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多级微米结构丝素膜制备及调控炎症反应促创面愈合研究

多级微米结构丝素膜制备及调控炎症反应促创面愈合研究

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作者：杨福廷西南大学

学位级别：硕士

皮肤由于长期暴露于外部环境中易造成不同类型的损伤,进而对患者的身体和心理健康造成严重影响。目前皮肤损伤的治疗方式有自体移植、异体移植、伤口敷料等,但难愈创面和创面愈合疤痕组织的形成仍然是临床的难点。在皮肤愈合过程中,巨... 详细信息

皮肤由于长期暴露于外部环境中易造成不同类型的损伤,进而对患者的身体和心理健康造成严重影响。目前皮肤损伤的治疗方式有自体移植、异体移植、伤口敷料等,但难愈创面和创面愈合疤痕组织的形成仍然是临床的难点。在皮肤愈合过程中,巨噬细胞和成纤维细胞发挥着不可或缺的作用。M1型巨噬细胞可以引发炎症反应和杀灭病原体,M2型巨噬细胞则有利于炎症消退和皮肤组织形成。巨噬细胞向M1型和M2型极化的平衡对创面快速无疤愈合具有重要作用。皮肤真皮层的主要细胞之一为成纤维细胞,当皮肤损伤后,成纤维细胞会被大量招募至皮肤创面处,并在相关生长因子和细胞因子刺激下分化成肌成纤维细胞。肌成纤维细胞能在伤口处分泌大量的胶原蛋白并提供强大的拉力促进组织纤维化进程,进而加速创面收缩愈合,但肌成纤维细胞一直存在会造成疤痕形成。构建能调控创面愈合过程炎症反应和成纤维细胞分化的创面修复材料有望实现难愈创面快速无疤愈合。家蚕蚕丝的丝素蛋白(Silk Sericin,SF)是天然蛋白质,由于其对生物体没有毒性、生物相容性优越以及具有很好细胞附着性使其作为一种生物材料在皮肤修复领域具有极大的潜力。前期研究表明支架材料的微纳米结构能够调控巨噬细胞的极化及细胞形态、粘附、迁移和分化。本研究利用软光刻和飞秒激光刻蚀制备多级微米结构聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)模板,再利用溶液浇铸法将PDMS弹性印模上的多级微米结构复刻到SF膜上制备多级微米结构SF膜,以期利用该多级微米结构形成的物理微环境调控巨噬细胞的极化和成纤维细胞的分化实现创面的快速无疤愈合。本研究获得的主要研究结果如下:(1)制备了形貌均一、规整的多级微米结构SF膜通过软光刻和飞秒激光刻蚀制备多级微米结构的PDMS模板,利用该模板和溶液浇铸的方法得到多级微米结构SF膜。软光刻将硅片上的微米沟槽结构复刻到了PDMS模板上,飞秒激光在具有微米沟槽的PDMS模板上加工出了亚微米的脊结构。这些取向性的脊结构平行于沟槽结构。根据微米沟槽结构的不同尺寸将SF膜分为100-50-25和400-400-200两个实验组进行下一步研究。扫描电镜(Scanning Electron Microscopy,SEM)结果表明,无结构SF膜表面光滑平整、无划痕,而实验组SF膜表面具有均一、规整的多级有序结构;所有SF膜水蒸气透过率在700-850 g·m·d之间,处于正常皮肤水蒸气透过率240 g·m·d-1920g·m·d的范围内;接触角测试结果表明制备的SF膜材料为亲水性材料,具有适当的溶胀性能,既能吸收部分水分又能比较好的抵抗水的溶胀;红外光谱、X射线衍射(X-ray diffraction,XRD)和热学性能等测试结果显示无结构SF膜和多级微米结构SF膜化学基团、结晶学性能和热学性能无明显差异。上述结果表明,SF膜是具有良好透气性、抗水溶胀性和亲水性材料,适合用于敷料。利用PDMS模板和溶液浇铸的方法制备的多级微米结构SF膜仅改变了膜表面的结构,未对化学性能造成明显影响,这有利于研究SF膜上多级微米结构对创面愈合的影响。(2)多级微米结构SF膜对巨噬细胞行为的调控CCK-8结果表明巨噬细胞能在多级微米结构SF膜上增殖,但其增殖速度低于在无结构SF膜上。SEM和细胞骨架染色结果表明,无结构SF膜仅能促进少部分细胞生出分散伪足,呈现M1型形态;多级微米结构SF膜不但能促进部分细胞伸出分散伪足到沟槽壁等位置,呈现M1型分散多伪足形态,还可以诱导部分细胞呈梭形,展现为M2型形态。流式细胞分析结果也表明,无结构SF膜能促进约5%的巨噬细胞像M1型极化,多级微米结构SF膜既能促进部分细胞向M1型极化也能促进另一部分细胞向M2型极化。RT-q PCR对M1型特征基因(i NOS、TNF-α和IL-1β)和M2型特征基因(Arg-1)的表达检测结果也再次证实了这一点。其中,400-400-200实验组的效果更为显著。(3)多级微米结构SF膜对成纤维细胞行为的调控细胞CCK-8实验的结果表明成纤维细胞能在多级微米结构SF膜上正常增殖生长,但其增殖速度低于在无结构SF膜上。SEM和FITC实验结果表明多级微米结构SF膜增加了膜表面粗糙度,有助于L-929成纤维细胞的黏附,实验组成纤维细胞生成大量的丝状伪足,细胞向两端伸长。免疫荧光检测显示,创面愈合前期多级微米结构SF膜促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,其中400-400-200实验组的促进效果更显著。RT-q PCR的结果显示多级微米结构SF膜在创面愈合后期抑制肌成纤维细胞的形成,400-400-200实验组抑制效果更显著。(4)多级微米结构SF膜对巨噬细胞和成纤维细胞共培养行为的调控CCK-8结果显示共培养体系的构建延缓了细胞增殖时间。SEM和FITC的结果也表明共培养体系细胞

关键词：皮肤创面愈合多级微米结构丝素膜巨噬细胞成纤维细胞

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