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大豆孢囊线虫扩展蛋白新基因(Hg-exp-1、Hg-exp-2)的鉴定及功能分析

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中国农业科学 2018年第17期51卷 3302-3314页

作者：张瀛东孔详超黄文坤孔令安李红梅彭焕彭德良中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室南京农业大学植物保护学院

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性... 详细信息

【目的】大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)是大豆上最重要的土传病原物之一,由孢囊线虫口针分泌的扩展蛋白(expansin)在线虫侵染过程中发挥了重要作用。本研究旨在鉴定大豆孢囊线虫扩展蛋白基因,并对其结构、组织定位和发育表达特性进行研究,为进一步明确大豆孢囊线虫的寄生、致病机制打下基础。【方法】利用同源基因克隆技术,根据已报道的线虫expansin基因的保守序列设计上下游简并引物,从大豆孢囊线虫2龄幼虫cNDA中克隆expansin基因的EST片段,根据EST片段序列设计RACE特异性引物,通过RACE技术扩增测序后采用DNAstar 7.1和DNAman软件对序列进行比对和拼接,得到大豆孢囊线虫expansin基因c DNA全长;采用CLC sequence viewer 6进行开放阅读框查找、蛋白质翻译和序列比对;使用EBI在线软件Signal P 3.0 Server和TMHMM软件进行预测蛋白质前体信号肽和跨膜结构域预测,GSDS在线软件进行基因组结构分析;使用PHYML软件和MEGA5.0软件最大似然法对获得的基因与其他线虫expansin基因进行比对与系统进化树构建;采用Southern杂交技术分析Hg-exp-1在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数;通过原位杂交技术确定2个expansin基因的表达部位;提取卵、侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫与白雌虫的c DNA作为模板,通过半定量PCR技术分析expansin基因在线虫不同龄期的发育表达特性;根据Hg-exp-1基因序列设计引物扩增并合成dsRNA,对大豆孢囊线虫2龄幼虫浸泡处理24 h后接种大豆植株,分析Hg-exp-1 RNA干扰后对线虫侵染的影响。【结果】从大豆孢囊线虫2龄幼虫中成功克隆出2个扩展蛋白基因全序列,命名为Hg-exp-1和Hg-exp-2,长度分别为1 047和1 037 bp,分别编码长度为288和295个氨基酸的多肽,2个预测蛋白N端均含有信号肽,无跨膜结构域,表明其为分泌型蛋白。序列比对发现大豆孢囊线虫HG-EXP-1序列与马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)GR-EXPB1(CAC83611)和GR-EXPB2(CAC84564)以及非洲茎线虫(Ditylenchus africanus)DA-EXPB1(ADJ57307)等具有高度一致性。Southern杂交分析表明,expansin基因在大豆孢囊线虫中可能以多拷贝方式或多基因家族存在。原位杂交显示它们特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。Hg-exp-1体外RNA干扰后,2龄幼虫浸泡在dsRNA 24 h,靶基因的转录水平下调,接种后大豆根内线虫2龄幼虫数和雌虫数分别下降了38.3%和43.4%。【结论】从大豆孢囊线虫中成功分离鉴定出2个expansin基因,同时明确了其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起重要作用。

关键词：大豆孢囊线虫扩展蛋白发育表达 RNA干扰

大豆孢囊线虫不同寄主种群的形态变异及对大豆寄主的适应性差异分析

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植物保护 2014年第6期40卷 106-111页

作者：王慧敏赵洪海王凤龙青岛农业大学农学与植物保护学院山东植物病虫害综合防控重点实验室青岛266109 中国农业科学院烟草研究所青岛266101

在对大豆、烟草与地黄寄主上14个大豆孢囊线虫(SCN)种群形态与分子鉴定的基础上,对雌虫的孢囊和阴门锥进行形态观察和测计。结果表明:烟草SCN和大豆SCN的各测量值之间无明显差异(P>0.05),地黄SCN的阴门窗长(43.8μm)和宽(33.9μm)显著... 详细信息

在对大豆、烟草与地黄寄主上14个大豆孢囊线虫(SCN)种群形态与分子鉴定的基础上,对雌虫的孢囊和阴门锥进行形态观察和测计。结果表明:烟草SCN和大豆SCN的各测量值之间无明显差异(P>0.05),地黄SCN的阴门窗长(43.8μm)和宽(33.9μm)显著小于其他两者(P大豆孢囊线虫可靠的形态特征。3种寄主种群侵染大豆(‘荷豆12号’)的试验表明,大豆SCN能侵染大豆并能形成雌虫,而烟草SCN和地黄SCN未能侵染大豆和形成雌虫。本研究结果表明SCN不同寄主种群存在形态变异,而它们对大豆的寄主适应性也不相同。

关键词：大豆孢囊线虫形态变异分子鉴定寄主适应性

大豆孢囊线虫生防菌株Myrothecium verrucaria ZW-2发酵条件优化及活性物质分析

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生物技术通报 2021年第7期37卷 127-136页

作者：陈倩张露源陈伯昌吴海燕广西农业环境与农产品安全重点实验室广西大学农学院南宁530004

疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)ZW-2菌株对大豆孢囊线虫具有(Heterodera glycines)明显的杀线虫活性,为了确定该菌株的最优发酵条件以及代谢产物,采用4因素3水平的正交试验进行了发酵条件优化以及代谢组学分析。结果表明:菌株ZW-2... 详细信息

疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)ZW-2菌株对大豆孢囊线虫具有(Heterodera glycines)明显的杀线虫活性,为了确定该菌株的最优发酵条件以及代谢产物,采用4因素3水平的正交试验进行了发酵条件优化以及代谢组学分析。结果表明:菌株ZW-2以Czapek培养基为基础培养基,最佳培养温度为28℃,摇床转速为180 r/min,装瓶量为100 mL,培养基pH为8,最佳碳源和氮源为蔗糖和硝酸钠。经代谢组学分析,根据代谢物质荷比、精确分子量及一级碎片离子得分等信息共筛选出20种差异代谢物,包括酰胺类化合物和脂肪族化合物。菌株ZW-2上述试验结果为进一步开发利用该菌株提供重要的理论和应用价值。

关键词：疣孢漆斑菌大豆孢囊线虫发酵条件优化代谢组学分析

大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5的克隆与分析

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中国农业科学 2012年第5期45卷 854-866页

作者：彭焕彭德良黄文坤贺文婷胡先奇云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克... 详细信息

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5(GenBank登录号HQ123259)。Hg-pel-5基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有20个氨基酸残基的信号肽和4段细菌结构的果胶酸裂解酶第三家族的保守位点。原位杂交确定Hg-pel-5在大豆孢囊线虫亚腹食道腺中表达。半定量RT-PCR结果表明Hg-pel-5在寄生前和寄生过程早期的2龄幼虫大量表达。Southern杂交结果显示Hg-pel-5存在于大豆孢囊线虫基因组中并以多拷贝形式存在。【结论】对大豆孢囊线虫中1个新的果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5进行克隆和分析,表明该基因在大豆孢囊线虫早期寄生过程中发挥重要作用。

关键词：大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因克隆原位杂交 Southern杂交

大豆孢囊线虫侵染对乙烯合成及信号传导基因表达调控的研究

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生物技术通报 2022年第8期38卷 150-158页

作者：郭宾会宋丽扬州大学农业科技发展研究院教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室扬州225009 扬州大学生命科学基础实验教学中心扬州225009

乙烯是一种重要的植物激素,其合成和信号传导相关基因参与调控植物生长发育及防御反应。为阐明大豆孢囊线虫侵染和定殖对寄主植物乙烯合成及信号传导途径的影响,本研究以8个抗病品种和2个感病品种为材料,利用荧光定量PCR方法对比接种与... 详细信息

乙烯是一种重要的植物激素,其合成和信号传导相关基因参与调控植物生长发育及防御反应。为阐明大豆孢囊线虫侵染和定殖对寄主植物乙烯合成及信号传导途径的影响,本研究以8个抗病品种和2个感病品种为材料,利用荧光定量PCR方法对比接种与未接种孢囊线虫大豆根中乙烯合成基因GmACS和信号传导基因GmEIN的表达水平。实验结果表明,与感病品种相比,抗病品种中乙烯的生物合成受到显著调控,其中PI 548316中GmACS显著上调,而在PI 437654和PI 88788中GmACS显著下调。同时,GmEIN在4个抗病品种中轻微上调,但在其它抗病品种和2个感病品种中均未受到显著调控。研究表明GmACS和GmEIN的表达受到孢囊线虫侵染与定殖调控,其中被显著调控的GmACS基因可以作为提高大豆抗病育种的候选基因。

关键词：大豆大豆孢囊线虫 GmACS基因 GmEIN基因基因表达分析

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大豆孢囊线虫大豆和烟草群体寄生性比较分析

植物保护 2016年第2期42卷 68-73页

作者：刘海勤刘泉成赵洪海青岛农业大学农学与植物保护学院山东省植物病虫害防控重点实验室青岛266109

通过盆栽试验,测定大豆孢囊线虫（Heterodera glycines,soybean cyst nematode,SCN）大豆群体（SCNS）和烟草群体（SCNT）对5个大豆品种（SCN生理小种鉴别寄主）和9个烟草栽培品种的寄生性。结果发现,SCNS在5个大豆品种上的平均繁殖系数... 详细信息

通过盆栽试验,测定大豆孢囊线虫（Heterodera glycines,soybean cyst nematode,SCN）大豆群体（SCNS）和烟草群体（SCNT）对5个大豆品种（SCN生理小种鉴别寄主）和9个烟草栽培品种的寄生性。结果发现,SCNS在5个大豆品种上的平均繁殖系数（Rf=Pf/Pi）为0.60（0.14-1.90）,在感病对照品种‘Lee’上平均Rf高达1.90;SCNT在5个大豆品种上的平均Rf为0.18（0.06-0.44）,在感病对照品种‘Lee’上Rf为0.44。SCNS对9个烟草品种几乎无寄生性,平均Rf为0.06（0.00-0.10）;SCNT则能寄生9个烟草品种,平均Rf为1.26（0.45-1.95）。接种35d后,在不同大豆品种根内SCNS和SCNT的幼虫数量均极少,侵染率基本相同;在不同烟草品种根内SCNS的幼虫数量均为0,而SCNT的幼虫数量平均为26.5（14.6-57.0）。研究表明,供试SCNS属于14号生理小种,但供试SCNT与之寄生性差异大,属于新的SCN致病类型。

关键词：大豆孢囊线虫大豆烟草繁殖系数寄生性新致病类型

野生大豆抗感大豆孢囊线虫材料内生细菌多样性分析

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微生物学报 2014年第8期54卷 926-935页

作者：武云鹏史凤玉 M.Imran Hamid 张瑞敬朱英波河北科技师范学院生命科技学院河北秦皇岛066600 中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室北京100101 张家口市植物保护植物检疫站河北张家口075000

【目的】对抗感野生大豆材料根内生细菌的多样性进行比较分析,为研究野生大豆内生细菌与大豆孢囊线虫之间的相互关系奠定基础。【方法】在野生大豆抗大豆孢囊线虫3号生理小种筛选基础上,利用扩增核糖体DNA限制性分析(Amplified ribosoma... 详细信息

【目的】对抗感野生大豆材料根内生细菌的多样性进行比较分析,为研究野生大豆内生细菌与大豆孢囊线虫之间的相互关系奠定基础。【方法】在野生大豆抗大豆孢囊线虫3号生理小种筛选基础上,利用扩增核糖体DNA限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)和16S rDNA克隆文库测序相结合的方法,对抗感野生大豆根系内生细菌多样性及群落结构进行分析。【结果】野生大豆根内生细菌分属于6大类群,其中变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)为优势类群,相对丰度分别为46.8%和13.6%,另外有少量的放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、异常球菌-栖热菌门(Deincoccus-Thermus)和古细菌(Archaea),18.8%克隆序列与环境中未培养细菌的16S rDNA序列有较高的相似性。野生大豆高抗材料内生细菌的多样性比高感材料更为丰富,且抗感材料内生细菌优势菌群存在明显差异,中慢生根瘤菌(Mesorhizobium tamadayense)、肠杆菌(Enterobacter ludwigii)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)为野生大豆高抗材料特有的可操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTUs)中的优势种群。【结论】研究结果表明抗感野生大豆根内生细菌的优势种群存在明显差异,而内生细菌的优势种群与大豆孢囊线虫的相互关系正在深入分析研究。

关键词：大豆孢囊线虫野生大豆材料内生细菌扩增核糖体DNA限制性分析分类操作单元

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大豆孢囊线虫ISSR反应体系的建立与优化

吉林农业大学学报 2019年第4期41卷 389-393页

作者：欧师琪杨飞燕史树森吉林农业大学植物保护学院

采用正交设计对大豆孢囊线虫ISSR-PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、d NTPs、引物),在4个用量水平上进行优化试验。结果表明:大豆孢囊线虫ISSR-PCR的最佳反应体系为在25μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0. 34μL、模板DNA 1... 详细信息

采用正交设计对大豆孢囊线虫ISSR-PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、d NTPs、引物),在4个用量水平上进行优化试验。结果表明:大豆孢囊线虫ISSR-PCR的最佳反应体系为在25μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0. 34μL、模板DNA 1. 2μL、d NTPs(2. 5 mmol/L) 1. 5μL、引物(10μmol/L)0. 8μL、10×PCR Buffer 2. 5μL。引物PTY26最适退火温度为55℃。用引物PTY188和PTY888对大豆孢囊线虫最佳ISSR-PCR的反应体系进行验证,结果表明该反应体系和程序有较好的重复性和稳定性。

关键词：大豆孢囊线虫 ISSR-PCR 反应体系反应优化

大豆孢囊线虫33E05、34B08和Hg-exp-1基因RNAi功能初步分析与甜菜孢囊线虫分子检测研究

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大豆孢囊线虫33E05、34B08和Hg-exp-1基因RNAi功能初步分析与甜菜...

作者：张瀛东中国农业科学院

学位级别：硕士

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)病是大豆上毁灭性的病害,该病害分布范围大、寄主范围广、传播途径多,造成的经济损失严重,是一种公认的极难防治的大豆病害。目前对于大豆孢囊线虫病主要以化学防治为主,通过研究大豆孢囊线虫取食管... 详细信息

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines)病是大豆上毁灭性的病害,该病害分布范围大、寄主范围广、传播途径多,造成的经济损失严重,是一种公认的极难防治的大豆病害。目前对于大豆孢囊线虫病主要以化学防治为主,通过研究大豆孢囊线虫取食管相关基因,明确大豆孢囊线虫取食管的形成机理和作用机制,可以为开发新型防控技术提供重要的理论基础。本研究以大豆孢囊线虫33E05基因为研究对象,采用发育表达分析,亚细胞定位技术和体外RNAi等研究该基因的表达特性与功能。亚细胞定位结果表明,大豆孢囊线虫取食管形成相关基因33E05,34B08表达蛋白定位于寄主植物细胞膜,原生质体的定位实验确定了其定位在细胞膜而非细胞壁。推测大豆孢囊线虫分泌的效应蛋白33E05,34B08可能通过作用于细胞膜与内质网等,参与了线虫取食管的形成与维持。对33E05,34B08的不同龄期的发育表达分析表明,在大豆孢囊线虫的整个发育过程中33E05,34B08基因均有表达,其中在侵染前2龄幼虫(J2)与侵染后2龄幼虫(PJ2)中表达量最高,推测这两个基因在大豆孢囊线虫取食管的形成过程中可能起着重要作用。采用体外RNAi技术对大豆孢囊线虫33E05,34B08基因进行了初步的功能研究,实验结果表明:经dsRNA浸泡处理后的2龄幼虫靶基因转录水平明显下降。在大豆接种实验中,寄主根内线虫数量与对照无明显差异,由此推测该基因家族可能与线虫发育相关,对线虫侵染能力没有影响。在实验室前期研究的基础上,对大豆孢囊线虫扩展蛋白基因hg-exp-1进行了功能分析。Hg-exp-1体外RNA干扰后,根内2龄幼虫数和雌虫数分别下降38.3%和43.4%。由此确认其在大豆孢囊线虫寄生早期过程中起着重要作用。甜菜孢囊线虫(Heteradera schachtii)是甜菜生产的重要病原物,也是我国重要的进境检疫性线虫病原,为了能够对甜菜孢囊线虫进行快速的分子水平上的检测鉴定,本实验通过对甜菜孢囊线虫的样品进行DNA提取,以RAPD引物进行PCR扩增测序,设计出针对甜菜孢囊线虫的SCAR特异性引物,能够快速灵敏的对甜菜孢囊线虫进行分子水平上的检测鉴定,最低检出阈值为1/40000个孢囊,1/320头2龄幼虫,有利于我国植物检疫工作的快速有效进行,同时也有利于我国线虫病害的防治。

关键词：大豆孢囊线虫基因功能表达特性体外RNAi 分子检测