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壁虎粗多肽对SH-SY5Y细胞增殖和凋亡的影响

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中国临床药理学杂志 2021年第6期37卷 681-684页

作者：尹慧萍王兵兵黄泽月王艳王建刚河南科技大学医学院河南洛阳471023 河南科技大学第一附属医院药学部河南洛阳471000

目的研究壁虎粗多肽(GCPs)对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞增殖、凋亡能力的影响。方法用不同浓度GCPs(0,0.08,0.12,0.16,0.20,0.24,0.32 mg·mL^(-1))分别处理SH-SY5Y细胞24,48,72 h,用噻唑蓝(MTT)比色法检测SH-SY5Y细胞增殖能力的变化,根据MTT结果分组。将SH-SY5Y细胞分为空白组和低、中、高剂量实验组(GCPs:0,0.12,0.16,0.20 mg·mL^(-1))。用流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞的凋亡率,用Hoechst 33258荧光染色检测细胞核变化,用蛋白质印迹法检测胱天蛋白酶-3(Caspase-3)和Caspase-9蛋白的表达水平。结果GCPs作用SH-SY5Y细胞24,48,72 h的半数抑制浓度(IC_(50))值分别为(0.23±0.01),(0.20±0.01)和(0.17±0.01)mg·mL^(-1)。空白组和低、中、高剂量实验组的细胞凋亡率分别为(10.21±0.73)%,(20.93±2.07)%,(32.90±1.07)%和(57.71±8.51)%,低、中、高剂量实验组的凋亡率与空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在荧光显微镜下观察,低、中、高剂量实验组蓝色荧光分布不均,细胞核缩小,有较强荧光团出现。空白组和低、中、高剂量实验组的Caspase-3与GAPDH灰度值比值分别为0.25±0.05,0.43±0.06,0.52±0.07和0.59±0.06,低、中、高剂量实验组与空白组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01);Caspase-9与GAPDH灰度值比值分别为0.17±0.01,0.19±0.02,0.23±0.02和0.26±0.02,高剂量实验组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论GCPs可抑制SH-SY5Y细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能与激活Caspase凋亡途径相关。

关键词：壁虎粗多肽 SH-SY5Y细胞增殖凋亡

壁虎粗多肽诱导食管癌KYSE450细胞凋亡机制研究

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中国临床药理学杂志 2017年第24期33卷 2606-2609页

作者：郭梦丽段冷昕刘玲杨雪娇靳颖段一梦王建刚河南科技大学医学院药理学与分子生物学实验室河南洛阳471000

目的研究壁虎粗多肽(GCP)体外对食管癌KYSE450细胞的增殖抑制作用。方法取对数生长期细胞,种板,用不同浓度的(0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.4,0.45,0.50,0.55,0.6 mg·mL^(-1))GCP处理KYSE450细胞24,48,72 h,通过噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞增殖,根据MTT结果,将实验分组为空白组(0)和低、中、高3个浓度(GCP:0.1,0.15,0.22 mg·mL^(-1))实验组与对照组(10μg·mL^(-1)阿霉素)。以免疫印迹法检测GCP对KYSE450细胞内B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)蛋白表达的影响。结果 GCP处理KYSE450细胞24,48,72 h后,半数抑制浓度(IC_(50))值分别为0.32,0.28,0.24 mg·mL^(-1)。空白组和低、中、高3个浓度实验组与对照组的Bax与Bcl-2灰度比值平均分别为(23.83±0.07)%,(51.08±0.78)%,(148.26±6.19)%,(329.33±4.44)%,(115.84±0.26)%;这5组的Caspase-9与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)灰度比值平均分别为(14.81±1.05)%,(20.91±1.24)%,(39.61±1.89)%,(43.68±1.13)%,(39.82±0.69)%;这5组的Caspase-3与GAPDH灰度比值平均分别为(6.37±0.51)%,(10.97±0.50)%,(13.44±0.49)%,(17.03±0.49)%,(8.63±0.42)%。以上各项指标,与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 GCP可抑制KYSE450细胞增殖并诱导其凋亡,其机制与Caspase依赖性途径有关。

关键词：壁虎粗多肽 KYSE450细胞凋亡 Caspase依赖性途径

壁虎粗多肽对肝癌HepG2细胞增殖及自噬相关蛋白表达的影响

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中国临床药理学杂志 2019年第16期35卷 1791-1793页

作者：李芳徐萍王云高婷婷潘红宁江苏医药职业学院内科护理教研室江苏盐城224005 江苏医药职业学院教学督导室江苏盐城224005 盐城市第一人民医院消化科江苏盐城224000 盐城市第一人民医院肿瘤科江苏盐城224000

目的观察壁虎粗多肽对肝癌HepG2细胞增殖及自噬相关蛋白表达的影响。方法低、中、高剂量实验组肝癌HepG2细胞分别予以0.15,0.30,0.45mg·mL-1壁虎粗多肽处理,对照组细胞则予以等量0.9%氯化钠。噻唑蓝(MTT)法检测HepG2细胞增殖抑制情况,... 详细信息

目的观察壁虎粗多肽对肝癌HepG2细胞增殖及自噬相关蛋白表达的影响。方法低、中、高剂量实验组肝癌HepG2细胞分别予以0.15,0.30,0.45mg·mL-1壁虎粗多肽处理,对照组细胞则予以等量0.9%氯化钠。噻唑蓝(MTT)法检测HepG2细胞增殖抑制情况,用蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达情况。结果给药72h后,低、中、高剂量实验组的增殖抑制率分别为(23.16±2.17)%,(51.24±2.28)%,(89.59±2.94)%,组间比较差异均有统计学意义(均P壁虎粗多肽可有效抑制肝癌HepG2细胞增殖,其作用机制可能与上调自噬相关蛋白表达相关。

关键词：壁虎粗多肽 HepG2细胞增殖凋亡自噬

壁虎粗多肽诱导SHSY-5Y细胞凋亡的机制研究

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中国药理学与毒理学杂志 2019年第10期 903-904页

作者：尹慧萍王兵兵黄泽月王建刚河南科技大学医学院河南科技大学第一附属医院

目的壁虎粗多肽（GCP）诱导人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞凋亡的机制研究。方法采用MTT法检测细胞增殖情况;倒置显微镜观察SHSY-5Y细胞的形态学变化;划痕实验检测划痕愈合能力变化;Hoechst33258荧光染色检测细胞核凋亡形态学的变化;Wester... 详细信息

目的壁虎粗多肽（GCP）诱导人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞凋亡的机制研究。方法采用MTT法检测细胞增殖情况;倒置显微镜观察SHSY-5Y细胞的形态学变化;划痕实验检测划痕愈合能力变化;Hoechst33258荧光染色检测细胞核凋亡形态学的变化;Western印迹检测凋亡过程中胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9等关键因子水平的变化。结果 MTT结果显示,GCP对SHSY-5Y细胞增殖有明显抑制作用,24、48 h IC;分别为0.211和0.192 g·L;。GCP组细胞数量少于对照组,排列成簇,胞体膨胀,可见凋亡细胞。低、中、高GCP组细胞迁移抑制率分别为32.92%,44.00%和98.04%（P<0.05）。荧光显微镜下,空白组细胞核呈圆或椭圆形,均匀分布,GCP组细胞核荧光不均匀,核变小,有致密光团。GCP还通过上调胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9的表达,导致SHSY-5Y细胞凋亡。结论 GCP能抑制SHSY-5Y细胞的增殖和迁移,诱导SHSY-5Y细胞凋亡。其机制可能与上调胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9的表达,活化线粒体凋亡通路有关。

关键词：壁虎粗多肽 SHSY-5Y细胞凋亡线粒体凋亡通路

壁虎粗多肽抑制肝癌淋巴管生成的作用及机制研究

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壁虎粗多肽抑制肝癌淋巴管生成的作用及机制研究

作者：郭梦丽河南科技大学

学位级别：硕士

目的:通过观察壁虎粗多肽(GCPs)对人淋巴管内皮细胞(HLECs)在Matrigel基质胶上形成淋巴管样结构的影响、评估在HLECs和人肝癌Hep G2细胞共培养系统中肝癌诱导淋巴管生成的能力和GCPs对肝癌所诱导淋巴管生成的抑制作用、分析GCPs及血管... 详细信息

目的:通过观察壁虎粗多肽(GCPs)对人淋巴管内皮细胞(HLECs)在Matrigel基质胶上形成淋巴管样结构的影响、评估在HLECs和人肝癌Hep G2细胞共培养系统中肝癌诱导淋巴管生成的能力和GCPs对肝癌所诱导淋巴管生成的抑制作用、分析GCPs及血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对HepG2细胞的增殖、迁移等的结果,初步探讨GCPs抑制肝癌淋巴管生成的机制。方法:HLECs和Hep G2细胞体外常规培养,用处于对数生长期的细胞进行后续实验。实验分为三部分:(1)GCPs对HLECs体外成管能力及迁移、侵袭的影响:将不同浓度的GCPs(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40、0.44 mg/mL)作用于HLECs,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法观察GCPs对其增殖的影响;将GCPs(0.08、0.12、0.18、0.27 mg/mL)分别处理HLECs 24 h后,体外成管实验观察GCPs对HLECs在Matrigel基质胶上形成管样结构的影响;将HLEC s和Hep G2细胞建立共培养系统,研究肝癌诱导淋巴管生成的能力以及GCPs对肝癌所诱导淋巴管生成的抑制作用;Western blot检测血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)蛋白的表达水平;另外,将GCPs(0.01、0.02、0.04、0.08 mg/mL)分别处理HLECs 24 h后,Transwell小室实验检测体外GCPs对HLECs迁移及侵袭能力的影响。(2)GCPs对Hep G2细胞的影响:(1)Hep G2细胞分别经不同浓度的GCPs(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.8 mg/mL)处理后,MTT法检测细胞增殖能力;将GCPs(0.1、0.15、0.225、0.3375 mg/mL)分别处理Hep G2细胞24 h后,流式细胞术检测细胞的凋亡,Hoechst 33258染色法检测Hep G2细胞核形态学的变化,细胞免疫组化、Western blot及实时荧光定量(realtime quantitative)PCR(qPCR)法分别检测调控淋巴管生成的VEGF-C及趋化因子受体CXCR4的蛋白及mRNA水平,同时用Western blot测定细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)、丝裂原活化蛋白激酶-38(p38 MAPK)和蛋白激酶B(Akt)蛋白的磷酸化表达水平;(2)将GCPs(0.025、0.05、0.1、0.15 mg/mL)分别处理Hep G2细胞24 h后,通过划痕实验观察GCPs对Hep G2细胞划痕愈合能力的影响,Transwell小室迁移实验及侵袭实验分别检测GCPs处理后Hep G2细胞迁移及侵袭能力的改变,Western Blot及qPCR法分析迁移相关分子基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平。(3)VEGF-C过表达或沉默对Hep G2细胞的影响:采用VEGF-C及siVEGF-C分别瞬时转染Hep G2细胞,检测VEGF-C过表达及VEGF-C下调对Hep G2细胞的效应。实验分为空白对照组,阴性对照(不含质粒DNA的空载体)组,VEGF-C(2.5μg)组/siVEGF-C(2.5μg)组,作用48 h后,MTT法检测对Hep G2增殖的影响,采用Hoechst 33258染色和流式细胞术分析Hep G2细胞的凋亡情况,并测定细胞的迁移和侵袭能力,以及采用qPCR和Western blot检测对VEGF-C信号通路中相关蛋白mRNA和蛋白表达的影响。结果:(1)GCPs抑制HLECs体外成管及迁移、侵袭能力:GCPs处理HLECs24、48、72 h后,IC50值分别为0.209 mg/mL、0.166 mg/mL和0.135 mg/mL;将HLEC s接种于Matrigel基质胶上,当GCPs作用24 h时,GCPs(0.08 mg/mL)组、GCPs(0.12 mg/mL)组、GCPs(0.18 mg/mL)组、GCPs(0.27 mg/mL)组的成管率分别为82.66%、40.00%、17.66、2.33%,与空白对照组(100%)相比差异有统计学意义,结果表明,GCPs可显著抑制HLECs管样结构的形成能力;共培养系统结果显示,Hep G2细胞组(成管率100%)HLECs的体外成管能力明显高于空白对照组(成管率为60.67%),表明HepG2细胞能显著促进HLECs体外形成淋巴管;另外,Hep G2 cells+GCPs(0.1 mg/mL)组、HepG2 cells+GCPs(0.

关键词：壁虎粗多肽淋巴管生成 VEGF-C 共培养体系迁移

壁虎粗多肽对3种消化道肿瘤细胞的体外抑制作用

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河南科技大学学报（医学版） 2012年第3期30卷 161-164页

作者：王建刚钱昕宋莹刘玲席守民崔朝初河南科技大学医学院河南洛阳471000

目的探讨壁虎粗多肽(GCPS)对消化道肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。方法用不同浓度(0.375、0.75、1.0、1.5、3.0 mg/mL)的GCPS处理食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803,于24、48、72 h后倒置显微镜下观察细胞形态变化,并使用... 详细信息

目的探讨壁虎粗多肽(GCPS)对消化道肿瘤细胞体外增殖的抑制作用。方法用不同浓度(0.375、0.75、1.0、1.5、3.0 mg/mL)的GCPS处理食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803,于24、48、72 h后倒置显微镜下观察细胞形态变化,并使用MTT法观察GCPS对3种人消化道肿瘤细胞增殖的影响。结果与空白对照组比较,在倒置显微镜下可观察到GCPS作用24、48、72 h后的细胞形态有不同程度的改变。MTT法结果显示GCPS具有抑制人消化道肿瘤细胞增殖作用,且作用呈浓度和时间依赖性;48 h后GCPS作用于上述3种细胞的IC50为1.1、1.2和1.6 mg/mL。结论壁虎粗多肽可抑制HepG2、EC109和MGC803这3种消化道肿瘤细胞增殖。

关键词：壁虎粗多肽 HepG2 EC109 MGC803

壁虎醇提物有效成份分离及抗消化道肿瘤作用研究

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壁虎醇提物有效成份分离及抗消化道肿瘤作用研究

作者：宋莹河南科技大学

学位级别：硕士

目的：从壁虎醇提物（Gecko alcohol extract，GAE）分离出壁虎粗多肽（Gecko Crude Peptides，GCPs），研究其抗消化道肿瘤作用并初步探讨其抗肿瘤机制。方法：（1）分离及鉴定使用饱和度为25%pH为7.0的硫酸铵溶液溶解多肽，... 详细信息

目的：从壁虎醇提物（Gecko alcohol extract，GAE）分离出壁虎粗多肽（Gecko Crude Peptides，GCPs），研究其抗消化道肿瘤作用并初步探讨其抗肿瘤机制。方法：（1）分离及鉴定使用饱和度为25%pH为7.0的硫酸铵溶液溶解多肽，再使用饱和度为50%pH为4.6的硫酸铵溶液析出多肽，析出的多肽使用截留分子量为3500Da的透析袋除盐，得到GCPs;高效液相色谱法（HPLC）和聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Trincine-SDS-PAGE）初步确定GCPs的极性及分子量。（2）体外细胞实验体外培养食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803，使用倒置显微镜观察不同浓度的GCPs分别作用3种细胞24h、48h、72h各个时间段细胞形态的改变;MTT法检测3mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL、0.75mg/mL、0.375mg/mL的GCPs在24h、48h、72h对3种细胞增殖的抑制作用，western-blot检测肝癌细胞HepG2中增殖蛋白PCNA的表达，并采用Hoechst33258荧光染色观察肝癌细胞HepG2凋亡的形态学改变,TUNEL法检测凋亡率;western-blot检测凋亡蛋白bcl-2和bax的表达,观察GCPs对HepG2细胞凋亡的影响。（3）体内动物实验50只H22移植瘤雄性小鼠，腹腔注射给药，以阿霉素为阳性对照，观察高、中、低浓度GCPs对肿瘤生长的抑制作用，小鼠血清中白细胞数的变化及对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响;western-blot检测肿瘤组织中VEGF蛋白的表达;ELISA法测定小鼠血清中TNF-α和IL-6的含量。结果：（1）对GAE分离得到的GCPs进行分析，发现其为多种极性不同、分子量约在3.5～40KDa范围内的小分子多肽的混合物。（2）体外实验结果显示GCPs（3mg/mL、1.5mg/mL、1mg/mL、0.75mg/mL、0.375mg/mL）作用于食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞MGC803，24h、48h和72h后细胞出现形态改变，除了0.375mg/mL的GCPs在24h时作用不明显之外，其他浓度均可显著抑制3种消化道肿瘤细胞的增殖，对EC109、HepG2和MGC803细胞作用48h后的IC50分别为1.1mg/mL、1.2mg/mL、1.6mg/mL。（3）使用Hoechst33258荧光染色显示用GCPs（1.6mg/mL和0.8mg/mL）处理HepG2细胞48h后出现染色质浓缩、边缘化等典型细胞凋亡的形态学改变;TUNEL法检测显示GCPs（1.6mg/mL和0.8mg/mL）组细胞凋亡率（30.16±2.73%和25.84±3.22%）明显高于对照组（4.86±0.67%）;GCPs（1.6mg/mL和0.8mg/mL）作用HepG2细胞48h后检测蛋白bcl-2和bax的表达，与对照组比较,GCPs（1.6mg/mL和0.8mg/mL）组HepG2细胞bcl-2蛋白表达降低，bax蛋白表达升高，从而，bcl-2/bax比值降低。（4）体内实验结果显示腹腔注射GCPs高剂量组、中剂量组和低剂量组（80mg/kg、40mg/kg和20mg/kg）对小鼠H22移植肿瘤具有显著的抑制作用，与模型组比较，平均瘤重均明显降低（P＜0.05），抑瘤率分别为65.9%、57.7%和44.5%，呈现剂量依赖性。（5）GCPs高剂量可不同程度地升高H22小鼠的白细胞数和胸腺指数、脾指数（P＜0.05）;GCPs可明显降低H22小鼠肿瘤组织VEGF的表达和血清中TNF-α和IL-6的含量。结论：GCPs为多肽混合物，相对分子质量在3.5～40KDa范围内;抗肿瘤活性实验表明其具有显著的抗肿瘤作用，可能与诱导细胞的凋亡，提高机体免疫力，降低肿瘤组织中的血管生成有关。

关键词：壁虎粗多肽 HepG2细胞 H22移植瘤增殖凋亡血管生成