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CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究

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华南农业大学学报 2023年第3期44卷 333-339页

作者：张健吴珍芳杨化强岭南现代农业科学与技术广东省实验室云浮分中心/广东中芯种业科技有限公司广东云浮527400

[目的]运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大... 详细信息

[目的]运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout,CD163-KO)的克隆猪,验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性,并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别,评估CD163-KO大白猪的主要生产性能。[方法]用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株NADC30-like对本研究所获得的11头CD163-KO大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。连续14 d观察猪的临床症状,记录直肠温度变化,检测血清中PRRSV病毒含量和抗体水平。14 d后取肺部组织进行切片,通过PRRSV免疫荧光试验观察肺脏感染情况。采集CD163-KO和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色,观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况;采集猪外周血单核细胞进行诱导分化,观察CD163-KO与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白-结合珠蛋白复合物的摄取情况。最后,统计分析CD163-KO与野生型大白猪的生产性能及公猪的繁殖性能。[结果]本研究获得的CD163-KO大白猪对蓝耳病NADC30-like毒株具有完全抗性,敲除CD163基因不影响巨噬细胞的生理功能,CD163-KO与野生型大白猪的生长性能和繁殖性能无明显差异。[结论]本研究是对CD163-KO猪抵抗蓝耳病的又一佐证和补充,证明CD163基因敲除操作对生产性能没有潜在的负面影响,为抗蓝耳病猪的生物安全提供了支撑。

关键词： CD163 基因敲除大白猪 PRRSV 类NADC30毒株抗病育种生物安全评价

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基因敲除技术在精子发生相关基因功能研究中的应用

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中华男科学杂志 2014年第9期20卷 850-853页

作者：丁小举王朝亮张卫星王瑞郑州大学第一附属医院泌尿外科河南郑州450052

从基因水平研究男性不育症发病机理将有助于发现男性不育治疗的新途径。基因敲除技术是目前研究基因功能的主流方法。筛选鉴定精子发生过程中相关基因,探索其特性和功能,对了解睾丸功能、探索男科疾病新的治疗靶点具有重要意义。本文概... 详细信息

从基因水平研究男性不育症发病机理将有助于发现男性不育治疗的新途径。基因敲除技术是目前研究基因功能的主流方法。筛选鉴定精子发生过程中相关基因,探索其特性和功能,对了解睾丸功能、探索男科疾病新的治疗靶点具有重要意义。本文概述基因敲除技术在精子发生相关基因功能研究中的应用。

关键词：基因敲除精子发生男性不育

用ZBED6基因敲除猪研究心脏发育的分子机制

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中国农业科学 2018年第7期51卷 1390-1400页

作者：王丹丹唐雨婷马月辉王立刚潘登科蒋琳中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨ZBED6在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪(ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪(ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6... 详细信息

【目的】ZBED6基因是一个调控肌肉生长发育的转录因子,为了探讨ZBED6在心肌生长发育中的调控机制,利用RNA Sequencing(RNA-Seq)技术比较ZBED6基因敲除巴马小型猪(ZBED6-KO)和同日龄正常巴马小型猪(ZBED6-WT)的心脏组织转录组,挖掘ZBED6基因的敲除对家猪心脏组织发育及基因表达的影响。【方法】利用t-test对ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织大小的表型特征进行显著性分析,利用实时荧光定量PCR对ZBED6基因的靶基因IGF2的表达量进行定量。通过制作石蜡组织切片对心肌进行组织学分析,比较其组织结构的差异。提取ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织的总RNA,以Illumina Hiseq 2000平台进行RNA-Seq分析。以猪Suscrofa10.2为参考序列,用转录组的标准流程筛选ZBED6-KO猪和ZBED6-WT猪心脏组织中的差异表达基因,对差异基因进行GO和IPA富集分析。随机选择9个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】ZBED6-KO猪心脏重以及IGF2表达量均显著高于ZBED6-WT猪(P基因的敲除对家猪心脏的生长发育有一定的促进作用;测序结果显示,各样本获得至少10 G的数据量,每个样本clean ratio、Q30 data均达到90%以上,其中62.8%-80.1%的reads能比对到猪的基因组上,表明测序饱和度良好,测序数据真实可靠;对测序数据进行分析,筛选到184个差异基因,其中上调的基因114个,下调的基因70个,注释的141个,未注释的43个;差异基因层次聚类分析显示,ZBED6-KO组(x1、x3、x6)的3个个体表达模式相似,ZBED6-WT组(x2、x4、x5)的3个个体表达模式相似;GO和IPA富集分析得到13个显著的GO条目,33条显著的pathway通路,差异基因主要富集在免疫反应、肌肉发育和Rho A信号等相关的通路;q RT-PCR检测9个差异表达基因的表达模式与RNA-Seq分析结果一致,证实了RNA-Seq结果的可靠性。【结论】首次以ZBED6-KO巴马小型猪为模型,利用RNA-Seq技术探究了ZBED6敲除对心脏发育和功能的影响,丰富了ZBED6对心脏发育和功能的研究。

关键词： ZBED6 基因敲除 RNA-Seq 心肌发育差异表达基因

大肠杆菌酪氨酸转运系统基因敲除对酪氨酸生产的影响

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生物工程学报 2019年第7期35卷 1247-1255页

作者：王钦曾伟主周景文江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室江苏无锡214122 江南大学生物工程学院江苏无锡214122

酪氨酸是三大芳香族氨基酸之一,广泛用于食品、医药和化工等领域。转运系统工程为代谢工程改造大肠杆菌选育酪氨酸生产菌株提供了一种重要的研究策略。大肠杆菌中酪氨酸胞内转运主要通过aroP和tyrP基因编码的通透酶进行调控。以酪氨酸... 详细信息

酪氨酸是三大芳香族氨基酸之一,广泛用于食品、医药和化工等领域。转运系统工程为代谢工程改造大肠杆菌选育酪氨酸生产菌株提供了一种重要的研究策略。大肠杆菌中酪氨酸胞内转运主要通过aroP和tyrP基因编码的通透酶进行调控。以酪氨酸生产菌株HGXP为出发菌株,利用CRISPR-Cas9技术成功构建了aroP和tyrP基因敲除菌,并通过发酵试验考察了调节转运系统对酪氨酸生产的影响。发酵结果表明,aroP和tyrP基因敲除菌酪氨酸产量分别达到3.74 g/L和3.45 g/L,较出发菌株酪氨酸产量分别提高了19%和10%。对诱导温度进行了优化,结果表明38℃为最佳诱导温度。在3 L发酵罐上进行了补料分批发酵,aroP和tyrP基因敲除菌酪氨酸产量进一步提高至44.5 g/L和35.1 g/L,较出发菌株酪氨酸产量分别提高了57%和24%。研究结果对代谢工程强化大肠杆菌生产酪氨酸具有重要的参考价值。

关键词：大肠杆菌 L-酪氨酸转运系统基因敲除

吸水链霉菌HS023 milF基因敲除构建产5-酮米尔贝霉素基因工程菌

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微生物学报 2015年第1期55卷 107-113页

作者：黄隽林甲檀周敏白骅浙江海正药业股份有限公司浙江台州318000

【目的】通过敲除吸水链霉菌HS023的mil F基因,构建产5-酮米尔贝霉素的基因工程菌。【方法】构建mil F基因敲除质粒p MSST-Δmil F,转入米尔贝霉素产生菌——吸水链霉菌HS023,获得mil F基因敲除的双交换突变株F2-18。【结果】发酵结果表... 详细信息

【目的】通过敲除吸水链霉菌HS023的mil F基因,构建产5-酮米尔贝霉素的基因工程菌。【方法】构建mil F基因敲除质粒p MSST-Δmil F,转入米尔贝霉素产生菌——吸水链霉菌HS023,获得mil F基因敲除的双交换突变株F2-18。【结果】发酵结果表明:mil F基因敲除突变株F2-18不再产生米尔贝霉素,仅产生中间产物5-酮米尔贝霉素,且发酵单位较出发菌株略有提升。【结论】通过敲除mil F基因,发酵可生产5-酮米尔贝霉素,并直接用于驱虫药米尔贝肟和乐平霉素的化学合成,可大大简化从米尔贝霉素到米尔贝肟和乐平霉素的合成步骤。

关键词：吸水链霉菌基因milF 基因敲除 5-酮米尔贝霉素

α1,3半乳糖转移酶基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪心、肺解剖学与组织学的比较

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解剖学报 2016年第4期47卷 510-515页

作者：韩晓娜曾国敏杨阳潘登科杜晓华甘肃农业大学动物医学院兰州730070 甘肃农业大学生命科学技术学院兰州730070 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室北京100193

目的探讨α1,3半乳糖转移酶(GGTA1)基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪心、肺解剖学与组织学发育变化的异同。方法选取GGTA1基因敲除巴马克隆猪2头(BM164和BM155)及核供体巴马猪1头(BMM2),利用大体解剖学和常规石蜡切片HE染色技术,对其... 详细信息

目的探讨α1,3半乳糖转移酶(GGTA1)基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪心、肺解剖学与组织学发育变化的异同。方法选取GGTA1基因敲除巴马克隆猪2头(BM164和BM155)及核供体巴马猪1头(BMM2),利用大体解剖学和常规石蜡切片HE染色技术,对其心脏和肺脏进行解剖学与组织学比较研究。结果核供体成年健康巴马猪心脏呈倒置圆锥形,前缘凸,后缘短而直,心表面冠状沟和左右纵沟清晰可见;心壁结构完整,可分3层,心内膜较薄,心室内膜下有较多浦肯耶纤维,心肌排列紧密,横纹清晰,闰盘少且不清楚,心外膜较厚,无髓神经纤维明显。GGTA1基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪相比较,心脏在解剖学与组织学构造上均未见明显差异。核供体成年健康巴马猪肺脏呈粉红色海绵状,质软而轻,富有弹性;肺脏小支气管软骨丰富,黏膜下层内气管腺明显,可见炎性细胞,细支气管黏膜皱褶呈指状向管腔凸起,周围有炎性细胞浸润,肺泡大小较一致,肺泡壁较厚,尘细胞少见。GGTA1基因敲除巴马克隆猪肺脏解剖学与组织学结构与核供体巴马猪基本一致。结论 GGTA1基因敲除巴马克隆猪与核供体巴马猪心、肺解剖学构造无明显差异,组织学结构正常,心、肺发育良好。

关键词： α1,3半乳糖转移酶基因基因敲除克隆心脏肺脏大体解剖学 HE染色巴马猪

Mafb基因敲除小鼠的构建及其尿道下裂表型初步分析

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海军军医大学学报 2022年第2期43卷 152-159页

作者：刘振忞孔晓燕沈炼桔龙春兰刘星魏光辉重庆医科大学附属儿童医院儿童泌尿生殖发育与组织工程重庆市重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿科学重庆市重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿童发育疾病研究教育部重点实验室重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院泌尿外科重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地重庆400014 重庆医科大学附属儿童医院国家儿童健康与疾病临床医学研究中心重庆400014

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白9(Cas9)构建v-maf肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物B(Mafb)基因敲除小鼠,初步研究该基因缺失对尿道发育的影响。方法根据CRISPR/Cas9技术原理构建Mafb基因敲除F0代C57BL/6J小鼠;经PC... 详细信息

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)及其相关蛋白9(Cas9)构建v-maf肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物B(Mafb)基因敲除小鼠,初步研究该基因缺失对尿道发育的影响。方法根据CRISPR/Cas9技术原理构建Mafb基因敲除F0代C57BL/6J小鼠;经PCR及基因测序鉴定阳性的F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配繁殖,获得F1代Mafb基因敲除杂合子(Mafb^(+/-))小鼠;Mafb^(+/-)小鼠间进行交配繁殖,获得Mafb基因敲除纯合子(Mafb^(-/-))胎鼠。收集雄性Mafb^(-/-)胎鼠阴茎组织,通过免疫荧光技术检测阴茎组织中Mafb蛋白表达情况及尿道缝处上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况,扫描电子显微镜及石蜡切片H-E染色观察阴茎组织形态。结果成功构建、繁育Mafb^(+/-)小鼠并得到雄性Mafb^(-/-)胎鼠。免疫荧光检测结果显示雄性Mafb^(-/-)胎鼠阴茎组织中几乎不存在Mafb蛋白表达,且相较于野生型小鼠其尿道缝处E-cadherin蛋白表达明显降低、α-SMA蛋白表达明显增高;扫描电子显微镜及H-E染色显示雄性Mafb^(-/-)胎鼠为尿道下裂表型。结论成功构建Mafb基因敲除小鼠模型,该基因敲除可导致小鼠出现尿道下裂表型及尿道缝处细胞中E-cadherin和α-SMA的表达差异,为进一步研究该基因在尿道下裂发生机制中的作用奠定了基础。

关键词： v-maf肌筋膜纤维肉瘤癌基因同源物B 基因敲除基因型鉴定尿道下裂动物模型

SRC1/SRC2双基因敲除小鼠胎肺转录组分析

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生理学报 2022年第2期74卷 246-254页

作者：禹娅琴陈怀艳刘媛媛高路海军军医大学基础医学院生理学教研室上海市辅助生殖和生殖遗传重点实验室上海市胚胎源性疾病重点实验室上海200433

甾体激素受体共激活因子(steroid receptor coactivators, SRC)显著提高各种甾体激素受体的转录活性,在摄食、睡眠、应激反应和繁殖等多种生理功能中发挥着重要的调节作用。前期研究发现SRC1/SRC2双基因敲除(SRC1/2 double-knockout,SRC... 详细信息

甾体激素受体共激活因子(steroid receptor coactivators, SRC)显著提高各种甾体激素受体的转录活性,在摄食、睡眠、应激反应和繁殖等多种生理功能中发挥着重要的调节作用。前期研究发现SRC1/SRC2双基因敲除(SRC1/2 double-knockout,SRC1/2 dKO)的小鼠会出现分娩启动的延迟,部分原因是由于胎肺的发育不全和肺表面活性物质相关蛋白A (pulmonary surfactant protein-A, SP-A)、血小板激活因子(platelet activating factor, PAF)分泌减少所引起。然而,对于SRC1/2 dKO小鼠胎肺基因表达的变化,尚缺乏全转录组层面的系统解析。本研究选用SRC1基因敲除(SRC1 knockout, SRC1KO)、SRC2基因敲除(SRC2knockout,SRC2KO)、SRC1/2dKO与野生型(wild-type, WT)小鼠孕18.5天胎肺样本,利用Illumina平台进行转录组mRNA测序,筛选差异表达基因,并进行GO和KEGG功能注释和富集分析。结果显示,所有样本的碱基质量值Q30占比均在92%以上,SRC1KO和SRC2KO与WT胎肺相比分别有61和32个差异基因;SRC1/2 dKO与WT、SRC1KO和SRC2KO胎肺相比分别有480、11和901个差异基因,其中Aspg、Crispld2、Eln、Ntsr2、Slc10a6和Vgll3为SRC1/2 dKO与其余基因型小鼠相比特有的差异表达基因,实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹验证了转录组测序结果可靠。SRC1/2 dKO与WT小鼠胎肺差异基因的GO分析结果显示,差异基因在细胞组分上显著富集于细胞外空间、细胞外区域和细胞外基质等条目,在生物学过程大类中则与多器官的发育密切相关。KEGG通路分析表明,差异基因主要富集于补体系统、细胞外基质-受体的相互作用和蛋白质消化与吸收等信号通路。本研究从转录组水平全面揭示了SRC1/2 dKO所致的胎肺基因表达的变化,为妊娠过程中胎肺的发育调控机制研究和影响分娩启动的胎源性因子的进一步筛选提供了新的理论依据。

关键词：甾体激素受体共激活因子基因敲除胎肺发育分娩启动转录组测序

酿酒酵母中BAT2基因敲除对桑葚酒中高级醇的影响

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食品与发酵工业 2021年第19期47卷 133-139页

作者：徐佳黄雪芹杨建飞易媛马倩胡琨左勇四川轻化工大学生物工程学院四川宜宾644000 四川师范大学生命科学学院四川成都610000

BAT2是酿酒酵母产高级醇代谢途径中编码细胞质氨基酸转氨酶的基因,为研究该基因对酿酒酵母高级醇生成量的影响,以酿酒酵母S3为出发菌株,构建敲除质粒pUC-BAKB和pUC-BA1KB1,转化并验证获得敲除1个BAT2等位基因的重组菌株S3-1和敲除2个BAT... 详细信息

BAT2是酿酒酵母产高级醇代谢途径中编码细胞质氨基酸转氨酶的基因,为研究该基因对酿酒酵母高级醇生成量的影响,以酿酒酵母S3为出发菌株,构建敲除质粒pUC-BAKB和pUC-BA1KB1,转化并验证获得敲除1个BAT2等位基因的重组菌株S3-1和敲除2个BAT2等位基因的重组菌株D3-1。将S3、S3-1和D3-1菌株在相同条件下分别进行桑葚酒发酵,结果表明,与出发菌株S3相比,S3-1的生长性能无明显差异,高级醇含量降低了20.97%,为359.33 mg/L;D3-1的生长速率和生物量下降,高级醇含量降低了31.63%,为310.85 mg/L。其中异丁醇和异戊醇较其他高级醇下降明显,S3-1中降低了27.42%、22.86%;D3-1中降低了40.53%、35.28%。其他发酵性能与出发菌株无明显差异。综上,敲除BAT2基因能够有效降低酿酒酵母中高级醇的生成量,对改善桑葚酒的风味有重要参考意义。

关键词：酿酒酵母 BAT2 基因敲除高级醇桑葚酒