地检测疫苗抗原中的3AB蛋白含量,为疫苗质量控制与纯净度检验提供了一种可供选择的检测方法。

关键词：口蹄疫非结构蛋白定量elisa 疫苗抗原纯净度

定量检测破伤风类毒素酶联免疫吸附法的建立及初步应用

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中国免疫学杂志 2022年第10期38卷 1228-1232页

作者：祝传顺周振发洪禹薛莹姚雷(指导) 朱卫华北京智飞绿竹生物制药有限公司北京市细菌性疫苗工程技术研究中心北京100176

目的:建立定量检测破伤风类毒素(TT)抗原的双抗体夹心elisa法,并探索其初步应用。方法:以TT抗毒素为包被抗体,大鼠抗TT多抗为检测抗体,采用相应酶标抗体检测TT抗原含量,建立双抗体夹心elisa法,并进行方法学验证。结果:TT含量在0~0.062 5... 详细信息

目的:建立定量检测破伤风类毒素(TT)抗原的双抗体夹心elisa法,并探索其初步应用。方法:以TT抗毒素为包被抗体,大鼠抗TT多抗为检测抗体,采用相应酶标抗体检测TT抗原含量,建立双抗体夹心elisa法,并进行方法学验证。结果:TT含量在0~0.062 5 Lf/ml范围内线性关系良好(r>0.99)。该方法与白喉类毒素、百日咳类毒素、百日咳丝状血凝素及百日咳黏附素无明显交叉反应,重复性好,特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求。该法准确检测范围为0.000 625~0.040 000 Lf/ml,定量限度为0.000 625 Lf/ml。采用该方法对TT抗原进行吸附率检测,分别采用该法和絮状单位测定法测定6批TT的絮状含量,2种检测方法高度相关(r=0.94)。结论:建立的定量检测TT的双抗体夹心elisa法为破伤风疫苗生产过程中TT质量控制提供了有效技术手段。

关键词：破伤风类毒素定量elisa 质量控制

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牛结合珠蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

牛结合珠蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

作者：王彩宏黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

在奶牛疾病中，亚临床炎性疾病因临床症状不明显，早期不易被发现，给奶牛养殖业带来严重的经济损失，已经成为制约奶牛养殖业健康发展的一个瓶颈问题。因此，奶牛亚临床炎性疾病早期预警方法的研究具有重要科学意义及应用价值。牛结合... 详细信息

在奶牛疾病中，亚临床炎性疾病因临床症状不明显，早期不易被发现，给奶牛养殖业带来严重的经济损失，已经成为制约奶牛养殖业健康发展的一个瓶颈问题。因此，奶牛亚临床炎性疾病早期预警方法的研究具有重要科学意义及应用价值。牛结合珠蛋白（bovinehaptoglobin，BoHp）是一种血浆急相蛋白，是多种奶牛感染性疾病的生物标记物，在炎性疾病早期诊断中有潜在的应用价值。在本研究中，以纯化的pirBoHp重组蛋白作为抗原，免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，制备了5株BoHp单克隆抗体，分别命名为1B3、6D6、6D3、6B7和1C1。Westernblot结果显示，在制备的5株BoHp单克隆抗体中，1B3、6D6、6D3和6B7能识别牛血浆中天然BoHp的α链。进一步抗体亚型鉴定结果表明，1B3、6D6、6D3和6B7抗体亚型均为IgG1，轻链型为kappa链。利用亲和层析技术对BoHp单克隆抗体1B3、6D6、6D3和6B7腹水中的IgG蛋白进行了纯化，进一步利用改良过碘酸钠标记法，对纯化的4株BoHp单克隆抗体进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，利用纯化的BoHp单克隆抗体和HRP标记抗体，建立BoHp的定量elisa检测方法。敏感性试验结果显示，BoHp定量elisa最低检测浓度为31.25ng/mL。临床样品检测结果显示，本研究建立的pirBoHp定量夹心elisa方法与商品化elisa符合率为75%。利用柠檬酸三钠还原法，制备胶体金颗粒，并对BoHp单克隆抗体进行金标记，进一步利用纯化的BoHp单克隆抗体和羊抗鼠IgG印迹硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线，组装成检测BoHp的胶体金试纸条。条件优化试验结果显示，BoHp单克隆抗体1B3作为金标抗体，6D3作为检测抗体时，胶体金试纸条的检测效果最佳。敏感性试验结果显示，组装的BoHp胶体金试纸条最低检测浓度为0.45μg/mL。临床试验结果显示，48份不同跛行程度奶牛血清样品中43份样品出现信号，其中14份样品出现强信号，其阳性率为89.58%。表明胶体金试纸条能特异性识别牛血清中BoHp。本研究拟通过已筛选的奶牛亚临床炎性疾病预警Marker-牛结合珠蛋白（BoHp）作为研究靶标，制备BoHp蛋白的单克隆抗体，建立奶牛炎性疾病预警Marker BoHp的诊断方法，通过临床效果评价，明确BoHp作为奶牛亚临床炎性疾病预警Marker的可行性，为奶牛亚临床炎性疾病的早期预警及治疗提供有效工具。

关键词：奶牛炎性疾病 BoHp 单克隆抗体定量elisa 胶体金试纸条