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多头带绦虫dUTPase基因的原核表达、组织定位及酶学活性分析

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畜牧兽医学报 2017年第12期48卷 2374-2382页

作者：黄兴徐璟王宇杨应东万洁郭承古小彬谢跃杨光友四川农业大学动物医学院成都611130 成都农业科技职业学院成都611130 攀枝花农林科学研究院攀枝花617061

探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为44... 详细信息

探讨多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)的基因特征,并初步分析Tm-dUTPase的酶学活性。通过原核表达,得到重组Tm-dUTPase蛋白,并对其进行Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析。序列分析结果显示,Tm-dUTPase基因ORF框为447bp,编码148个氨基酸,预测的蛋白质分子大小为16.39ku,等电点为6.263;与猪囊尾蚴和豆状囊尾蚴dUTPase基因的氨基酸序列相似性分别为97%和91%。原核表达的TmdUTPase为可溶性蛋白,纯化后的蛋白质质量浓度为0.907mg·mL^(-1),Western blot分析显示,该蛋白质能够被山羊脑多头蚴阳性血清所识别,具有较强的反应原性。免疫荧光定位显示Tm-dUTPase主要分布于多头带绦虫成虫的体内实质区,同时广泛分布于多头带绦虫幼虫(脑多头蚴)的头节和包囊囊壁外层。酶学活性试验测得重组Tm-dUTPase的比活力为986.29U·mg^(-1),EDTA能够抑制Tm-dUTPase活性,而金属离子Mg^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)能够增强Tm-dUTPase活性。上述结果为进一步研究Tm-dUTPase基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：多头带绦虫 dUTPase基因原核表达酶学活性分析免疫荧光定位

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多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

中国兽医科学 2009年第3期39卷 251-256页

作者：李永光李文卉李航盖文燕王鸿盛姚菊霞王艳华张德林贾万忠 Radu Blaga 付宝权甘肃农业大学动物医学院中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室 College of Veterinary Medicine University of Agricultural Sciences and Veterinary MedicineCluj-Napoca 400372Romania

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个... 详细信息

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸。对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物。结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白。对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性。

关键词：多头带绦虫多头蚴硫氧还蛋白过氧化物酶重组蛋白免疫原性

多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1基因的克隆及原核表达

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中国兽医科学 2015年第2期45卷 126-131页

作者：岳龙李文卉张念章曲自刚贾万忠殷宏付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为研究多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1的功能,利用PCR分别以多头带绦虫基因组DNA和cDNA为模板扩增TmAdh1的基因组序列和cDNA序列,并利用生物信息学软件对该基因进行预测分析。将TmAdh1基因片段连接至原核表达载体pGEX4T-1进行原核表达,并利用... 详细信息

为研究多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1的功能,利用PCR分别以多头带绦虫基因组DNA和cDNA为模板扩增TmAdh1的基因组序列和cDNA序列,并利用生物信息学软件对该基因进行预测分析。将TmAdh1基因片段连接至原核表达载体pGEX4T-1进行原核表达,并利用Western-blot分析该蛋白的抗原性。结果显示,TmAdh1的基因组序列长1 848bp,由2个内含子和3个外显子组成,其开放阅读框的长度为402bp,编码133个氨基酸残基。预测分析表明,TmAdh1蛋白含有1个N端信号肽序列、1个纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域、1个糖基化位点和8个线性B细胞抗原表位。在原核系统成功表达了约40ku的重组蛋白TmAdh1,用其免疫小鼠制备超免疫血清。Western-blot试验表明,重组蛋白TmAdh1可以与免疫小鼠血清反应。以上研究结果表明,多头带绦虫TmAdh1基因是带科绦虫宿主保护性抗原的同源基因,可作为脑多头蚴病疫苗的候选分子。

关键词：多头带绦虫 TmAdh1 纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域原核表达

多头带绦虫甘肃分离株线粒体NADH脱氢酶亚基Ⅰ基因片段差异分析

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中国兽医学报 2011年第5期31卷 663-667,673页

作者：李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠罗建勋 R.Blaga 付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca 400372Romania

应用线粒体DNA中的NADH脱氢酶亚基Ⅰ（ND1）基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,构建系统进化树,分析其种内变异。结果表明,所有多头带绦虫（***）分离株均成功扩增出约0.5 kb的ND1基因片段。序列... 详细信息

应用线粒体DNA中的NADH脱氢酶亚基Ⅰ（ND1）基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,构建系统进化树,分析其种内变异。结果表明,所有多头带绦虫（***）分离株均成功扩增出约0.5 kb的ND1基因片段。序列分析显示,去除引物序列后多头带绦虫的ND1基因片段长为488bp,可以分为9类,共有22个核苷酸变异位点,变异率为0.20%~2.66%。基于ND1序列的系统进化树表明所有***分离株构成1个分支,可分为3个亚群,国内分离株分别处在不同的亚群中。国内分离株中除了与已知的遗传变异型Tm1（AY669089/Tm-JT081204/Tm-JT090331）和Tm3（DQ077820/Tm-JT080526）相同外,还存在新的遗传变异型（Tm-JT081008/Tm-JT090603/Tm-JT090115-2）,独立为一支,与其他分离株亲缘关系较远;表明ND1基因片段适合作为研究***分离株种内变异的分子标记。

关键词：多头带绦虫脑多头蚴 NADH脱氢酶亚基I基因种内变异

多头带绦虫成虫和幼虫的iTRAQ蛋白质组学分析

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中国人兽共患病学报 2022年第12期38卷 1051-1056页

作者：李文卉王建魁张念章曲自刚刘垠鞠贾万忠付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046 甘肃省兰州市七里河区动物疫病预防与控制中心兰州730050 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

目的分析多头带绦虫成虫和幼虫样本中的差异蛋白定量结果,为筛选调节寄生虫发育和生长的特定蛋白奠定基础。方法提取多头带绦虫成虫与脑多头蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳分析后,采用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)技术和... 详细信息

目的分析多头带绦虫成虫和幼虫样本中的差异蛋白定量结果,为筛选调节寄生虫发育和生长的特定蛋白奠定基础。方法提取多头带绦虫成虫与脑多头蚴原头节蛋白质样本进行SDS-PAGE电泳分析后,采用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)技术和液相串联质谱(LC-MS/MS)分析,当两种样品蛋白的差异倍数达到1.5倍以上,且经检验有统计学意义时,视为差异蛋白。结果本研究共鉴定了684个蛋白,其中130个差异表达蛋白,相对于幼虫,成虫上调蛋白69个,分别为副肌球蛋白,果糖-1,6-二磷酸酶,钙结合蛋白,六钩蚴蛋白Tso22c,热休克蛋白70,8 kDa糖蛋白,肌球蛋白轻链,钙调蛋白等;成虫下调蛋白61个,分别是抗原cC1,钙蛋白酶,膜联蛋白B3,皮层蛋白,糖脂转移蛋白,微管相关蛋白,乳酸脱氢酶B,xpa-结合蛋白等。通过实时定量PCR验证了10个差异明显的蛋白。另外,差异蛋白路径注释中约30%的蛋白参与了代谢途径和次生代谢物的生物合成。结论本研究为多头带绦虫发育、生活史及寄生虫-宿主的互作机制研究提供了基线资料。

关键词：多头带绦虫脑多头蚴蛋白质组学 iTRAQ技术液相色谱串联质谱

多头带绦虫Tm16与Tm18抗原基因的克隆及原核表达

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中国预防兽医学报 2011年第1期33卷 76-79页

作者：李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠罗建勋 BLAGA R 付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046 University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine Cluj-Napoca 400372Romania

为原核表达Tm16和Tm18重组蛋白,本研究以自然感染羊源脑多头蚴原头节基因组DNA为模板分别扩增Tm16和Tm18抗原基因全基因片段,测序鉴定后合成其开放阅读框架DNA片段,将基因组序列中的内含子去除并对其稀有密码子进行改造优化,构建重组表... 详细信息

为原核表达Tm16和Tm18重组蛋白,本研究以自然感染羊源脑多头蚴原头节基因组DNA为模板分别扩增Tm16和Tm18抗原基因全基因片段,测序鉴定后合成其开放阅读框架DNA片段,将基因组序列中的内含子去除并对其稀有密码子进行改造优化,构建重组表达质粒pGEX-Tm16和pGEX-Tm18。转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物并进行纯化。结果显示:在大肠杆菌中表达出带有GST标签的大小约为39.6 ku和39.4 ku的重组蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性的GST-Tm16及GST-Tm18重组蛋白,western blot分析表明重组蛋白均能够被兔抗GST单克隆抗体特异性识别。

关键词：多头带绦虫 Tm16 Tm18 原核表达

多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶基因的原核表达及其表达产物的酶学活性分析

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中国兽医科学 2016年第11期46卷 1406-1411页

作者：黄兴陈林王宇徐璟郭承古小彬杨光友四川农业大学动物医学院四川成都611130 成都农业科技职业学院四川成都611130

为探讨多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶(C u/Zn-SO D)基因的特征及该酶在多头带绦虫上的抗氧化作用,采用RT-PCR技术扩增脑多头蚴C u/Zn-SO D基因,构建原核表达载体p ET-32a-C u/Zn-SO D;然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;... 详细信息

为探讨多头带绦虫铜锌超氧化物歧化酶(C u/Zn-SO D)基因的特征及该酶在多头带绦虫上的抗氧化作用,采用RT-PCR技术扩增脑多头蚴C u/Zn-SO D基因,构建原核表达载体p ET-32a-C u/Zn-SO D;然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达;对表达产物进行W estern-blot检测,并进行酶比活性分析。结果显示,多头带绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列与猪带绦虫和肥头绦虫C u/Zn-SO D基因编码蛋白的氨基酸序列的相似性分别为98%和92%;纯化后的多头带绦虫重组Cu/Zn-SOD蛋白的浓度为1.587 m g/m L;用羟胺法测得该重组蛋白的酶比活性为3 125.64 U/mg±76.82 U/mg;H2O2、SDS和EDTA对重组的多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性具有较强的抑制作用,而氯仿-乙醇和脲素则对多头带绦虫Cu/Zn-SOD的酶活性并无影响。上述结果为进一步研究多头带绦虫C u/Zn-SO D基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：多头带绦虫 Cu/Zn-SOD基因原核表达酶学活性分析

多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基基因的克隆及原核表达

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中国畜牧兽医 2017年第10期44卷 2858-2864页

作者：杨洋李文卉张念章李婷婷李立闫鸿斌贾万忠付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室、农业部兽医公共卫生重点开放实验室、甘肃省动物寄生虫病重点实验室兰州730046 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009

为鉴定多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基(Tm PKA-C)基因作为诊断抗原的潜能,本试验以多头带绦虫成虫RNA为模板,利用RT-PCR扩增Tm PKA-C基因。将Tm PKA-C基因片段连接至p ET-30a原核表达载体进行原核表达,然后利用Western blotting和间接ELIS... 详细信息

为鉴定多头带绦虫蛋白激酶A催化亚基(Tm PKA-C)基因作为诊断抗原的潜能,本试验以多头带绦虫成虫RNA为模板,利用RT-PCR扩增Tm PKA-C基因。将Tm PKA-C基因片段连接至p ET-30a原核表达载体进行原核表达,然后利用Western blotting和间接ELISA分析该蛋白的反应原性。结果表明,Tm PKA-C基因开放阅读框的长度为1 032 bp,可编码343个氨基酸。Tm PKA-C基因的表达产物主要以包涵体的形式存在,重组蛋白的分子质量大小约42 ku。Western blotting结果表明,该重组蛋白既能与自然感染脑多头蚴的绵羊血清发生特异性反应,又能与人工感染脑多头蚴不同时间段的绵羊血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性。间接ELISA分析结果表明,脑多头蚴绵羊血清能与重组蛋白发生特异性反应,进一步证明该重组蛋白的反应原性良好。本研究为筛选脑多头蚴病诊断新抗原奠定了基础。

关键词：多头带绦虫 TmPKA-C 原核表达反应原性

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多头带绦虫的分类研究进展

中国兽医学报 2016年第8期36卷 1450-1454页

作者：李文卉付宝权中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室甘肃兰州730046

对于寄生在中枢神经系统外的多头蚴,有人将其命名为格氏多头蚴,并且认为是区别于脑多头蚴的一个新的株或基因型;也有人将其命名为斯氏多头蚴或认为是脑多头蚴的同种异名。现就目前报道的寄生在绵羊中枢神经系统及山羊中枢神经系统外的... 详细信息

对于寄生在中枢神经系统外的多头蚴,有人将其命名为格氏多头蚴,并且认为是区别于脑多头蚴的一个新的株或基因型;也有人将其命名为斯氏多头蚴或认为是脑多头蚴的同种异名。现就目前报道的寄生在绵羊中枢神经系统及山羊中枢神经系统外的多头带绦虫的分类现状进行简要综述,主要依据流行病学从传统形态学及现代分子生物学两方面进行阐述,为多头带绦虫的分类工作提供科学依据。

关键词：多头带绦虫格氏多头蚴斯氏多头带绦虫脑多头蚴