检索结果-南通市图书馆

作者：王姗华中农业大学

学位级别：硕士

禽霍乱(Fowl Cholera)是一种发病率和死亡率高的急性全身性疾病,给家禽养殖业造成巨大经济损失。其病原是禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),属于革兰氏阴性菌。早前,我国鸡场对禽霍乱防控主要依赖于抗生素。随着细菌耐药性... 详细信息

禽霍乱(Fowl Cholera)是一种发病率和死亡率高的急性全身性疾病,给家禽养殖业造成巨大经济损失。其病原是禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),属于革兰氏阴性菌。早前,我国鸡场对禽霍乱防控主要依赖于抗生素。随着细菌耐药性问题日益突出,以及今年我国禁抗限抗全面实施,生物防制将在预防禽霍乱中起着重要作用。但目前的灭活疫苗不能产生免疫交叉保护力,传统弱毒疫苗存在毒力返强的风险,因此开发安全有效的新型疫苗迫在眉睫。本论文采用NgAgo遗传操作系统,以禽多杀性巴氏杆菌GX-PM为亲本株,成功构建了3株无分子标记基因缺失突变株,包括ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM,并对这3株基因缺失突变株体外生长及形态特性、遗传稳定性、致病性及免疫保护效力进行研究分析。具体研究内容及结果如下:1.基因缺失突变株构建首先,本研究成功构建了用于敲除aroA、hexD和hex ABC基因的重组质粒p SHK5(TS)-NgAgo-aroALR、p SHK5(TS)-NgAgo-hexDLR和p SHK5(TS)-NgAgo--hex ABCLR,后分别电转入GX-PM中,将电转菌经过多次传代诱导缺失,最后成功筛选到3株无分子标记基因缺失突变株,分别为ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM。2.基因缺失突变株体外生长及形态特性研究为了分析aroA、hexD和hex ABC基因缺失后对细菌体外生长特性影响,本研究对ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM进行生长曲线测定。结果表明:在体外培养条件下,与GX-PM野生株相比,ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株生长速度均减慢,且ΔaroA-GX-PM突变株在不含芳香族氨基酸条件下无法生长。为了分析荚膜转运基因hexD和hex ABC基因缺失后对细菌荚膜形态的影响,本研究对ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株进行透射电镜观察。结果表明:在体外培养条件下,与具有荚膜的GX-PM野生株相比,ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株细胞壁表面无正常荚膜形态,说明其合成荚膜能力基本丧失。3.基因缺失突变株体外遗传稳定性研究本研究将ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株在液体培养基上连续传代30次,通过PCR检测靶基因是否稳定缺失来分析其遗传稳定性。结果表明:ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株在30代以内均未发生回复突变,具有良好遗传稳定性。4.基因缺失突变株致病性研究为了研究ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株对鸡的致病性,本研究通过肌肉注射不同剂量(10、10、10、10、10 CFU)突变株对30日龄健康肉鸡进行人工感染,连续观察14d并记录临床症状及死亡情况。结果表明,用10 CFU野生菌人工感染时,肉鸡24h内死亡率为100%(n=4),而ΔaroA-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株不同剂量感染组肉鸡均未表现明显临床症状也无死亡情况;ΔhexD-GX-PM突变株感染剂量10和10 CFU组肉鸡死亡率分别为75%和25%,其余剂量组均未出现死亡情况,且部分存活肉鸡先出现临床症状后期逐渐恢复健康。试验结果说明:与GX-PM野生株相比,ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株对鸡的致病性均显著下降。5.基因缺失突变株免疫效力研究由于ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM突变株对鸡的致病性均显著降低,有作为基因缺失弱毒疫苗研发的潜力,所以本文对ΔaroA-GX-PM、ΔhexD-GX-PM和Δhex ABC-GX-PM免疫效力进行研究。本研究使用不同剂量(10、10和10 CFU)的ΔaroA-GX-PM突变株对30日龄健康肉鸡通过肌肉注射进行免疫接种,在免疫后第14d,使用10 CFU的GX-PM野生株对肉鸡进行人工感染,试验结果表明:GX-PM野生株感染后,PBS感染对照组肉鸡在24h内全部死亡(n=4),ΔaroA-GX-PM突变株免疫组肉鸡未出现死亡情况,免疫保护率均为100%;同样地,使用不同剂量(10、10和10 CFU)的Δhex ABC-GX-PM突变株对30日龄健康肉鸡进行免疫接种,在免疫后第14d,使用10 CFU的GX-PM野生株对肉鸡进行感染,试验结果表明:Δhex ABC-GX-PM突变株免疫剂量10、10和10 CFU组免疫保护率为分

关键词：禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株致病性免疫效力疫苗

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大肠杆菌侵袭基因缺失突变株与人脑微血管内皮细胞的相互作用

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细胞生物学杂志 2005年第3期27卷 329-333页

作者：陈冬松方文刚陈誉华宋今丹辽宁大学生命科学系沈阳110036 中国医科大学发育生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001

ibeA、ibeB、ibeC是与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)密切相关的基因,但迄今各基因的功能并不清楚。应用侵袭分析和免疫荧光技术分析了各基因的缺失突变型及野生型大肠杆菌对HBMEC的侵袭、细胞骨架与细胞间紧密连接的影响。结... 详细信息

ibeA、ibeB、ibeC是与大肠杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)密切相关的基因,但迄今各基因的功能并不清楚。应用侵袭分析和免疫荧光技术分析了各基因的缺失突变型及野生型大肠杆菌对HBMEC的侵袭、细胞骨架与细胞间紧密连接的影响。结果显示:野生型菌大肠杆菌侵袭率为3.46%,而ibeA、ibeB、ibeC缺失突变株分别为0.54%、0.82%和0.73%;ibeA缺失突变型与野生型大肠杆菌作用相似,可引起HBMEC的细胞骨架蛋白分布改变,在细胞膜处呈明显的聚集,而ibeB和ibeC缺失突变株并未引起细胞骨架的明显改变;野生型和ibeA缺失突变型大肠杆菌可引起紧密连接结构的明显改变,而ibeB和ibeC缺失突变株对紧密连接结构的影响不明显。这些观察到的结果提示:ibeB和ibeC基因产物可能在调节细胞骨架和影响细胞紧密连接中起重要作用,而ibeA基因产物在其中的作用较小。

关键词：大肠杆菌基因缺失突变株人脑微血管内皮细胞相互作用细胞骨架细胞间紧密连接新生儿细菌性脑膜炎

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透明质酸生产菌溶血素S基因缺失突变菌株的构建及其特性

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微生物学报 2016年第11期56卷 1755-1765页

作者：刘玉川李宇兴赖永勤李学如黄新河郭泰林姚宁西南交通大学生命科学与工程学院四川成都610031

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质... 详细信息

【目的】马链球菌兽疫亚种是工业上生产透明质酸的主要菌种,该菌能产生引起宿主细胞溶血的链球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其产品的安全性一直是人们所担心的问题。本实验的目的就是通过基因敲除的方法构建不产SLS的透明质酸生产工程菌,同时探讨溶血素sag A基因缺失对菌株透明质酸合成和其他毒力因子的影响。【方法】利用温度敏感/自杀性质粒p JR700载体系统,构建马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株;通过PCR扩增,溶血平板和SLS含量测定等方法确定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和细胞毒性试验等分析方法,对野生菌株和sag A基因缺失突变菌株透明质酸含量、透明质酸分子量、溶血素Hylc、透明质酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和菌体表面蛋白等相关毒力因子进行对比研究。【结果】获得了透明质酸产量提高30%而溶血活性极低的马链球菌兽疫亚种sag A基因缺失突变株。该突变株与野生菌株相比较,透明质酸分解酶活性增加而透明质酸相对分子量降低,此外,与毒力相关的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性也显著降低。细胞毒性实验结果表明,野生菌株与sag A基因缺失突变菌株的培养物上清液,对细胞活性的影响存在显著差异。【结论】在马链球菌兽疫亚种中sag A不仅是表达溶血素SLS的基因,同时sag A基因对菌株透明质酸合成、透明质酸分解酶、菌体表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脱氢酶等都具有调节作用。

关键词：马链球菌兽疫亚种基因缺失突变株透明质酸链球菌溶血素S 毒力因子

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胸膜肺炎放线杆菌relA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

胸膜肺炎放线杆菌relA基因缺失株的构建及其生物学特性的研究

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作者：李婷婷东北林业大学

学位级别：硕士

胸膜肺炎放线杆菌(Actinocillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎的病原菌。该病以纤维性肺炎和出血性肺炎为主要病症,具有高发病率和死亡率,呈世界性流行,给全球养猪业造成严重的经济损失,对杂交野猪的饲养造成潜在威胁。严... 详细信息

胸膜肺炎放线杆菌(Actinocillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎的病原菌。该病以纤维性肺炎和出血性肺炎为主要病症,具有高发病率和死亡率,呈世界性流行,给全球养猪业造成严重的经济损失,对杂交野猪的饲养造成潜在威胁。严谨应答是细菌在应对环境压力和营养不足时,为生存快速感知和适应环境变化的调控反应。(p)ppGpp是细菌严谨反应的重要信号分子,主要由relA基因编码的合成酶RelA磷酸化GDP或GTP而合成。因此,本研究通过同源重组、卡那抗性及蔗糖负向筛选的方法,以本实验室保存的APP血清7型野生菌S8为亲本株,构建relA基因缺失株S8△relA,并对其生物学特性进行了初步研究,为进一步探究APP的适应性和致病机制奠定了一定的基础。本研究的主要内容包括:构建缺失株S8△relA:根据GenBank中APP血清7型S8株relA基因序列(NC.009053.1)和pET28a质粒设计引物,分别扩增relA基因同源上下臂relAS、relAX及kan基因,再通过融合PCR将三个片段连接,并克隆至pEMOC2载体中,构建重组转移质粒pEMOC2-relAS-kan-relAX。重组质粒电转至***β2155获得的重组菌***(pEMOC2-relAS-kan-relAX)作为供体菌,亲本株S8作为受体菌,通过接合转移的方法,筛选出具有卡那抗性(Kan R)和氯霉素抗性(CmR)的单交换菌株。利用引物P7/P8鉴定正确后,挑取单菌落分别影印于含Cm抗性平板和含10%蔗糖、Kan抗性平板上,筛选出具有蔗糖抗性、KanR和氯霉素敏感(CmS)的克隆,再利用P3/P4和P9/P10引物进行PCR鉴定,能够扩增出kan基因(816bp)片段,不能扩增出relA基因片段,即可确定该克隆为缺失株。缺失株S8△relA生物学特性:将得到的缺失株S8△relA在体外连续传代培养,通过引物鉴定,结果表明该缺失株具有良好的遗传稳定性;生长曲线测定结果表明缺失株S8△relA与亲本株S8增殖速度变化差异不显著。在平台期营养限制环境下,24 h后S8△relA存活能力降低,说明缺失株的适应性下降。对20种不同氨基酸分别进行缺失,其中在Gly、Ile、Val营养缺失时,S8△rel增殖能力显著受到抑制,结果表明(p)ppGpp能够感知Gly、Ile、Val这三种氨基酸形成的外界压力信号。持留菌形成试验:100μg/mL氟苯尼考杀菌处理3 h后,与野生菌S8相比,缺失株S8△relA形成具有耐药表型的活菌比例显著下降,说明(p)ppGpp影响APP持留菌的形成。缺失株S8△relA生物被膜形成能力随培养时间延长,逐渐降低,并且36 h时生物被膜密度仅为野生菌S8的0.5倍;另外,体外抗肺泡巨噬细胞(PAM)吞噬能力也显著减低,试验结果显示与野生菌S8相比差异极显著。对小鼠致病性实验结果表明,基因缺失株S8△relA相比亲本株S8毒力降低2.7倍。以上结果表明(p)ppGpp在环境胁迫下参与APP适应性调控,并对其毒力有一定的影响。

关键词：胸膜肺炎放线杆菌 relA基因 (p)ppGpp 基因缺失突变株

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牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究

牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究

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作者：定明华中农业大学

学位级别：硕士

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR),是由牛疱疹病毒1型(BHV-1)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病,主要引起呼吸道和生殖道疾病,如传染性鼻气管炎、眼结膜炎、高热、传染性脓疱性外阴道炎、流产等。自被... 详细信息

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR),是由牛疱疹病毒1型(BHV-1)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病,主要引起呼吸道和生殖道疾病,如传染性鼻气管炎、眼结膜炎、高热、传染性脓疱性外阴道炎、流产等。自被发现以来,该病就在世界范围内流行,给养牛业造成巨大的经济损失。IBR被国际兽疫局(0IE)列为B类疾病,该病的根治方法是阳性牛检出与捕杀,而防制的主要措施是接种疫苗,主要采用基因工程疫苗的方法,国外也已相继开发出了牛疱疹病毒1型TK、gE基因缺失重组疫苗。 BHV-1是有囊膜的双股DNA病毒,其基因组G+C含量为72%,大小约为138kb,由一个UL区(106kb)和一个US区(10kb)及US区两侧的重复序列(IRs和TRs,各1lkb,序列相同但方向相反)组成。BHV-1基因组编码70个左右基因,其中有10种为糖蛋白。其中gE糖蛋白是病毒囊膜上的主要糖蛋白。它以细胞特异的方式影响病毒从被感染细胞中释放,同时gE基因的缺失也影响到病毒在细胞间的传播。而胸腺激酶(TK)基因是牛疱疹病毒1型增殖的非必需基因,也是主要毒力基因之一,对病毒在神经组织的持续感染具有非常重要的作用。本研究构建了牛疱疹病毒1型TK／gE双基因缺失突变株,并做了动物安全性和保护力试验,为研究缺失标志活病毒疫苗及研制表达外源基因的BHV-1重组病毒活载体疫苗奠定基础。主要工作包括：1.牛传染性鼻气管炎TK／gE基因双缺失突变株的构建 1)牛传染性鼻气管炎TK-/EGFP+突变株的构建本实验以牛疱疹病毒1型全序列(基因登录号为AJ004801)为基础,提取病毒全基因组。在此基础上设计引物,用PCR技术扩增TK基因上游和下游约1.0 kb和1.1kb的片段作为同源重组臂,分别克隆于载体pBluescriptⅡSK(+)中。用相应的限制性内切酶将下游同源臂回收,定向插入到上游的克隆载体中,构建中间转移载体,并命名为pZF08-21。然后插入带有完整启动子的EGFP报告基因,构建成重组转移质粒,并命名为pZF07-16。以磷酸钙转染法将经线性化的pZF07-16、质粒pBICP0与BHV-1基因组DNA在牛肾细胞(MDBK)上共转染,成功地进行了同源重组,7轮筛选和纯化获得了BHV-1 TK-/EGFP+突变株。 2)牛传染性鼻气管炎TK突变株的构建提取BHV-1 TK-/EGFP+突变株基因组,再次以磷酸钙转染法将经线性化的pZF08-21、质粒pBICP0与基因组DNA在MDBK上共转染,同源重组去掉EGFP荧光标签,经5轮纯化成功的获得了BHV-1 TK-突变株。 3)牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株的构建方法同1,用PCR扩增gE基因上游和下游约1.0kb和1.1kb的片段,分别克隆于载体pcDNA3.1(+)myc-His B中。通过限制性酶切将上游同源臂回收,插入到下游的克隆载体中,构建中间转移载体,并命名为pZF09-08。然后插入EGFP报告基因,构建成重组转移质粒,并命名为pZF09-15。以磷酸钙转染法将经线性化的pZF09-15、质粒pBICP0与BHV-1 TK"缺失突变株基因组DNA在MDBK细胞上共转染,成功地进行同源重组,经过7轮筛选和纯化获得了BHV-1 TK-/gE-/EGFP+突变株。 2.牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株的安全性和保护力研究 1)牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株对牛的安全性研究安全性研究包括三部分：接种试验、同居试验、再激活试验。接种试验和同居试验：将试验组按剂量分为105,106,107三栏,滴鼻免疫4X105、4X106、4X107PFU的双缺失突变株,另设空白对照组。另在各栏中同时喂养未接种的牛作为同居对照。测量试验牛的体温,观察精神状态和采食情况,采集检测样品。再激活试验：接种免疫28天后,连续3天以15mg／头的剂量肌肉注射地塞米松,以激活处于潜伏感染状态的病毒。试验证实了牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株具有很高的安全性。 2)牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株对牛的保护力研究两月龄牛分别用4X105、4X106、4X107PFU的双缺失突变株免疫4周后,以4X107PFU BHV-1强毒攻击。同时设免疫DMEM的空白对照组。分别于攻毒后1d、2d、3d、5d、7d、14d、21d和28d测量体温、采集检测样品。试验结果表明：牛传染性鼻气管炎TK-/gE-/EGFP+双缺失突变株对牛具有很强的保护力。总之,本研究表明,BHV-1 TK-/gE-可以作为候选疫苗毒株,为我国牛传染性鼻气管炎根除计划提供工具。

关键词：牛传染性鼻气管炎牛疤疹病毒1型 TK基因 gE基因基因缺失突变株安全性保护力

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禽病原性大肠杆菌E037株有关基因突变株的构建及其致病性研究

禽病原性大肠杆菌E037株有关基因突变株的构建及其致病性研究

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作者：刘静扬州大学

学位级别：硕士

禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病, CRD)、... 详细信息

禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli, APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病, CRD)、禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。禽大肠杆菌病是2至12周龄鸡和火鸡的一种常见传染病,给养禽业造成了严重的经济损失。大肠杆菌血清型复杂多样,在禽类中最常见的血清型是O1、O2和O78,与其致病相关的毒力因子已被相继报道,如脂多糖复合物、荚膜、黏附素、温度敏感性血凝素、铁摄取系统、外膜蛋白、毒素、AGI-3基因组岛、侵袭素IbeA、Pst系统、大肠杆菌素等。虽然已知APEC有许多种毒力因子,但是还未鉴定出某一单独的毒力因子可以区分所有的致病菌株与非致病菌株。人们在致力于弄清APEC已知毒力因子的同时,也将注意力转移到新的致病基因的分离与鉴定方面。我们在大量禽源大肠杆菌的致病性实验中,发现有相当比例的分离株并不具备已知的毒力因子,这说明这些分离株还存在其他毒力因子,在同一优势血清型的分离株,其致病性也有高低之分。所以寻找发现新的大肠杆菌致病因子,具有重要的研究意义。本研究以构建基因突变株的方法,分离和鉴定了APEC可能的毒力相关基因,同时结合其生物学特性,为研究该病的致病机理和防制措施奠定了基础。1.禽病原性大肠杆菌tsh基因突变株的构建及其与致病性关系的研究运用基因重组方法将庆大霉素抗性基因(GM)连接到PCR扩增的tsh两端区域产生的2个目的基因片段之间,并插入到pUC18载体的多克隆位点中,构建成带GM标志的载体pUC18-tshFRGM,从中切下此3个片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体pMEG375-tshFRGM,将突变载体转化到受体APECE037株和基因缺失突变株E037 (?iro)株中,根据同源重组原理,分别筛选出E037基因缺失突变株E037 (?tsh)和E037 (?iro?tsh)。动物实验结果表明E037 (?iro)、E037 (?tsh)和E037 (?iro?tsh)突变株的致病性均有了明显下降。铁系统和温度敏感性血凝素在APEC E037株的致病性和持续感染中发挥重要的作用,但两个基因的协同致病能力不明显。在243株APEC中,有205株为iro+菌株,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为89.8% (184/205)、8.8% (18/205)和1.5% (3/205);有167株为tsh+菌株,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别为87.4% (146/167)、12.6% (21/167)和0% (0/167)。结果显示铁系统和温度敏感性血凝素为APEC重要的致病因子。2.禽病原性大肠杆菌两个未知基因突变株的构建及其对致病性影响的研究采用抑制差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization, SSH)对禽病原性大肠杆菌高致病株E037 (血清型O78)与非致病菌株K-12 MG1655进行基因组差异片段克隆与分析。从E037株中共检出17个特异性差异片段,选取其中编号为88#和126#的两个片段进行突变株的构建。通过PCR扩增出88#和126# 2个目的基因片段,并插入到T-easy载体的多克隆位点中,构建出T-88#,T-126#,分别从中切下这两个片段,再将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性载体pMEG375-88#,pMEG375-126#将突变载体转化到受体APEC E037中,根据同源重组原理,分别筛选出E037基因插入突变株E037-1及E037-2。动物实验结果表明E037-1及E037-2突变株的致病性均有了明显下降。结果显示这两个基因可能是APEC的致病相关基因,值得对其功能进行进一步研究。

关键词：禽病原性大肠杆菌 iro基因 tsh基因功能未知基因基因缺失突变株抑制差减杂交基因插入突变株

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鸭源鸡杆菌中国分离株F17样菌毛基因的鉴定及其敲除株的构建

鸭源鸡杆菌中国分离株F17样菌毛基因的鉴定及其敲除株的构建

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作者：卢彩景河南农业大学

学位级别：硕士

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,***)是巴氏杆菌科鸡杆菌属的革兰氏阴性菌,主要感染鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类。目前越来越多的研究证明,***作为一种条件性致病菌,不仅是构成鸡上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分,也可引起蛋鸡输卵管... 详细信息

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,***)是巴氏杆菌科鸡杆菌属的革兰氏阴性菌,主要感染鸡、火鸡、鸭、鹅等禽类。目前越来越多的研究证明,***作为一种条件性致病菌,不仅是构成鸡上呼吸道和下生殖道正常菌群的一部分,也可引起蛋鸡输卵管炎、腹膜炎等疾病,导致产蛋量下降、死亡率增加等。目前已经确定了***的数种毒力因子,但其致病机制仍未被阐明。黏附是微生物定殖并侵袭黏膜组织的关键过程。***作为一种黏膜微生物,已经被证实具有黏附塑料制品、形成生物被膜及产生一种糖蛋白样血凝素等黏附相关功能,但在***定殖感染自然宿主的过程中发挥关键作用的具体因素还不清楚。在巴氏杆菌科的其他成员中,已经报道了包括菌毛在内的多种黏附素的存在,其中菌毛作为一种毛发样、细长的菌体表面附属结构,是多种细菌的重要毒力因子。鉴于以上背景,本研究对鸭源鸡杆菌中国分离株中F17样菌毛主要类型Flf的分布与表达情况进行了探究,并分析菌毛主要亚单位蛋白FlfA的免疫原性和反应原性。同时,通过鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附和侵袭特性研究,筛选出致病力相对强的临床分离株作为敲除株构建的野生菌株。最后,尝试对F17样菌毛的flfA基因进行缺失,以期为分析该菌毛在***感染和致病过程中发挥的作用提供良好的基础材料。本论文详细研究内容如下:1、鸭源鸡杆菌flfA基因的鉴定分析及原核表达参照Gen Bank中*** UMN179的全基因组序列,针对flfA基因设计1对特异性引物,扩增并克隆flfA全基因片段。结果显示,flfA基因在鸭源鸡杆菌中国分离株中广泛存在。基因序列分析发现,18株***中国分离株的flfA基因序列同源性为71.1%-100%,与国外参考株的序列同源性为70.2%-99.8%。其推倒的氨基酸序列分析显示,FlfA蛋白具有6-8个优势的抗原表位,并多位于保守序列区。同时,根据对小鼠致病力强的分离株Yu-PDS-RZ-1-SLG的flfA全基因序列设计1对特异性引物,并以其基因组DNA为模板扩增flfA表达片段。将该片段成功克隆到原核表达载体p ET-28a,并转化*** BL21(DE3),成功表达FlfA。将上述纯化的重组蛋白免疫家兔,得到兔源FlfA多克隆血清。Western blotting结果表明,FlfA蛋白不仅具有良好的免疫原性和反应原性,而且在不同菌株均能表达,暗示不同毒株的FlfA同系物之间可能存在交叉免疫保护的能力。该试验确定了Flf菌毛类型在鸭源鸡杆菌中国分离株中存在的广泛性,揭示抗原性良好的FlfA蛋白具有作为疫苗候选蛋白的潜能,同时该研究为后续flfA基因缺失突变株的构建提供可靠的免疫学检测方法。2、鸭源鸡杆菌对鸡输卵管原代上皮细胞黏附和侵袭能力的测定本试验采用免疫组织化学染色法检测鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru-1-SLG株的黏附和侵袭特性,同时利用菌落计数法测定不同鸭源鸡杆菌分离株对鸡原代输卵管上皮细胞黏附能力。免疫组织化学检测结果显示:鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru-1-SLG感染后0.5、1、1.5、2、3、4 h时均未观察到有细菌侵袭细胞的现象,但能导致细胞发生明显的病变,并逐渐破碎脱落;鸭源鸡杆菌Yu-PDS-Ru-1-SLG株对鸡输卵管原代上皮细胞具有一定的黏附能力,并且在一定时间内随着时间的延长黏附于单个细胞的菌量呈现递增趋势。不同菌株黏附试验计数结果显示,不同鸭源鸡杆菌分离株对鸡输卵管原代上皮细胞的黏附能力差异很大。通过免疫组织化学染色法进一步证明Yu-PDS-Ru-1-SLG株不具有侵袭鸡输卵管原代上皮细胞的能力,并且不同鸭源鸡杆菌菌株对鸡输卵管原代上皮细胞黏附能力的差异可能预示其致病力的差异。3、鸭源鸡杆菌flfA基因缺失突变株的筛选本研究根据Gen Bank中发表的*** UMN179的全基因组序列设计特异性引物,扩增并克隆flfA基因的上、下游同源臂,分别以质粒p BC-SK和自杀性质粒p RE112为骨架,成功构建重组质粒p BC-flfA-Gmr和p REΔflfA。将上述两种重组质粒分别通过自然转化法和接合转移法进行缺失突变株的筛选。用于同源重组的打靶片段和自杀性打靶质粒均能成功转化或转移入相应***菌株中。在自然转化法中,筛选了大约3000个CFU仍没有得到flfA基因缺失突变株。在接合转移法中,获得flfA基因的单交换菌株,但筛选了大约10000个CFU仍没有得到flfA基因缺失突变株。通过自然转化法构建鸭源鸡杆菌突变株的过程很简便,但对菌株的要求很高,很难筛选出自然感受性高的菌株进行遗传操作。本研究首次在鸭源鸡杆菌基因缺失突变株的构建中使用接合转移法,并取得突破性的进展。目前筛

关键词：鸭源鸡杆菌 flfA基因原核表达黏附和侵袭基因缺失突变株

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布鲁氏菌中CRISPR-Cas9基因编辑技术研究

布鲁氏菌中CRISPR-Cas9基因编辑技术研究

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作者：李娜华中农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌病是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的人畜共患慢性传染病,主要引起家畜流产、睾丸炎,人感染后会出现波浪热、关节炎,慢性患者会丧失劳动能力,给畜牧业带来了严重的经济损失也极大地危害着人类的健康。目前,没有安全可靠的人用布... 详细信息

布鲁氏菌病是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的人畜共患慢性传染病,主要引起家畜流产、睾丸炎,人感染后会出现波浪热、关节炎,慢性患者会丧失劳动能力,给畜牧业带来了严重的经济损失也极大地危害着人类的健康。目前,没有安全可靠的人用布病疫苗,畜用布病疫苗使用最广泛的是弱毒活疫苗,但普遍存在毒力强、免疫时效短、易感染孕畜、干扰血清学免疫诊断等问题。布鲁氏菌的胞内生存机制以及致病机制还不清楚,不产生内毒素,依靠其毒力基因完成其胞内生存与繁殖机制。随着分子生物学技术的发展,布鲁氏菌毒力基因缺失疫苗有望成为控制布病疫情的新型安全有效的基因疫苗,成为了当下布病疫苗的研究热点。目前,布鲁氏菌基因缺失疫苗都是采用传统的同源重组技术对布鲁氏菌的毒力基因进行缺失,但是由于同源重组技术自身的局限性,限制了其在实验研究中的发展。近年来,一种新型、高效的基因编辑技术,CRISPR-Cas9系统能够进行精确高效的基因敲除或者修饰,已经广泛应用于动植物等真核生物以及部分原核生物如大肠杆菌、根瘤农杆菌等细菌的基因编辑。到目前为止,该基因编辑系统还没有在布鲁氏菌中进行基因编辑的报道。本研究的目的是探究CRISPR-Cas9技术在布鲁氏菌中进行基因编辑的应用情况,为布鲁氏菌基因功能研究提供平台,也为开拓更高效、便捷的布鲁氏菌毒力基因编辑技术提供理论基础。在本研究中,我们首先验证了表达CRISPR-Cas9系统基本元件(pBBR1复制子、pcat启动子)在布鲁氏菌中是否能够正常表达。通过构建载体质粒验证了泛宿主pBBR1复制子及pcat启动子在布鲁氏菌中可以正常发挥作用。之后,我们将CRISPR-Cas9系统构建于载体质粒中,验证了Cas9蛋白在布鲁氏菌中可以正常表达,并且可以切割布鲁氏菌基因组使布鲁氏菌致死。由于布鲁氏菌中缺乏非同源末端连接修复机制,因此将同源修复序列亚克隆至CRISPR-Cas9表达载体中,同时,为了克服质粒残留带来的鉴定干扰问题,以及防止DNA污染以及抗性基因引入带来的生物安全问题,将自杀基因sacB基因亚克隆至CRISPR-Cas9表达载体中,至此,基因敲除同源修复自杀质粒构建完成,将该质粒转化至布鲁氏菌感受态中,利用10%蔗糖进行质粒消除后,利用PCR技术、测序鉴定待检缺失株都为假阳性,都为‘escapers’。1、以质粒pBBR1MCS-5为载体骨架,以pBBR1为复制子,以质粒pZK001-szk001为模板克隆pcat启动子、rrnB T1 terminator、大肠杆菌ColE1复制子,以质粒pET28a为模板克隆lacI基因,构建诱导型穿梭载体质粒。以pXG-10sf质粒为模板克隆lacZ&gfP基因,利用酶切酶连方法连接到载体上,以gfP为报告基因检测诱导型pcat启动子在布鲁氏菌中的表达情况。2、以质粒p ZK35为模板克隆cas9基因的CDS以及sgRNA骨架,利用酶切酶连技术将CRISPR-Cas9元件连接至载体质粒中,以布鲁氏菌国际标准株16M基因组为模板,利用生物学软件设计布鲁氏菌hfq基因的sgRNA dimer,利用酶切酶连方法连接至诱导型表达CRISPR-Cas9质粒上,分别将表达CRISPR-Cas9-sgRNA(targeting hfq)质粒、CRISPR-Cas9-sgRNA(nonspecific)质粒转化至16M布鲁氏菌感受态细胞中,检测CRISPR-Cas9在布鲁氏菌中能否发挥有效的基因编辑功能。Western blot结果显示Cas9蛋白在布鲁氏菌中能够正常表达,转化结果显示Cas9蛋白能够切割布鲁氏菌基因组。3、以质粒pK18mobSacB为模板克隆sacB基因,然后以布鲁氏菌国际标准株16M基因组模板克隆靶基因hfq的上下游同源臂,分别利用酶切酶连、Infusion技术将靶基因的同源修复序列、sacB基因,构建至诱导型CRISPR-Cas9表达载体中,构建完整的基因敲除同源修复自杀质粒。利用电转化方法将该质粒转化入布鲁氏菌16M布鲁氏菌感受态细胞,利用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导CRISPR-Cas9的表达进行靶基因的切割,最后利用终浓度为10%蔗糖将质粒消除。利用PCR技术、测序检测无质粒残留的布鲁氏菌待检缺失株。结果显示并未检测到阳性布鲁氏菌基因缺失突变株,皆为‘escapers’。同时在HDR应用探索过程中,发现当有线性化DNA或者非复制型质粒DNA与CRISPR-Cas9表达质粒共转时,‘escapers’的数量呈现显著性地增加。初步推测,布鲁氏菌中可能含有类似于anti-CRISPR-Cas9系统存在,在特定的条件被诱导激发,导致‘escapers’数量的显著增加。

关键词：布鲁氏菌 CRISPR-Cas9 HDR ‘escapers’ 基因缺失突变株

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鼠伤寒沙门菌多重基因缺失株的构建与致病性分析

鼠伤寒沙门菌多重基因缺失株的构建与致病性分析

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作者：王启艳西北农林科技大学

学位级别：硕士

沙门菌(Salmonella)是一种侵袭性的、兼性细胞内致病菌,具有在多种寄生宿主体内进行定植的能力。其中,鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种较常见的重要人兽共患病原菌,宿主谱十分广泛,食入该菌污染的食物和饮水可以引起人和动... 详细信息

沙门菌(Salmonella)是一种侵袭性的、兼性细胞内致病菌,具有在多种寄生宿主体内进行定植的能力。其中,鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种较常见的重要人兽共患病原菌,宿主谱十分广泛,食入该菌污染的食物和饮水可以引起人和动物的胃肠道疾病。近年来,随着兔业养殖的发展,沙门菌在家兔致病上比较常见,病原菌主要为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,不同品种不同年龄的家兔均可被感染。鼠伤寒沙门菌感染兔群后,除引起母兔流产死亡,幼兔腹泻,还可对兔的皮毛制品、肉制品等造成污染。兔沙门菌病的发生和流行,不仅给家兔产业带来巨大的经济损失,也会带来严重的公共卫生安全问题。在全球范围内,鼠伤寒沙门菌每年引起超过数百万人的感染,严重威胁人类健康。研究表明,沙门菌的致病性与其毒力因子密切相关。沙门菌之所以能在宿主体内生存、繁殖和扩散主要是因为有大量毒力相关基因的存在及相互作用而使宿主感染发病。一直以来对沙门菌致病及防治的研究备受人们的关注,如何更好的防控畜禽沙门菌及保护人类健康已成为国际公共卫生关注的一个热门课题。通过构建沙门菌单个或多个毒力基因缺失株研制更稳定的减毒沙门菌疫苗等非常重要,研究并防治沙门菌感染对医学、兽医公共卫生和食品安全等具有重要的社会效益。本研究从陕西杨凌、宝鸡、武功三个兔场中,以出现母兔流产、死亡、腹泻为主要临床表现及剖检肝脾肿大、肠道鼓气的病死兔,采集其肝脏、脾脏及粪便,通过细菌分离培养方法获得疑似沙门菌菌株五株,对其进行了挑纯、生化试验、分子生物学鉴定和动物致病性试验分离到鼠伤寒沙门菌;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了鼠伤寒沙门菌毒力基因Sop B和Ssr B的敲除载体,成功构建筛选获得鼠伤寒沙门菌△Sop B、△Ssr B和△Sop B-Ssr B基因缺失突变株,并进行了小鼠致病性试验。为建立鼠伤寒沙门菌CRISPR/Cas9基因精确编辑技术提供基础,同时探索鼠伤寒沙门菌基因缺失突变株作为减毒活疫苗或载体的可行性,为沙门菌减毒疫苗的研制提供参考。试验结果如下:1.从三个兔场获得的疑似沙门菌菌株在麦康凯琼脂平板上呈中等大小,透明或半透明,圆形,光滑微凸起的菌落;在SS琼脂平板上呈圆形,中心有小黑点或几乎全呈黑色状,边缘整齐,光滑的菌落。生化试验和特异性PCR检测结果确定有三株分离菌株为鼠伤寒沙门菌(Y3,B2,W1)。药敏试验结果表明分离菌株对青霉素、万古霉素、四环素、红霉素等几乎均有强耐药性,对妥布霉素、氯霉素、卡那霉素等有耐药性,对链霉素、庆大霉素等均敏感,且三个兔场分离的沙门菌株耐药性还有一定差异。分离菌株感染幼兔试验能引起兔腹泻及精神萎靡等临床症状,病死兔剖检重新分离到鼠伤寒沙门菌,经PCR鉴定结果一致。从三个兔场采集的粪便样本经PCR检测出鼠伤寒沙门菌感染率在30%～47%之间2.利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术,通过不断筛选最优sg RNA,建立了基于鼠伤寒沙门菌毒力基因Sop B和Ssr B的含有Cas9、sg RNA和同源臂序列的重组敲除载体,形成一种更加有效的基因编辑。通过电转化的方法将重组载体转入鼠伤寒沙门菌,成功构建并筛选获得鼠伤寒沙门菌基因缺失突变株△Sop B、△Ssr B和△Sop B-Ssr B。3.鼠伤寒沙门菌野生株和缺失株△Sop B、△Ssr B和△Sop B-Ssr B的生物学特性和毒力试验中,结果显示,与野生株相比,缺失株△Sop B和△Sop B-Ssr B在生长速度和运动活力上相对缓慢,而缺失株△Ssr B与野生株相比生长速度和运动活力没有明显变化。小鼠致病性试验中三株缺失株的LD都比野生株高10～42倍,表明缺失株毒力有所下降,双重基因缺失株△Sop B-Ssr B较两株单重缺失株△Sop B和△Ssr B毒力减弱效果并不明显。以上研究结果表明,兔场沙门菌感染率相对严重,尽管兔场的饲养管理措施和防控到位,但依然存在漏洞。本研究构建的三株鼠伤寒沙门菌基因缺失株毒力有所减弱,能够降低对小鼠的致病性,以期为深入研究鼠伤寒沙门菌减毒疫苗或作为疫苗载体提供参考;双重基因缺失株较单重基因缺失株的减毒效果没有达到预期需要进一步试验及严格筛选毒力候选基因。

关键词：鼠伤寒沙门菌分离鉴定基因缺失突变株致病性

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A/E大肠杆菌疫苗动物模型的建立

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中国兽医学报 2002年第6期22卷 577-581页

作者：冯书章 Edgar C Boedeker Chengru Zhu Timothy Thate James Kaper 朱平邓定华解放军军需大学军事兽医研究所 Center for Vaccine Development University of Maryl and School of MedicineBaltimoreMD21201USA

致病性和出血性大肠杆菌 (代表株 EPEC E2 34 8和 EHEC O15 7)是婴幼儿腹泻、出血性结肠炎和尿路感染综合征 (尿毒症 )的主要病原菌 ,它们同属于粘附脱落 (Attaching/ Effacing,A/ E)大肠杆菌群 ,具有许多共同的毒力基因 ,定位于致病岛 ... 详细信息

致病性和出血性大肠杆菌 (代表株 EPEC E2 34 8和 EHEC O15 7)是婴幼儿腹泻、出血性结肠炎和尿路感染综合征 (尿毒症 )的主要病原菌 ,它们同属于粘附脱落 (Attaching/ Effacing,A/ E)大肠杆菌群 ,具有许多共同的毒力基因 ,定位于致病岛 L EE(the locus of enterocyte effacement)上。本试验主要就 A/ E大肠杆菌致病岛 L EE的 2个主要调节基因 lux和 ler基因对细菌致病性和免疫原性的影响进行了研究。所使用的始发菌株为兔致病性大肠杆菌 RDEC- 1,根据同源重组的原理 ,利用自杀性载体 p CVD44 2技术 ,敲除了位于染色体上的 lux和 ler基因 ,构建了 lux和 ler基因缺失突变株 ,研究了这 2个基因对细菌生长、毒力因子表达的调控作用以及基因缺失突变株的致病性和免疫保护作用。家兔实验研究表明 ,lux基因缺失突变株仍然残存着部分致病作用 ,不足以成为理想的致弱疫苗 ;而 ler基因缺失突变株安全性好 ,具有良好的免疫保护作用 ,是理想的家兔致弱疫苗候选株。这些研究资料为人 A/ E大肠杆菌疫苗 ,尤其是 EHEC O15 7疫苗的研制指明了方向 ,并提供了技术路线。

关键词： A/E大肠杆菌疫苗动物模型 A/E大肠杆菌 LEE致病岛基因缺失突变株毒力基因

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