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啤酒酵母ECM25/YJL201W基因敲除对啤酒风味稳定性的影响

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生物工程学报 2008年第8期24卷 1420-1427页

作者：张一心李崎沈微谢焱顾国贤江南大学工业生物技术教育部重点实验室无锡214122

以pUG6为模板,设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物,构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒,转化啤酒酵母G-03,获得一株G-03/a转化菌,遗传稳定性良好,测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a... 详细信息

以pUG6为模板,设计含有与ECM25基因两侧序列同源的长引物,构建了带有卡那抗性基因(kanMX)破坏盒,转化啤酒酵母G-03,获得一株G-03/a转化菌,遗传稳定性良好,测序结果证实ECM25基因敲除是成功的。有氧条件下11oC和28oC培养时转化菌G-03/a的胞外谷胱甘肽(GSH)分泌量在对数生长期分别比原菌高21.4%和14.7%。在锥形瓶中连续发酵4代后,与原菌株相比,转化菌G-03/a发酵液、成品酒中GSH含量分别提高32.1%和13.8%,发酵液和成品啤酒SI系数分别提高7.7%和5.3%,成品啤酒RSV值提高45.0%。EBC管发酵6d后,与原菌株相比,转化菌G-03/a发酵液中GSH含量提高34.0%。转化菌G-03/a与G-03所酿制成品啤酒的常规指标没有显著差别。表明G-03/a是一株具有抗老化能力的优良啤酒酵母,能够提高啤酒的风味稳定性。

关键词：啤酒酵母基因敲除 ECM25 谷胱甘肽分泌啤酒风味稳定性

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棘孢木霉嗜铁素sidA基因敲除及表型分析

菌物学报 2019年第4期38卷 513-520页

作者：孔爽赵蕾山东师范大学生命科学学院山东济南250014

明确棘孢木霉菌Trichoderma asperellum嗜铁素合成的关键基因,能够为进一步探索嗜铁素在生防和促生中的作用奠定基础。本研究在对sidA基因进行定位、结构分析和RT-PCR检测的基础上,利用double-jointPCR技术构建基因敲除载体,经聚乙二醇(... 详细信息

明确棘孢木霉菌Trichoderma asperellum嗜铁素合成的关键基因,能够为进一步探索嗜铁素在生防和促生中的作用奠定基础。本研究在对sidA基因进行定位、结构分析和RT-PCR检测的基础上,利用double-jointPCR技术构建基因敲除载体,经聚乙二醇(PEG)介导原生质体转化、潮霉素初筛、PCR和southern blot验证获得突变株,并对其表型进行分析,获得2株性能稳定的敲除突变体?sidA1和?sidA2。与野生型相比,?sidA1和?sidA2的嗜铁素产量在5d时分别下降了38.67%和36.65%;孢子萌发率在12h时分别下降了45.33%和47.47%;产孢量在10d时分别下降了33.01%和41.02%,且突变株在受NaCl、KCl、SDS等胁迫时的抗性较野生型降低。表明sidA基因的缺失降低了嗜铁素产量,抑制了菌体的生长以及对胁迫因子的抗性,sidA基因是影响棘孢木霉嗜铁素产生的关键基因之一。

关键词：棘孢木霉 sidA基因基因敲除表型分析

北京棒杆菌芳香族氨基酸转运蛋白基因敲除对L-色氨酸积累的影响

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微生物学报 2012年第11期52卷 1344-1351页

作者：马温华赵智王宇张英姿丁久元中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院研究生院北京100049

【目的】为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲... 详细信息

【目的】为了减少北京棒杆菌PD-67(Corynebacterium pekinense PD-67)从细胞外吸收色氨酸,降低细胞内色氨酸库的浓度,从而使色氨酸的反馈控制作用减弱,增加胞外L-色氨酸的积累量,构建北京棒杆菌PD-67的芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP敲除的菌株,研究aroP基因敲除对菌株L-色氨酸积累的影响。并进一步研究在aroP敲除菌株中表达邻氨基苯甲酸合成酶(AS)基因对L-色氨酸积累的影响。【方法】运用PCR技术扩增aroP基因,与整合质粒连接后,用限制性内切酶法构建带有内部片段缺失的aroP基因的敲除载体。利用同源重组技术,敲除北京棒杆菌PD-67的aroP基因,构建菌株PD-67ΔaroP,并用带有aroP基因的表达载体对PD-67ΔaroP进行互补验证。采用PCR技术扩增AS基因,与表达载体连接构建重组质粒。将重组质粒转入菌株PD-67ΔaroP,构建工程菌株PD-67ΔaroP/pXAS。通过摇瓶发酵研究PD-67ΔaroP和PD-67ΔaroP/pXAS的发酵特性。【结果】经PCR验证获得了aroP基因缺陷的菌株。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,PD-67ΔaroP的L-色氨酸的积累量提高了65%。酶活分析结果表明,AS基因在菌株PD-67ΔaroP中得到表达。AS基因表达使工程菌单位菌体产酸率提高了25.6%。【结论】北京棒杆菌PD-67中芳香族氨基酸转运蛋白基因aroP的敲除能够提高胞外L-色氨酸的积累量。在aroP基因敲除菌中表达AS基因,可以进一步提高工程菌的产酸率。

关键词：谷氨酸棒杆菌转运蛋白基因敲除 L-色氨酸

利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系

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第二军医大学学报 2020年第5期41卷 513-519页

作者：袁媛张冠宇孙平新章越凡李铁军李文林安徽中医药大学研究生院药学系合肥230012 海军军医大学(第二军医大学)药学院药理学教研室上海200433 海军军医大学(第二军医大学)基础医学院细胞生物学教研室上海200433

目的采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建叉头框G1(FOXG1)基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个... 详细信息

目的采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建叉头框G1(FOXG1)基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA(gRNA)诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6(PAX6)、性别决定区Y框蛋白2(SOX2)和正小齿同源物2(OTX2)的表达。结果利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。

关键词： CRISPR/Cas9基因编辑叉头框蛋白G1 基因敲除人胚胎干细胞

甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化DNA双片段的基因敲除方法的建立

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菌物学报 2020年第12期39卷 2314-2327页

作者：蔡恩平梅丹张小萌孙贤李玲玉吴熔熔邓懿祯姜子德常长青华南农业大学植物保护学院广东广州510642 华南农业大学群体微生物研究中心广东省微生物信号与病害防控重点实验室广东广州510642

由甘蔗鞭孢堆黑粉菌Sporisoriumscitamineum引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生产的主要病害,严重影响了甘蔗的产量和品质,然而其分子致病机制报道很少,极大地影响了有效防控技术的开发。为了提高该病菌基因功能的研究效率,本研究以甘蔗鞭孢堆黑... 详细信息

由甘蔗鞭孢堆黑粉菌Sporisoriumscitamineum引起的甘蔗黑穗病是甘蔗生产的主要病害,严重影响了甘蔗的产量和品质,然而其分子致病机制报道很少,极大地影响了有效防控技术的开发。为了提高该病菌基因功能的研究效率,本研究以甘蔗鞭孢堆黑粉菌有性配合两个关键基因SsGPA3和SsPRF1为目标,建立了基于DNA双片段的甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体转化基因敲除技术体系。结果表明甘蔗鞭孢堆黑粉菌单倍体细胞生长期在OD600约为0.7,28℃下10mg/mL细胞壁裂解酶作用30min获得的原生质体产率最高,再生率最优;使用线性DNA双片段转化获得阳性转化子的成功率达90%以上,显著高于线性DNA单片段和质粒。本方法的建立将极大地提高甘蔗鞭孢堆黑粉菌的基因敲除效率,同时也为其他真菌的基因敲除提供借鉴。

关键词：甘蔗鞭孢堆黑粉菌原生质体基因敲除同源重组

利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建肺部EZH2基因敲除小鼠

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中国肺癌杂志 2018年第5期21卷 358-364页

作者：孟凡荣赵丹周清华刘喆天津医科大学总医院、天津市肺癌研究所、天津市肺癌转移与肿瘤微环境实验室天津300052 天津医科大学天津300070

背景与目的已有的研究证明CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)系统是一种能够在哺乳动物细胞中高效操作的新型基因编辑技术,应用人工设计的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)介导外源表达的Cas9蛋白与靶点DNA特异性结合以实现对基因组DNA的切割,被切割后的基因组DNA通过非同源重组或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、或者外源基因的敲入等目标。本研究的目的是应用CRISPR/Cas9技术构建小鼠肺部EZH2基因敲除的动物模型。方法针对EZH2基因的编码区,设计两个靶向EZH2基因Exon3和Exon4的sgRNA,通过慢病毒包装、感染细胞、SURVEYOR assay等一系列体外实验,验证所设计的sgRNA的有效性。应用支气管插管的方式把慢病毒灌注到小鼠肺部,利用免疫组化方法和qRT-PCR进行检测。结果 NIH-3T3细胞的体外实验结果验证了实验所设计的sgEZH2能够有效地在体外细胞系中介导Cas9切割靶DNA;小鼠支气管插管实验及肺部组织免疫组化和qRT-PCR方法检测EZH2基因敲除的效率,发现实验组小鼠肺部组织EZH2表达明显降低。结论本研究成功设计了两条能够敲除EZH2功能的sgRNA,并应用CRISPR/Cas9技术成功建立了肺部EZH2基因敲除的小鼠模型,为研究EZH2的功能和作用机制提供了有效的动物模型。

关键词： CRISPR/Cas9系统 EZH2 sgRNA 基因敲除

一种基于线性DNA片段同源重组的嗜盐古菌高效基因敲除系统

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遗传 2015年第4期37卷 388-395页

作者：王小利姜闯刘建华刘喜朋上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。嗜盐古菌Haloferax volcanii易于培养,是研究古菌基因功能的良好模式菌株。虽然现已开发了多种嗜盐古菌的遗传操作系统,但基因敲除成功率不十分理想。这... 详细信息

随着功能基因组学研究的深入发展,基因敲除技术日益成为基因功能研究的重要手段。嗜盐古菌Haloferax volcanii易于培养,是研究古菌基因功能的良好模式菌株。虽然现已开发了多种嗜盐古菌的遗传操作系统,但基因敲除成功率不十分理想。这些遗传操作方法基于pyr E筛选标记,利用携带同源片段的环状质粒与基因组同源片段间的两次同源重组,敲除目的基因。由于基于环状质粒和pyr E筛选标记的经典同源重组敲除方法在二次重组时,普遍存在回复到野生型菌株的可能,导致二次重组子中敲除目的基因的阳性菌株比例较低。为了克服传统同源重组技术的上述缺陷,文章建立了基于线性DNA片段的同源重组技术。该方法通过一次重组在目标基因的下游引入一段上游同源片段和pyr E标记,从而限定二次重组的发生部位只能在两段上游同源片段之间,发生二次重组的重组子理论上都敲除了目标基因。利用该方法,文章成功敲除了嗜盐古菌Haloferax volcanii的xpd2基因,阳性克隆率达65%。这种线性DNA片段重组法为嗜盐古菌的基因敲除提供了一种高效策略,便于嗜盐古菌的基因改造。

关键词：嗜盐古菌基因敲除同源重组线性DNA重组

γ-谷氨酰激酶基因敲除对产L-精氨酸钝齿棒杆菌8-193生理代谢的影响

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微生物学报 2011年第11期51卷 1476-1484页

作者：李小曼赵智张英姿王宇丁久元中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院研究生院北京100049

【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶(EC:2.***.2.11,γ-glutamyl kinase)基因proB敲除的菌株,并研究proB基因敲... 详细信息

【目的】为了阻断L-精氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-精氨酸合成的代谢流,构建钝齿棒杆菌8-193(Corynebacterium crenatum 8-193)γ-谷氨酰激酶(EC:2.***.2.11,γ-glutamyl kinase)基因proB敲除的菌株,并研究proB基因敲除对菌株生理特性的影响。【方法】运用PCR技术分别扩增proB基因的上游和下游序列,构建带有内部缺失的proB基因的敲除载体。经过两次同源重组,敲除*** 8-193的proB基因,构建菌株8-193-ΔproB,并用带有proB基因的表达载体对8-193-ΔproB进行互补验证。通过摇瓶发酵研究8-193-ΔproB的生理特性。【结果】PCR验证、γ-谷氨酰激酶酶活测定和营养缺陷型鉴定表明,获得了proB基因缺陷的菌株。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株相比,8-193-ΔproB生物量降低9.6%,L-精氨酸产量提高13.6%。副产物中谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸含量升高;α-酮戊二酸、磷酸烯醇式丙酮酸和琥珀酸含量降低。proB基因敲除后,菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶活性提高。【结论】对谷氨酸分支代谢途径的阻断可以改善8-193菌株的葡萄糖利用和精氨酸合成能力。

关键词：钝齿棒杆菌 γ-谷氨酰激酶基因敲除 L-精氨酸

α7nAChR基因敲除HIV-1gp120转基因小鼠模型的构建

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南方医科大学学报 2020年第8期40卷 1184-1191页

作者：胡彤彤龚泽龙万宇李煜彬高雪锋伦静娴黄胜和曹虹南方医科大学公共卫生学院//广东省热带病研究重点实验室微生物学系广东广州510515 南加州大学洛杉矶儿童医院洛杉矶90027

目的通过构建双基因编辑小鼠模型(α7R-/-/gp120+),为探索α7乙酰胆碱受体(α7 nAChR)介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供研究基础。方法α7 nAChR基因敲除小鼠(α7R-/-)与HIV-1 gp120转基因小鼠(gp120+)杂交(F0),从产生的F1小鼠中... 详细信息

目的通过构建双基因编辑小鼠模型(α7R-/-/gp120+),为探索α7乙酰胆碱受体(α7 nAChR)介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供研究基础。方法α7 nAChR基因敲除小鼠(α7R-/-)与HIV-1 gp120转基因小鼠(gp120+)杂交(F0),从产生的F1小鼠中,选取基因型为α7R+/-/gp120+的小鼠进一步交配,得到F2小鼠。PCR法鉴定和筛选F3小鼠基因型,免疫组化分析双转基因动物模型蛋白表达;体外实验使用gp120蛋白和α7 nAChR抑制剂处理小胶质细胞,ELISA检测各组IL-1β与TNF-α表达情况。结果F3小鼠的PCR结果符合预期,其中有2只双基因编辑成功的小鼠。免疫组化结果显示双基因编辑小鼠(α7R-/-/gp120+)的脑组织缺乏α7 nAChR的同时高表达gp120蛋白。体外实验结果表明Gp120可促进小胶质细胞分泌IL-1β与TNF-α,而抑制α7nAChR后IL-1β与TNF-α表达明显降低(P基因修饰小鼠成功构建,且具有稳定遗传的特点,可为后续探索α7 nAChR介导gp120中枢神经毒性的作用和机制提供重要的动物模型。

关键词： α7烟碱型乙酰胆碱受体 HIV-1 gp120 基因敲除转基因小鼠