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肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD的基因敲除、表达及酶学特征

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微生物学报 2016年第8期56卷 1282-1290页

作者：郭荣显朱姗姗焦扬安树敏薛颖费晓耿士忠潘志明焦新安扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

【目的】以肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD为对象,构建基因缺失株及表达纯化该蛋白,为研究其在肠炎沙门菌致病性与应激等方面的作用奠定基础。【方法】参考Gen Bank登录的肠炎沙门菌基因组序列设计用于slyD基因敲除及原核表达的特异... 详细信息

【目的】以肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD为对象,构建基因缺失株及表达纯化该蛋白,为研究其在肠炎沙门菌致病性与应激等方面的作用奠定基础。【方法】参考Gen Bank登录的肠炎沙门菌基因组序列设计用于slyD基因敲除及原核表达的特异引物,运用自杀质粒介导的同源重组技术对肠炎沙门菌C50041 slyD基因进行敲除,构建C50041ΔslyD缺失株;原核表达SlyD蛋白,通过α-糜蛋白酶耦联法对其PPIase活性进行测定;利用生物信息学相关软件,分析SlyD蛋白的氨基酸序列及功能域。【结果】PCR鉴定与测序结果证明成功构建了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株,其生长特性与野生株基本一致;SDS-PAGE及PPIase活性分析表明,获得了具有生物活性的可溶性SlyD蛋白;生物信息学分析显示SlyD蛋白由FKBP样肽脯氨酰顺反异构酶结构域、分子伴侣功能域和金属结合区域3个功能区域组成。【结论】成功获得了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株和具有PPIase活性的重组SlyD蛋白。

关键词：肠炎沙门菌 SlyD蛋白基因敲除肽脯氨酰顺反异构酶

p53凋亡刺激蛋白2基因敲除小鼠的构建及其对二乙基亚硝胺诱导肝癌的影响

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中华肝脏病杂志 2020年第9期28卷 784-789页

作者：刘晓霓寇卜心柴梦音陈德喜首都医科大学附属北京佑安医院北京市肝病研究所 100069

目的构建p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因敲除小鼠,用该小鼠建立二乙基亚硝胺(DEN)诱导的肝癌模型以研究ASPP2的生物学功能。方法构建单链向导RNA寡聚核苷酸,用CRISPR/Cas9系统制备ASPP2基因敲除小鼠。采用PCR法和测序方法鉴定F0、F1代及... 详细信息

目的构建p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)基因敲除小鼠,用该小鼠建立二乙基亚硝胺(DEN)诱导的肝癌模型以研究ASPP2的生物学功能。方法构建单链向导RNA寡聚核苷酸,用CRISPR/Cas9系统制备ASPP2基因敲除小鼠。采用PCR法和测序方法鉴定F0、F1代及其子代的基因型。用DEN诱导ASPP2+/-小鼠建立肝癌模型。结果PCR和测序结果表明F0代小鼠ASPP2基因敲除成功;F1代小鼠基因型符合ASPP2+/-,获得稳定遗传性;F1代自杂交获得ASPP2+/-小鼠DEN诱导的肝癌模型成功率(7/8与3/8)明显高于野生型。结论基于CRISPR/Cas9系统成功构建ASPP2基因敲除小鼠,ASPP2基因敲除小鼠DEN诱导的肝癌模型成功率明显高于野生型。

关键词：肝细胞癌 p53凋亡刺激蛋白2 基因敲除 CRISPR/Cas9系统二乙基亚硝胺

基于Cfku70基因失活策略构建果生刺盘孢的高效基因敲除底盘菌株

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菌物学报 2022年第8期41卷 1185-1198页

作者：田欢焕杨文睿张兆辉姚立强张荣孙广宇梁晓飞西北农林科技大学植物保护学院陕西杨凌712100

果生刺盘孢侵染危害多种植物,是重要的植物病原真菌。在一些丝状真菌中,敲除非同源末端连接修复通路的关键基因ku70或ku80可显著提高同源重组效率,进而提高靶基因置换频率。本研究从果生刺盘孢基因组鉴定到Cfku70和Cfku80两个基因,并明... 详细信息

果生刺盘孢侵染危害多种植物,是重要的植物病原真菌。在一些丝状真菌中,敲除非同源末端连接修复通路的关键基因ku70或ku80可显著提高同源重组效率,进而提高靶基因置换频率。本研究从果生刺盘孢基因组鉴定到Cfku70和Cfku80两个基因,并明确了基因失活对菌株生物学表型和基因敲除效率的影响。敲除Cfku70或Cfku80不影响菌株的菌落形态、营养生长、产孢、分生孢子萌发、侵染结构发育和致病;Cfku70基因敲除还大幅提升3个测试基因的敲除效率。本研究证实Cfku70基因失活能显著提高果生刺盘孢的基因敲除效率,适宜作为高效基因敲除的底盘菌株,研究结果为通过批量敲除策略筛选新型致病因子奠定重要基础。

关键词：果生刺盘孢同源重组基因敲除致病

烟草“8306”NtCPS2基因敲除及叶面化学成分改良

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中国烟草学报 2020年第6期26卷 74-80页

作者：李旖梅王召军闫筱筱张洪映李雪君孙计平黄明月崔红河南农业大学烟草学院郑州市450002 河南省农业科学院烟草研究所河南省许昌市461000 四川中烟工业有限责任公司长城雪茄厂四川省德阳市618400

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致... 详细信息

8306是重要的高香气烤烟育种材料,因其腺毛分泌物中含有赖百当化合物而使其杂交后代具有晾晒烟香气特征。为此,本研究利用CRISPR/Cas9技术,对8306中赖百当生物合成途径的关键酶基因NtCPS2进行敲除,获得了gRNA区发生单碱基插入突变导致翻译提前终止的纯合突变体8306-1。与8306相比,该突变株系生长发育正常,腺毛类型和腺毛密度无显著变化;利用GC-MS技术对叶面化学成分进行检测,在8306-1中并未发现8306中所含有的顺冷杉醇和赖百当二醇等赖百当类化合物,而腺毛分泌物的其他主要成分,如西柏三烯一醇、西柏三烯二醇及蔗糖酯的含量与对照相比并无明显变化;RT-PCR检测分析显示,8306-1与8306中MEP途径及二萜生物合成途径的关键基因,如NtDXS、NtDXR、NtCMS、NtGPPS、NtGGPPS、NtCYC、NtCYP71D16等在转录水平上的表达均无明显差异。该研究结果表明,NtCPS2基因敲除能有效降低烟草赖百当类二萜化合物的含量,而对叶面其他化学成分及类萜途径基因表达无明显影响。因此,NtCPS2基因是进行烟草叶面化学成分定向改良的理想靶点,对烤烟高香气育种具有重要意义。

关键词：烟草 8306 赖百当二萜 NtCPS2 基因敲除

四连接素基因敲除小鼠表现出脊柱后凸畸形和骨质疏松症的特征

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复旦学报（医学版） 2016年第2期43卷 159-163,169页

作者：茹德文颜玉峰李炳谢强汤日沈晓余果杜嘉瑞王尔松复旦大学附属金山医院神经外科上海201508 复旦大学附属金山医院中心实验室上海201508

目的研究四连接素(tetranectin,TN)基因敲除对小鼠骨骼生长发育的影响,从而探究该基因的正常生理功能及其缺失与疾病的关系。方法通过基因同源重组的方法构建出TN基因敲除(TN^(-/-))小鼠模型,分别对2月龄和8月龄的TN^(-/-)雄性小鼠(n=10... 详细信息

目的研究四连接素(tetranectin,TN)基因敲除对小鼠骨骼生长发育的影响,从而探究该基因的正常生理功能及其缺失与疾病的关系。方法通过基因同源重组的方法构建出TN基因敲除(TN^(-/-))小鼠模型,分别对2月龄和8月龄的TN^(-/-)雄性小鼠(n=10)和同龄野生型(wild-type,WT)雄性小鼠(n=10)进行全身正侧位X线摄片和脊柱后凸角度(Cobb角)测量,并对8月龄TN^(-/-)雄性小鼠(n=10)和WT雄性小鼠(n=10)的多部位骨骼进行骨密度(bone mineral density,BMD)及骨矿含量(bone mineral content,BMC)测定和病理切片检查,所得数据进行统计学分析。结果TN^(-/-)小鼠与同龄WT小鼠体质量无明显差异;2月龄及8月龄TN^(-/-)小鼠Cobb角均较同龄WT小鼠显著增大(P<0.01),且随月龄增加,Cobb角显著增大(P<0.01);8月龄TN^(-/-)小鼠的胸椎椎间盘结构不对称,外侧纤维环呈增大、疏松改变;与同龄WT小鼠相比,8月龄TN^(-/-)小鼠全身、腰3椎体和左侧股骨BMD及BMC显著降低(P<0.05),股骨及腰椎在组织学上也呈现出骨小梁变细、稀疏、排列紊乱或断裂等特点,且骨小梁成骨细胞减少,破骨细胞增多。结论TN^(-/-)小鼠表现出脊柱后凸畸形和骨质疏松症的特征,提示TN与骨骼的正常生长发育关系密切。TN^(-/-)小鼠作为一种潜在的脊柱后凸畸形或骨质疏松症疾病动物模型具有重大的研究意义。

关键词：四连接素基因敲除脊柱后凸畸形骨质疏松症小鼠

α7-nAChR基因敲除小鼠海马神经元突触传递和神经网络的电生理表型（英文）

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生理学报 2019年第2期71卷 261-270页

作者：郑超高凌云张环环查盈盈汪萌芽皖南医学院细胞电生理研究室芜湖241002

研究显示,含有α7亚基的烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)基因敲除(α7 KO)的小鼠表现出很少的功能表型。本文旨在研究α7 KO对小鼠海马电生理特征的影响。用标准胞外场电位记录评估α7 KO对小鼠海... 详细信息

研究显示,含有α7亚基的烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7-nAChR)基因敲除(α7 KO)的小鼠表现出很少的功能表型。本文旨在研究α7 KO对小鼠海马电生理特征的影响。用标准胞外场电位记录评估α7 KO对小鼠海马CA3-CA1突触传递的影响,用穿孔膜片钳记录检测小鼠海马单个神经元γ-氨基丁酸A型受体(γ-aminobutyric acid A-type receptor, GABA_A-R)的电生理学表型。结果显示,与野生型小鼠相比,α7 KO小鼠海马CA1神经元场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)斜率显著降低,卡巴胆碱诱发的θ振荡显著减少。在给予GABA_A-R激动剂蝇覃醇(muscimol)条件下,与野生型小鼠相比,α7 KO小鼠海马CA1和CA3神经元I–V曲线均向去极化方向明显移动。以上结果提示,α7KO小鼠海马CA3-CA1突触传递显著受损,GABA_A-R成熟显著延迟,表明α7-nAChR基因缺失可显著改变海马的电生理功能,这可能为α7-nAChR在海马功能和海马相关疾病中作用的理解提供了新的认识。

关键词：海马烟碱型乙酰胆碱受体基因敲除发育突触传递神经振荡

miR-29a基因敲除对C57BL/6小鼠肾小球结构和功能的影响

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中国病理生理杂志 2022年第5期38卷 884-892页

作者：李慧王鑫王向东李莉于小玲巩永凤青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系山东青岛266073 滨州医学院基础医学院生理学系山东烟台264000

目的:观察微小RNA-29a(miR-29a)基因敲除对小鼠肾小球功能和结构的影响。方法:应用CRISPR/Cas9技术,选择C57BL/6 miR-29a基因敲除型(miR-29a knockout,miR-29a KO)小鼠作为实验组,未敲除型小鼠作为野生型(wild-type,WT)对照组(n=30)。分别在第3、12和24周收集小鼠24 h尿液。采用考马斯亮蓝染色法进行尿蛋白测定;ELISA测定尿白蛋白和尿肌酐水平,并计算尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ra‐tio,UACR)。选取3、12和24周的小鼠,采用过碘酸雪夫氏(periodic acid-schiff,PAS)染色法观察肾脏组织的病理变化;通过透射电镜以及冷冻蚀刻电镜观察肾小球超微结构。另取2组24周的小鼠,一组小鼠腹腔麻醉后用Dyna‐beads™M-450 Tosylactivated微磁珠经心脏灌流后分离肾小球,用于RNA和蛋白的提取;另一组小鼠肾脏用于免疫荧光染色。采用RT-qPCR、免疫荧光染色以及Western blot检测小鼠肾小球足细胞标志性蛋白nephrin和podocin以及肾小球IV型胶原(COL4α3、COL4α4和COL4α5)和层粘连蛋白β2(lamininβ2,LAMB2)的表达。结果:考马斯亮蓝染色法实验结果显示,miR-29a KO组小鼠出现尿白蛋白,WT组小鼠无蛋白尿。UACR结果显示3周时,miR-29a KO组与WT组相比,数据无统计学差异;12周时,miR-29a KO组的UACR比值与WT组相比显著增高(P基因敲除会导致小鼠出现蛋白尿、肾小球损伤及纤维化,随着小鼠的老龄化损伤程度加重。

关键词：微小RNA-29a 基因敲除蛋白尿纤维化

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稻瘟菌MgORP1基因敲除突变株的构建及其表型分析

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微生物学报 2008年第9期48卷 1160-1167页

作者：林春花郑服丛海南大学环境与植物保护学院

【目的】了解稻瘟病菌中氧固醇结合蛋白(oxysterol-binding proteins related proteins,缩写为ORPs)家族成员组成情况,构建MgORP1基因缺失突变株和互补株,对MgORP1基因功能进行初步研究。【方法】以ORPs家族的典型结构域"ORD"为靶标,对... 详细信息

【目的】了解稻瘟病菌中氧固醇结合蛋白(oxysterol-binding proteins related proteins,缩写为ORPs)家族成员组成情况,构建MgORP1基因缺失突变株和互补株,对MgORP1基因功能进行初步研究。【方法】以ORPs家族的典型结构域"ORD"为靶标,对稻瘟病菌基因组数据库进行BlastP搜索。通过同源重组的策略,构建MgORP1基因缺失突变体,再通过重新导入该基因全长片段获得互补株。然后对野生型、突变体和互补株进行菌落、分生孢子和附着胞形态或形成情况、以及致病力进行比较分析。【结果】稻瘟病菌基因组中含有6个可能的ORPs族蛋白,其中MgORP1基因的破坏降低了稻瘟菌在完全培养基上的菌落生长速率和产孢量。但对菌丝、分生孢子和附着胞的形态,以及在水稻上的致病力没有明显影响。【结论】MgORP1基因可能与稻瘟病菌的菌落生长和产孢量相关。

关键词：稻瘟菌固醇氧固醇结合蛋白基因敲除

MG53基因敲除对小鼠延迟性肌肉酸痛期骨骼肌损伤的影响

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中国康复医学杂志 2017年第6期32卷 636-642页

作者：吴迎伊木清曾凡星北京体育大学运动人体科学学院北京100084 国家体育总局运动医学研究所

目的:探讨MG53敲除对骨骼肌损伤的影响,研究MG53在延迟性肌肉酸痛期是否具有减轻骨骼肌膜损伤的作用。方法:8周龄雄性C57小鼠84只,根据基因型分为两大组,野生型(WT)组和敲除型(KO)组,每一大组按照取材时间点又分为7个小组,共14组,即WT组... 详细信息

目的:探讨MG53敲除对骨骼肌损伤的影响,研究MG53在延迟性肌肉酸痛期是否具有减轻骨骼肌膜损伤的作用。方法:8周龄雄性C57小鼠84只,根据基因型分为两大组,野生型(WT)组和敲除型(KO)组,每一大组按照取材时间点又分为7个小组,共14组,即WT组(WC、WE0、WE2、WE12、WE24、WE48、WE72)和KO组(KC、KE0、KE2、KE12、KE24、KE48、KE72),每组6只。在离心运动后相应时间点内眦取血,脱颈处死小鼠,取左腿股直肌用于Western blot实验,右侧用于形态学观察。全自动生化分析仪检测血清肌酸激酶(CK),透射电镜观察14个组大鼠骨骼肌超微结构的变化,Western blot检测MG53蛋白水平。结果:KE0和KE2组CK较安静组非常显著性升高(P<0.01),KE24和WE0组CK较安静组显著升高(P<0.05),同一时间点CK值相比,KE0较WE0显著升高,KE24较WE24显著升高(P<0.05);骨骼肌超微结构随时程变化较为明显,KO组在运动后损伤较WT组更为严重,呈现出损伤早、恢复慢的特点,KE24损伤最为严重,且KE72仍然没有恢复到安静水平;WT组MG53蛋白在运动后即刻达到峰值并显著高于安静组(P<0.05),在24h出现第二次升高(P<0.05)。结论:离心运动后KO组小鼠骨骼肌损伤较WT组更为严重,表明MG53能够明显减轻骨骼肌在延迟性肌肉酸痛期的损伤,WT组MG53蛋白在离心运动后即刻和24h显著升高,提示其在延迟性肌肉酸痛期骨骼肌损伤的修复中发挥了重要作用。

关键词：基因敲除延迟性肌肉酸痛骨骼肌损伤