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我国部分地区大豆疫霉群体遗传分析

南京农业大学学报 2011年第2期34卷 73-77页

作者：唐庆华崔林开苗苗李德龙阴伟晓郑小波王源超南京农业大学植物保护学院/农业部作物病虫害监测与防控重点开放实验室江苏南京210095 中国热带农业科学院椰子研究所海南文昌571339

为探究我国大豆疫霉菌的遗传多样性,使用13对简单重复序列标记(simple sequence repeats,SSR)引物对来自部分地区的79个大豆疫霉菌分离物进行了DNA指纹分析。13对SSR引物共扩增出33条条带,其中多态性条带比例为97.0%。SSR指纹聚类分析表... 详细信息

为探究我国大豆疫霉菌的遗传多样性,使用13对简单重复序列标记(simple sequence repeats,SSR)引物对来自部分地区的79个大豆疫霉菌分离物进行了DNA指纹分析。13对SSR引物共扩增出33条条带,其中多态性条带比例为97.0%。SSR指纹聚类分析表明:当以相异距离0.79为阈值时,可将79个大豆疫霉菌分离物划分为13个遗传聚类组。多数大豆疫霉菌分离物之间遗传相似性较低,表明我国大豆疫霉在DNA水平上发生了显著的遗传变异,从而具有较丰富的遗传多样性。大豆疫霉菌DNA多态性特征与分离物地理来源之间存在一定相关性,说明不同地区的大豆疫霉菌群体与大豆栽培品种之间的互作很可能是引起大豆疫霉菌发生广泛遗传变异的主要原因。

关键词：大豆疫霉群体遗传结构地理分布

大豆疫霉胞外多糖及其外泌蛋白处理下大豆的代谢组学研究

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大豆疫霉胞外多糖及其外泌蛋白处理下大豆的代谢组学研究

作者：胡九龙安徽农业大学

学位级别：硕士

在大豆的生产过程中,大豆疫霉(Phytophthora sojae)引致的大豆疫病是影响大豆产量质量最重要的病害之一。早在十几年前,全世界每年因该病而造成的经济损失就已高达十几亿美元;随着大豆疫霉的遗传变异,到了近几年,大豆疫病的危害更加明显... 详细信息

在大豆的生产过程中,大豆疫霉(Phytophthora sojae)引致的大豆疫病是影响大豆产量质量最重要的病害之一。早在十几年前,全世界每年因该病而造成的经济损失就已高达十几亿美元;随着大豆疫霉的遗传变异,到了近几年,大豆疫病的危害更加明显,因此研究大豆疫霉的致病机理显得尤为重要。而在大豆疫霉侵染大豆过程中,它分泌的多糖及蛋白就如同侵染大军的先锋部队,所以通过研究大豆疫霉的胞外粗多糖及外泌蛋白对大豆的生理生化影响可为研究大豆疫霉的致病机理提供实验依据。本论文以大豆疫霉GY8-3菌株为材料,提取胞外粗多糖及外泌蛋白,用它们处理大豆愈伤组织。采用RT-PCR,GC-MS方法,评价粗多糖和外泌蛋白对大豆代谢的影响。结果表明,大豆疫霉胞外粗多糖及其外泌蛋白处理组的NO和活性氧含量较对照组均明显升高,其中胞外粗多糖处理组中的大豆10个抗性相关基因在粗多糖处理6 h后有6个基因明显上调;外泌蛋白处理组中有4个上调。GC-MS鉴定出的代谢物共有58种,其中大豆疫霉胞外粗多糖处理组有20多种代谢物显著变化(P1);如葡萄糖苷和脯氨酸在相对含量(log 2(T/C))升高了 2.51倍,甘露糖2.19倍,丁二酸(琥珀酸)1.22倍;缬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸相对含量分别下降了 2.16倍、1.28倍、0.54倍,丙酸、松醇、肌醇分别下降了 0.91倍、0.75倍、0.54倍。外泌蛋白处理组有30多种代谢物显著变化;如葡萄糖苷相对含量升高了 4.77倍,甘露糖升高2.71倍,这二者都比胞外粗多糖处理组中的升高幅度大,脯氨酸升高了 2.5倍,这与胞外粗多糖处理组升高倍数相近;而缬氨酸、天冬酰胺相对含量并无较大变化。以大豆疫霉胞外粗多糖及其外泌蛋白处理大豆后,不同处理组的大豆体内代谢都发生了变化。二者相同之处是都使大豆系统抗性得到了提高,且都是诱导大豆通过减弱糖酵解途径、增加体内葡萄糖苷、脯氨酸及尸胺的含量等一系列的内部调节来实现对它们刺激的响应;不同之处在于大豆疫霉胞外粗多糖是通过减弱大豆的氮代谢途径、增强大豆的三羧酸循环来影响大豆的生长发育。本实验基于代谢组学的研究,揭示了大豆疫霉GY8-3菌株胞外粗多糖及其外泌蛋白处理下的大豆体内代谢规律,为研究这两类物质在大豆疫霉侵染大豆期间的作用机制提供理论依据,也为研究大豆疫霉的致病机理提供了新的研究思路和方法。同时,也对研究大豆在受到外界刺激时体内的代谢变化规律具有一定的参考意义。

关键词：大豆疫霉大豆胞外粗多糖外泌蛋白 GC-MS 致病机理

大豆疫霉细胞自噬基因PsAtg6a和细胞凋亡相关基因的功能研究

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大豆疫霉细胞自噬基因PsAtg6a和细胞凋亡相关基因的功能研究

作者：王雯南京农业大学

学位级别：硕士

正常的细胞死亡有助于维持生物体生理活动的运行。生物的细胞死亡包括细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)以及细胞坏死。而细胞程序性死亡又包括细胞凋亡和细胞自噬,其中细胞自噬是细胞内保守的降解过程,这一过程可以将细胞内... 详细信息

正常的细胞死亡有助于维持生物体生理活动的运行。生物的细胞死亡包括细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)以及细胞坏死。而细胞程序性死亡又包括细胞凋亡和细胞自噬,其中细胞自噬是细胞内保守的降解过程,这一过程可以将细胞内损伤的细胞器或者废弃的蛋白质等降解,生成的物质重新被细胞利用。在外部环境不利如饥饿条件,或者内部压力如损伤的细胞器的聚集,或者病原菌的侵入时,细胞自噬都能帮助细胞存活,抵抗压力。细胞自噬的发生包括诱导发生、自噬体的形成、自噬体与溶酶体融合以及最终物质的降解等过程。现在研究发现细胞自噬在许多真核生物如丝状真菌、植物、果蝇、线虫、昆虫、人的生理病理方面都发挥着重要的作用。而细胞凋亡是生物体内由基因控制的主动死亡的过程,大量研究表明它在生长发育及致病性等方面发挥着重要功能,但大豆疫霉的细胞凋亡和细胞自噬还知之甚少。为了研究大豆疫霉中是否发生细胞自噬,之前研究发现雷帕霉素可以诱导细胞自噬的发生。通过PEG介导的大豆疫霉的稳定转化获得GFP-PsAtg8的过表达转化子,通过雷帕霉素处理前后GFP-PsAtg8融合蛋白的位置变化来观察细胞自噬的发生。荧光显微镜观察结果表明对照组(DMSO)的菌丝荧光聚集较亮,而雷帕霉素处理后的菌丝中荧光分散,说明菌丝确实发生了细胞自噬。同时通过MDC染色法观察大豆疫霉细胞自噬的发生,它是一种广泛使用的自噬荧光染料。结果显示与对照相比,经雷帕霉素处理的菌丝中自噬体数量增多,荧光亮点增加。这两种方法说明大豆疫霉中可以发生细胞自噬。为了进一步探究细胞自噬是否参与到大豆疫霉的不同生长发育阶段,利用MDC染色的方法观察大豆疫霉不同生长发育阶段细胞自噬的发生,包括菌丝、孢子囊形成、休止胞以及休止胞萌发。结果表明MDC染色结果发现初生孢子囊中MDC荧光强,而成熟的孢子囊的MDC荧光较弱。休止胞以及休止胞萌发阶段MDC染色结果显示休止胞的MDC荧光较弱,而休止胞萌发时MDC荧光增强,说明在孢子囊形成,休止胞萌发时细胞自噬过程被激活。我们由此可以推断细胞自噬可能在大豆疫霉侵染时发挥作用。为了进一步研究细胞自噬在大豆疫霉产胞和致病性方面的作用,在大豆疫霉中鉴定了在侵染阶段持续上调表达细胞自噬相关基因PsAtg6a。通过PEG介导的大豆疫霉原生质体转化的方法获得PsAtg6a沉默转化子,并接种感病品种大豆黄化苗下胚轴。结果显示与野生型P6497相比,PsAtg6a沉默后其致病力降低,用台盼蓝染侵染部位的表皮细胞发现吸器量减少。沉默细胞自噬相关基因PsAtg6a导致孢子囊的产生减少,结合之前MDC染色结果显示的孢子囊形成阶段自噬增强这一结论,表明细胞自噬在孢子囊形成阶段发挥重要的作用。通过上述研究,我们在大豆疫霉中初步证明了细胞自噬的发生,并且发现细胞自噬可能参与大豆疫霉孢子囊产生以及致病性,这些结果将会加深我们对大豆疫霉中细胞自噬对其生长发育和致病性影响的认识。为了研究另一种程序性细胞死亡-细胞凋亡在大豆疫霉侵染过程中可能的作用,在大豆疫霉中鉴定到了四个细胞凋亡相关基因:PsCYCS、PsEndoG和PsAIF,PsTatDs,其中PsTatDs包括PsTatD1,PsTatD2,PsTatD3和PsTatD4。通过荧光定量PCR方法分析这7个基因在大豆疫霉侵染过程中的表达情况。PsAIF在侵染阶段上调表达,PsEndoG在侵染前期有轻微上调表达,PsCYCS在侵染阶段下调表达,PsTatD2和PsTatD3在侵染阶段上调表达,PsTatD4在侵染前期下调表达而在侵染后期上调表达。结果显示PsEndoG,PsCYCS 和 PsAIF,PsTatD2,PsTatD3,PsTatD4 可能在大豆疫霉侵染过程中发挥重要作用。

关键词：大豆疫霉细胞自噬雷帕霉素 MDC PsAtg6a

大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2及其与勃利霉素相互作用研究

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大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2及其与勃利霉素相互作...

作者：张蕾黑龙江八一农垦大学

学位级别：硕士

在全球范围内大豆疫霉引起的大豆根腐病是一种极为严重的病害,在我国每年都会造成极大的经济损失。大环内酯类抗生素勃利霉素对大豆疫霉具有非常高的抑制活性,可能成为一种新型、高效的生物农药。前期研究显示,勃利霉素可以通过与大豆... 详细信息

在全球范围内大豆疫霉引起的大豆根腐病是一种极为严重的病害,在我国每年都会造成极大的经济损失。大环内酯类抗生素勃利霉素对大豆疫霉具有非常高的抑制活性,可能成为一种新型、高效的生物农药。前期研究显示,勃利霉素可以通过与大豆疫霉的苏氨酰-t RNA合成酶形成复合体抑制蛋白的合成,本研究旨在探索勃利霉素抗大豆疫霉病的其他途径。利用生物信息学方法分析大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2基因,其与勃利霉素抑制酵母的细胞周期作用靶标Cdc28基因高度同源,通过基因工程技术分别在大肠杆菌和酵母中克隆psCdc2,体外表达、纯化获得蛋白,利用荧光光谱分析了勃利霉素与psCdc2在体外的相互作用,并利用dsRNA介导psCdc2基因沉默技术研究了该基因的突变对大豆疫霉的影响。结果如下:(1)大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2生物信息学分析结果显示,该蛋白由20种氨基酸组成,蛋白分子量为35,478Da,等电点为8.56,是稳定存在的蛋白,无信号肽,为α/β型蛋白。在大豆疫霉基因组内找到了与酵母Cdc28基因存在相互作用10个蛋白同源的大豆疫霉的蛋白,蛋白的一致性百分比在26%-46%之间,说明大豆疫霉内可能存在类似酵母细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶Cdc28的蛋白相互作用网络。(2)采用反转录PCR技术得到了大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2基因,将psCdc2克隆到大肠杆菌pET 32a(+)表达载体,转化到BL21进行表达,利用低温诱导与变复性透析纯化方法获得可溶性大豆疫霉psCdc2。在大肠杆菌中表达的蛋白是以包涵体形式存在,因此将其克隆到毕赤酵母的pPIC9K表达载体中,通过电转化的方法转入毕赤酵母进行表达,利用镍柱纯化获得可溶性大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶。(3)通过荧光光谱分析勃利霉素与大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶psCdc2的相互作用发现,随着勃利霉素浓度的增加蛋白荧光强度不断地降低,说明两者发生了作用。而猝灭常数Ksv随着温度的升高而升高,可以推断勃利霉素对大豆疫霉psCdc2的猝灭为动态猝灭,即勃利霉素与大豆疫霉细胞周期依赖性蛋白激酶psCdc2之间的相互作用是通过相互碰撞实现的。(4)体外合成psCdc2的dsRNA通过聚乙二醇(PEG)介导的大豆疫霉原生质体转化技术转入大豆疫霉原生质体。在再生培养基上生长的psCdc2转化子菌落形态没有明显变化,但菌株的生长速率减慢,且诱导产生的孢子囊数量小且多为畸形,说明了大豆疫霉psCdc2基因的沉默会影响大豆疫霉的生长。通过体外实验证实勃利霉素与大豆疫霉细胞周期依赖性蛋白激酶psCdc2之间的相互作用是通过相互碰撞实现的,且沉默大豆疫霉的psCdc2基因会影响大豆疫霉的生长与产孢。

关键词：勃利霉素大豆疫霉细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制作用光谱分析基因沉默

大豆疫霉生物学性状在单游动孢子后代的遗传研究

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大豆疫霉生物学性状在单游动孢子后代的遗传研究

作者：郑婷安徽农业大学

学位级别：硕士

大豆疫霉对大豆的生产危害极大,目前仍被列为我国的进境植物检疫对象。随着全球化发展的进程,各国均对外开放,进出口产品也越来越多,关于农产品的进出口更是数不胜数,大豆进口数量每年都在增长。这也说明国外大豆疫霉传入我国可能性越... 详细信息

大豆疫霉对大豆的生产危害极大,目前仍被列为我国的进境植物检疫对象。随着全球化发展的进程,各国均对外开放,进出口产品也越来越多,关于农产品的进出口更是数不胜数,大豆进口数量每年都在增长。这也说明国外大豆疫霉传入我国可能性越来越高。目前,安徽省沿淮和淮北地区的大豆疫病的发生比较普遍。除了用农药治理,最好的便是种植抗病品种,利用植株抗病性控制大豆疫病,然而随着大豆疫霉新的毒力类型增长越来越快,这在一定程度上使得抗病品种特别容易丧失。为了探讨大豆疫霉毒性遗传规律及新的毒力类型产生机制,进而为大豆抗病育种和抗病品种的合理布局提供必要依据,本学位论文对安徽省部分地区的大豆疫霉菌株的毒性及菌落形态、生长速率等其他生物学特性在其无性后代的遗传进行了研究,主要结果如下:1.以菌株HY12和MC48为亲本分别建立其单游动孢子第一代和第二代菌株群体,第一代共分离63个单孢菌株,第二代共20个单孢株,分别接种到14个含有单抗基因的鉴别寄主上。结果表明,大豆疫霉的毒性在单游动孢子后代的遗传不稳定,其致病型的遗传也是如此。2.从亲本分离出来的单游动孢子后代,通过测量它们的菌丝生长速率和观察菌落形态。结果发现,无论是第一代还是第二代,它们的菌落形态基本相同,都呈现近似圆形,菌落白色,气生菌丝呈现棉絮状,比较多,菌落边缘光滑,很整齐,质地比较光滑,菌丝生长速率和亲本无显著性差异。这表明它们之间基本没有差异,可稳定遗传。3.分别用菌株HY12和MC48的单游动孢子第一代和第二代菌株,分别接种合丰35与合丰47两个大豆品种叶片,结果表明,大豆疫霉对大豆的致病力在无性后代遗传不稳定,与亲本相比较,后代菌株的致病力有的变强,有的变弱。

关键词：大豆疫霉毒性致病型菌落形态生长速率遗传

大豆疫霉无毒基因Avr3a识别位点及亚细胞定位分析

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大豆疫霉无毒基因Avr3a识别位点及亚细胞定位分析

作者：翟路翀南京农业大学

学位级别：硕士

大豆根腐病严重威胁世界范围内的大豆生产,每年在农业生产上都会造成上高达二十亿美元的损失,而引起这种病害的病原菌就是大豆疫霉。大豆疫霉与真菌亲缘关系较远,传统防治真菌的药物对其效果不明显,控制大豆疫霉根腐病的主要措施是培育... 详细信息

大豆根腐病严重威胁世界范围内的大豆生产,每年在农业生产上都会造成上高达二十亿美元的损失,而引起这种病害的病原菌就是大豆疫霉。大豆疫霉与真菌亲缘关系较远,传统防治真菌的药物对其效果不明显,控制大豆疫霉根腐病的主要措施是培育抗病品种。无毒基因与抗病基因的互相识别会直接影响大豆疫霉致病性和大豆的抗病性。目前已有多种抗病基因和无毒基因被鉴定克隆。在大豆疫霉与大豆之间协同进化过程中,大豆疫霉会通过自身不断变异来逃避抗病基因的识别,无毒基因在自然界中的多态性就是它逃避识别的一种手段。研究无毒基因的多态性,寻找关键识别区域和位点对了解大豆疫霉致病机制,有效控制大豆根腐病具有重要意义。PsAvr3a是已经被克隆的大豆疫霉的无毒基因,Avr3a在不同菌株P6497、P7064、ACR12、HN25、HN35中存在多态性,但在P7064中不转录。基于已有的研究结果,通过基因枪瞬时表达首先确认Avr3a中20个氨基酸左右的信号肽(signal peptide,SP)对Avr3a-Rps3a的识别没有影响。将P6497、ACR12、HN25、HN35中缺失信号肽的Avr3a-SP在含有Rps3a的大豆叶片上瞬时表达,无毒菌株P6497、ACR12中的Avr3a能够被Rps3a所识别,引起细胞坏死,而毒性菌株HN25、HN35中的Avr3a中不能被识别,这表明Avr3a-Rps3a的识别直接决定了Avr3a的无毒功能。其氨基酸突变位点主要集中在C端W-motif附近区域,生物信息学预测77位和82位氨基酸有可能是识别的关键位点。因此将一系列Avr3a的缺失突变体在含有Rps3a的大豆叶片上瞬时表达,发现识别关键区域在第61位到第112位氨基酸的区域,W motif及其前后的区域对识别都很重要。分别将Avr3aP649777位的天冬氨酸(D)点突变为甘氨酸(G),82位组氨酸(H)点突变为天冬氨酸(D),突变体仍被Rps3a识别,而同时突变77位的天冬氨酸(D)为甘氨酸(G),82位组氨酸(H)为天冬氨酸(D),对Avr3a与Rps3a的识别有一定影响。对Avr3a的亚细胞定位研究发现,Avr3aP6497、亚细胞定位在细胞核、细胞质中。将Avr3aP6497的C端分别与核定位信号(NLS1和NLS2)和核输出信号(NES)融合,发现NLS2、NES都改变了Avr3aP6497的定位而NLS1没有改变Avr3ap6497的定位;将Avr3aHN25的C端核定位信号(NLS2)和核输出信号(NES)融合,发现NLS2、 NES也改变了Avr3aHN25的定位。改变Avr3ap6497的定位,影响了Avr3aP6497被Rps3a识别。但改变Avr3aHN25的定位,AvrSaHN25仍不能被Rps3a识别。推测Avr3a-Rps3a识别有可能发生在细胞质中。

关键词：大豆疫霉 Avr3a 多态性亚细胞定位

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大豆疫霉对甲霜灵抗性监测及有效药剂筛选

大豆疫霉对甲霜灵抗性监测及有效药剂筛选

作者：曹舜安徽农业大学

学位级别：硕士

大豆疫霉引起的根腐病是严重危害大豆生产的重要病害之一，每年造成几十亿美元的经济损失。目前，大豆疫霉菌的防治主要以甲霜灵为主，但是甲霜灵作用位点单一，容易产生抗药性。本文对安徽、山东、河南三省的大豆疫霉菌进行甲霜灵的敏... 详细信息

大豆疫霉引起的根腐病是严重危害大豆生产的重要病害之一，每年造成几十亿美元的经济损失。目前，大豆疫霉菌的防治主要以甲霜灵为主，但是甲霜灵作用位点单一，容易产生抗药性。本文对安徽、山东、河南三省的大豆疫霉菌进行甲霜灵的敏感性检测、抗药性突变株的诱变、抗药性突变株的生物学特性以及有效药剂筛选进行研究。研究结果如下：采用生长速率法对安徽、山东、河南三省的57个大豆疫霉菌株进行了敏感性检测，结果表明：57个大豆疫霉菌株的EC50值的范围在0.0362-0.2408g·mL，平均值为0.1043g·mL，远远小于1g·mL，三个省份的大豆疫霉菌对甲霜灵是敏感的，不存在天然的抗性菌株。三个省份大豆疫霉菌株群体之间对甲霜灵敏感性也有一定的差异，安徽菌株对甲霜灵的敏感性最低，其平均EC50值为0.1077g·mL，其次是河南菌株的平均EC50值为0.0966g·mL，敏感性最高的是山东的菌株，其平均EC50值为0.07308g·mL。采用药剂驯化法对57个菌株进行了抗药性诱变，结果得到1个抗药性突变菌株SD145M，对其生物学性状进行研究发现，抗药性突变株的菌丝生长速率、游动孢子囊的产量及大小、排孢孔的大小及卵孢子的大小与亲本菌株无显著性差异。但是卵孢子的产量明显减少。同时发现，突变菌株的致病性与亲本菌株相似。采用生长速率法检测了5种杀菌剂对大豆疫霉的毒力，结果发现：安克(烯酰吗啉)的EC50值为0.11792g·mL与甲霜灵的0.12011g·mL相近。测定了两种药剂的相互作用，结果表明两种药剂具有增效作用，故选取两种药剂进行复配实验。复配实验结果表明：各个配比的EC50范围在0.0377～0.117g·mL。当复配比为1：1时，EC150值为0.0377g·mL-，CTC是946，增效作用最明显;其次是复配比例为2：3时，EC50值为0.0387g·mL，其CTC也高达858;复配比例为1：2、3：1、3：2时增效作用也很明显;复配比例为2：1和1：3时，增效作用与前面几个比例相比较小，但是远大于100。结果还发现，CTC与复配的比例有一定的相关性。同时测定了不同复配对游动孢子囊产量的影响，结果表明：游动孢子囊的产量严重受到抑制，当用量为0.5g·mL时，抑制率均达到50%以上，抑制最明显的是复配比例为2：3时，达到了77.41%。最小的是复配比例1：1，抑制率为54.84%。

关键词：大豆疫霉甲霜灵敏感性防治药剂毒力

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大豆疫霉拮抗菌株的筛选、鉴定及拮抗作用

大豆疫霉拮抗菌株的筛选、鉴定及拮抗作用

作者：杨光红安徽农业大学

学位级别：硕士

大豆疫霉Phytophthora sojae是农业生产上极为重要的植物病原菌之一，由其引起的大豆疫病是大豆生产上的毁灭性病害之一。筛选具有生防潜力的大豆疫霉拮抗菌，可以为寻找病害措施和设计新的疫病控制策略提供基础。本学位论文在大豆疫霉... 详细信息

大豆疫霉Phytophthora sojae是农业生产上极为重要的植物病原菌之一，由其引起的大豆疫病是大豆生产上的毁灭性病害之一。筛选具有生防潜力的大豆疫霉拮抗菌，可以为寻找病害措施和设计新的疫病控制策略提供基础。本学位论文在大豆疫霉拮抗微生物筛选的基础上，对2株拮抗效果较好的细菌菌株BY-2、BZ-2进行了鉴定，并对其离体及活体拮抗作用以及促生长作用进行了研究，主要研究结果如下： 1、采用平板对峙法和杯碟法分别对本实验室保存的哈茨木霉（Trichodermaharziarum）TH-1菌株及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS菌株以及6株粉红单端孢（Trichothecium roseum）菌株进行了平板抑菌作用及代谢产物活性测定，结果表明，它们对大豆疫霉的拮抗效果均不显著。 2、从安徽省大豆疫病田采集的大豆根际土壤中分离得到4株大豆疫霉拮抗细菌，平板对峙试验显示，其中拮抗细菌菌株BY-2和BZ-2在第5d时对大豆疫霉的平板抑制效果分别为79.0%和63.97%。对菌株BY-2、BZ-2进行了鉴定。经形态观察、生理生化特性测定、扫描电镜观察及16S rDNA、gyrB序列分析，鉴定上述两菌株均为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 3、测定了不同时间的BY-2代谢液对大豆疫霉的抑制活性，结果显示，72h代谢液对供试病原菌的菌丝生长抑制效果最好;BY-272h代谢液对供试病原菌AH19的抑制效果显著高于其他各菌株，抑制效果达到40.93%。BY-2菌株72h代谢滤液能显著抑制游动孢子萌发，培养滤液处理24h后孢子萌发抑制率为57.71%，且24h后孢子萌发抑制率显著高于其他各处理。 4、采用培养皿对扣法，测定了BY-2菌株挥发物对大豆疫霉的抑制活性。结果表明，BY-2挥发物处理对供试大豆疫霉菌株的菌丝生长均有显著的抑制作用，但抑制率随菌株和处理时间不同而有显著差异，其中对菌株AH19处理第7d时的抑制率最高，为91.94%。 5、对筛选获得的生防菌株进行了盆栽试验测定，结果显示菌株BY-2提前3d浸根接种对大豆疫病的防效显著高于各处理，接种10d后调查防效为75.01%;BY-2菌液处理同时还可显著地促进大豆幼苗的生长;处理的鲜重干重都显著地高于对照，分别增加了63.16%、43.48%，根长和茎长也都显著高于对照，分别比对照增加56.57%、6.95%。 6、研究了温度、pH、接种量和培养时间对菌株BY-2的影响，结果表明，菌株BY-2最适生长温度为30℃，最适pH为7.0，最适接种量为2%，最适培养时间为48h，为下一步生防菌剂的开发提供依据。

关键词：大豆疫霉拮抗菌筛选鉴定拮抗作用

大豆疫霉超氧化物歧化酶基因（PsSOD1）的功能分析

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大豆疫霉超氧化物歧化酶基因（PsSOD1）的功能分析

作者：刘枭安徽农业大学

学位级别：硕士

大豆疫霉（Phytophthora sojae）是引致大豆疫病的重要病原卵菌。为了探讨其致病抗逆机制,通过对大豆疫霉转录组测序结果的基础上,选取一个在逆境条件下表现量上升的基因,进行同源序列比较得到PsSOD1,将PsSOD1基因转化至原生质体内部,... 详细信息

大豆疫霉（Phytophthora sojae）是引致大豆疫病的重要病原卵菌。为了探讨其致病抗逆机制,通过对大豆疫霉转录组测序结果的基础上,选取一个在逆境条件下表现量上升的基因,进行同源序列比较得到PsSOD1,将PsSOD1基因转化至原生质体内部,得到沉默和过表达的转化子,通过后期实验室进行过氧化氢胁迫试验、渗透胁迫试验、以及细胞壁的完整性胁迫试验等模拟实验,将其接种至各种逆境的环境中,研究其在抗逆环境的生长状况;通过将PsSOD1导入BL21大肠杆菌内部,诱发大肠杆菌产生大量的蛋白,再对其进行纯化,得到纯化和未纯化的蛋白,对其酶的活性进行检测,主要研究结果如下:1、基因PsSOD1的沉默与过表达,对大豆疫霉孢子囊的形态大小无显著影响,但该基因的沉默和过表达,会导致大豆疫霉休止孢萌发的形态出现变异,具体表现为休止孢分叉和畸形。2、通过对转化子进行过氧化氢胁迫试验和渗透胁迫试验,计算转化子的生长抑制率,结果显示,得出PsSOD1基因表达量的降低和增加会影响大豆疫霉菌在高氧化和高盐环境下的生长,表明该基因与大豆疫病的抗逆性有关。3、通过将WT、CK、P1、P2、S1和S2转化子接种至大豆植株和叶片上,结果显示,得出PsSOD1基因表达量的降低和增加不会影响大豆疫霉菌在植株和叶片上的致病力,不会改变菌株的致病力。4、将PsSOD1导入大肠杆菌BL21中表达,对表达产物PsSOD1蛋白进行纯化,对其酶活性进行检测,明确了不同的温度和p H对PsSOD1蛋白酶活性的影响,在所测量的温度和p H中,得出酶活性最适宜温度为30℃,最适宜的p H值为7。综上所述,对大豆疫霉基因PsSOD1的表达量增加与降低,不会影响大豆疫病孢子囊的生长,不会影响大豆疫霉对大豆植株和叶片的致病力,不会提高或降低菌株的致病性。然而该基因的沉默和过表达,会导致大豆疫霉休止孢萌发的形态会出现变异,具体表现为休止孢分叉和畸形;会提高大豆疫霉菌在高氧化和高盐环境下的生长,表明该基因与大豆疫病的抗逆性有关。此外,对PsSOD1导入BL21的PsSOD1基因进行纯化,对其酶的活性进行检测,得出PsSOD1蛋白活性在不同的温度和p H条件下最适宜的条件。

关键词：大豆疫霉 PsSOD1 功能分析酶活性抗逆性