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基因ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

动物医学进展 2021年第2期42卷 12-18页

作者：薛景景侯瑞卿王婉冰张盼涛袁月郭丽霞张哲田辉刘武杰田克恭国家兽用药品工程技术研究中心河南洛阳471000 普莱柯生物工程股份有限公司河南洛阳471000 河北省动物卫生监督所河北石家庄050000

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota... 详细信息

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型分离鉴定抗原相关系数免疫原性

基因ⅶ型新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及特性研究

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中国预防兽医学报 2020年第1期42卷 52-57页

作者：霍娜金忠元卫巧林王文彬牟素菁李永山陈鸿军萧飒西北农林科技大学陕西杨凌712100 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

为制备基因ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制... 详细信息

为制备基因ⅶ型新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)的单克隆抗体(MAb),本研究利用JS/17病毒株的HN重组蛋白和活病毒分别免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,并通过ELISA、间接免疫荧光和western blot方法筛选,制备了3株特异性识别HN蛋白的单克隆抗体(MAb)。其中,MAb1D4和4D9具有病毒中和活性(VN)及血凝抑制作用(HI),可以识别多种基因型的Ⅱ类NDV,但与Ⅰ类NDV病毒株无反应。MAb 2G8识别线性表位131DYIGGIGKE139,该表位在各病毒株中高度保守。获得的3株MAb可以用于NDV的鉴定及HN蛋白的功能研究。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型单克隆抗体 HN蛋白

基因ⅶ型新城疫病毒融合前构象F蛋白的表达及结构分析

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中国兽医科学 2021年第4期51卷 475-482页

作者：陈林娜孙军峰李乐师乾凯邸涛刘添仪赵冉张春玮韩宗玺刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-opti... 详细信息

目前,新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的融合前构象是未知的,为获得具有融合前构象的NDV F蛋白,本研究对基因ⅶ型NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的F基因胞外区编码序列进行了修饰和密码子优化,将其克隆至真核表达载体中构建获得了重组质粒pCAG-optiF。通过SWISS-MODEL网站对蛋白结构进行预测,结果显示,质粒pCAG-optiF编码的蛋白能够形成与人呼吸道合胞体病毒F蛋白融合前构象相似的结构。将质粒pCAG-optiF转染至鸡源细胞LMH中,通过间接免疫荧光试验证实构建的蛋白在鸡源细胞中成功表达。将质粒p CAG-optiF转染悬浮培养的Expi293F细胞,表达并纯化获得重组蛋白roptiF。SDS-PAGE电泳结果显示获得了与预期大小相符的蛋白。Western-blotting结果显示,表达的roptiF蛋白能够与NDV CK/CH/LHLJ/1/06株的抗血清反应。进一步通过负染色电子显微镜观察roptiF蛋白结构,结果显示,roptiF蛋白具有典型的F蛋白融合前构象的结构特征。本研究成功获得了具有融合前构象的基因ⅶ型NDV F蛋白,并且该蛋白能够与抗NDV的血清反应,本研究结果为研制新型NDV疫苗奠定了基础。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型 F蛋白融合前构象

基因ⅶ型新城疫病毒样颗粒作为疫苗候选株的免疫效果

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中国兽医学报 2017年第2期37卷 201-205页

作者：袁乾亮丁佳欣高一丹徐小红钱晶薛聪杨明曦李金斗冉雄胡国升尹仁福丁壮吉林大学动物医学学院吉林长春130062

利用昆虫细胞/杆状病毒表达载体系统,将已构建编码新城疫病毒(NDV)M、F和HN结构基因的3种单顺反子重组杆粒共感染悬浮培养的Sf9细胞以大量制备新城疫病毒样颗粒(ND VLPs)。收集细胞培养上清经超速离心浓缩,蔗糖密度梯度纯化后,利用Weste... 详细信息

利用昆虫细胞/杆状病毒表达载体系统,将已构建编码新城疫病毒(NDV)M、F和HN结构基因的3种单顺反子重组杆粒共感染悬浮培养的Sf9细胞以大量制备新城疫病毒样颗粒(ND VLPs)。收集细胞培养上清经超速离心浓缩,蔗糖密度梯度纯化后,利用Western blot检测和透射电镜观察。结果显示,3种目的蛋白均正确表达且组装形成与原病毒粒子形态相似的颗粒,测定其血凝活性效价可达12log2。动物试验结果表明,与LaSota灭活油乳苗相比,将纯化后的病毒样颗粒以含25μg蛋白的剂量或联合佐剂免疫商品蛋鸡后能产生较高水平的HI抗体,且可有效减少攻毒鸡只口咽、泄殖腔途径的排毒时间,从而减少病毒在健康鸡群中的传播感染机会;表明所研制的基因ⅶ型ND VLPs可作为疫苗候选株具有很大的防控优势。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型病毒样颗粒疫苗候选株

基因ⅶ型新城疫病毒DNA疫苗的构建及免疫效力研究

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基因Ⅶ型新城疫病毒DNA疫苗的构建及免疫效力研究

作者：杨煦哈尔滨师范大学

学位级别：硕士

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的侵害禽类的急性、高度接触性传染病。自1926年首次暴发于印度尼西亚的爪哇岛和英国的新城以来，给养禽业带来了极大的危害，被世界动物卫生组织定为法定必报传染病。随着新城疫流行病学的变化，近... 详细信息

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的侵害禽类的急性、高度接触性传染病。自1926年首次暴发于印度尼西亚的爪哇岛和英国的新城以来，给养禽业带来了极大的危害，被世界动物卫生组织定为法定必报传染病。随着新城疫流行病学的变化，近年来出现了能够引起免疫鸡群发生“非典型性新城疫”及鹅、鸭发病死亡的基因ⅶ型新城疫病毒。非典型新城疫虽死亡率不高，但会导致家禽类生产性能下降，因而对其的防治尤为重要。目前应用ND疫苗以基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型为主，在很大程度上控制了新城疫的流行，但对基因ⅶ型新城疫病毒保护效果欠佳，因此研制针对基因ⅶ型NDV的新型疫苗势在必行。DNA疫苗是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗，能同时激发体液免疫和细胞免疫，免疫持续时间比较长，具有许多其他基因疫苗无可比拟的优点，可以作为有效控制目前新城疫流行的候选疫苗之一。本研究选用分离自黑龙江省拉林地区死亡鹅的NDV Go/CH/HLJ/LL01/08毒株(基因ⅶ型毒株，简称LL01株)，将其F，HN基因按真核表达系统优化后，分别克隆到真核表达载体pCDNA3.1R中筛选鉴定出含有F，HN基因的阳性重组质粒，分别命名为pCDNAR-F和pCDNAR-HN。将质粒转染到293T细胞，经间接免疫荧光、Western-blot检测，目的蛋白得到表达。为了检测重组新城疫病毒的F、HN DNA疫苗免疫效力，在SPF鸡上进行了动物实验。首先拟定了以下几个免疫剂量：pCDNAR-F200μg、100μg;pCDNAR-HN200μg、100μg;pCDNAR-F+pCDNAR-HN各50μg、100μg，对SPF鸡进行免疫，间隔14天，共免疫3次，末次免疫后23天，用LL01株强毒以105EID50、106EID50肌肉注射方式攻毒。结果表明，只免疫pCDNAR-F质粒及生理盐水对照的SPF鸡全部死亡，而重组质粒pCDNAR-HN50μg、100μg、200μg免疫对SPF鸡100%保护。在此基础上，又重新构建了含未经优化的F基因重组质粒pCDNAR-WF，免疫SPF鸡并攻毒，经验证与质粒pCDNAR-F相同，质粒pCDNAR-WF对鸡也没有免疫原性。重组质粒pCDNAR-HN最小免疫剂量为每次30μg，三次免疫后，用强毒株攻毒，100%保护;在上述免疫程序下，重组质粒的抗体持续期至260天，HI抗体效价值仍能达到2-2，免疫70天后，在脑、肺、心、肝、脾、肾、胃、肠、肌肉(除胸腺外)中均能检测到质粒分布。研究结果表明，所构建的重组HN基因DNA疫苗能够刺激鸡体产生高效的体液免疫反应，可抵抗致死量基因ⅶ型NDV强毒攻击，且持续时间较长，有望作为针对基因ⅶ型新城疫强毒的候选疫苗。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型 HN基因 DNA疫苗

基因ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救

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基因Ⅶ型NDV弱毒株感染性克隆的构建及病毒拯救

作者：孟令宅河北农业大学

学位级别：硕士

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的传染病,我国将其列为一类动物疫病。NDV只有单一血清型,但存... 详细信息

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的禽类的一种高度接触性、急性、烈性传染病,世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的传染病,我国将其列为一类动物疫病。NDV只有单一血清型,但存在多种基因型,目前我国主要流行的是Class Ⅱ类型中基因Ⅶ毒株,常规疫苗株B1、Clone30、La Sota及V4疫苗株属于基因Ⅰ型和Ⅱ型,不能有效防控基因ⅶ型毒株。因此,应迫切研发与当前流行株基因型一致的新型疫苗。基于此,本研究对一株NDVHB株进行了全基因组测序,以此为基础建立了HB株的反向遗传操作平台,并对其F蛋白进行改造,旨在为研发基因ⅶ型NDV弱毒疫苗提供科学依据。从河北省某发病鸡场的临床样本中检测到一株新城疫病毒,命名为HB,采用RT-PCR方法对HB株的全基因组序列进行分段扩增,并对其基因序列进行结构特性分析及同源进化分析。结果表明HB株基因组全长为15192 bp,基因组3’端存在长为55 nt的引导序列,5’端存在长为114 nt的尾随序列,主要编码的6种结构蛋白,包括基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）、核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、以及RNA依赖性RNA聚合酶蛋白（L）,基因组排列顺序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’。全基因组遗传进化分析表明,HB株属于Class Ⅱ中的基因ⅶ型毒株,与鸭源新城疫毒株BP01、Fujian/FP/02、MMd/CH/LGD/1/2005核苷酸的同源性最高（99.1%～99.2%）,进化树上处于同一分支;与中国广泛使用的V4,Mukteswar和La Sota等疫苗株核苷酸的同源性较低（82.9%～85.6%）,进化树上处于不同分支。基于F基因的系统进化树显示,HB株属于基因Ⅶd亚型,是目前我国流行毒株中的优势亚型毒株。通过与其它毒株的序列进行比对,发现在F蛋白的信号肽,七肽重复区和跨膜结构域中出现了 4、16和2个氨基酸突变,在HN蛋白的功能结构域和中和表位分别出现1和5个氨基酸突变,这些关键位点的突变与病毒的吸附性及免疫逃避有关。应用反向遗传操作技术将HB株全长cDNA分为外部基因质粒（M、F及HN）和内部基因质粒（NP、P及L）两部分构建,通过同义突变将L蛋白的3100位点处的碱基A突变为T作为遗传标记,用以与野毒进行区分;利用融合PCR技术将F蛋白的112～117裂解位点的氨基酸序列突变为弱毒株La Sota裂解位点序列,同时构建了三个辅助质粒PCI-NP,PCI-P,PCI-L,将内部基因质粒、外部基因质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞进行病毒拯救,并通过细胞病变、遗传标记检测、基因测序及间接免疫荧光等试验技术对拯救病毒进行鉴定,结果表明,rHB株能在BHK-21细胞上引起典型的细胞病变（CPE）,引入的遗传标记在传代过程中可以稳定遗传,F蛋白裂解位点处氨基酸序列突变成功,病毒拯救成功。对拯救病毒的生长特性进行分析,表明rHB株与HB株在BHK-21细胞上具有相似的生长特性。NDV HB株感染性克隆的成功构建可为进一步研究NDV的致病机制和研发新型基因工程疫苗提供技术平台。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型基因组反向遗传操作感染性克隆

表达基因ⅶ型新城疫病毒F蛋白的重组鸡痘病毒的构建和筛选

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中国兽医科学 2015年第3期45卷 235-240页

作者：辛舒田明尧曹佳媛薛斐杜寿文谭鹏肖朋朋陈兴郭海宁金宁一吉林农业大学动物科学技术学院吉林长春130118 军事医学科学院军事兽医研究所吉林长春130122 广西大学动物科学技术学院广西南宁530004

为了构建并筛选表达新城疫病毒(NDV)F蛋白的重组鸡痘病毒(rFPV-F),通过PCR扩增F基因,克隆至pMD18-T Simple载体,进行DNA序列分析和遗传进化关系分析。将测序正确的F基因克隆至笔者所在实验室自行构建的新型鸡痘病毒穿梭载体pTS2GFPV150... 详细信息

为了构建并筛选表达新城疫病毒(NDV)F蛋白的重组鸡痘病毒(rFPV-F),通过PCR扩增F基因,克隆至pMD18-T Simple载体,进行DNA序列分析和遗传进化关系分析。将测序正确的F基因克隆至笔者所在实验室自行构建的新型鸡痘病毒穿梭载体pTS2GFPV150中,获得重组质粒pTS2GFPV150-F。然后将其与鸡痘病毒FPV282E4株共转染鸡胚成纤维细胞进行同源重组,挑取表达增强型绿色荧光蛋白的噬斑,经多轮筛选获得重组病毒rFPV-F,应用PCR、RT-PCR、Western-blot等方法对重组鸡痘病毒进行鉴定。结果显示,成功获得NDV F基因及重组F基因的鸡痘病毒rFPV-F,并证实F基因已被整合到鸡痘病毒基因组中,且在感染细胞内被成功表达。本研究成功获得了1株表达NDV F基因的重组鸡痘病毒,为下一步开展动物体内免疫研究奠定了基础。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型 F蛋白鸡痘病毒穿梭载体同源重组

反向遗传技术致弱的基因ⅶ型新城疫病毒对SPF鸡的免疫效力评价

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中国预防兽医学报 2017年第6期39卷 475-480页

作者：刘涛吉艳红贾艳娥朱启运李郁安徽农业大学动物科技学院安徽合肥230036 中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃兰州730046

为评估致弱的基因ⅶ型新城疫病毒(NDV)的免疫效力,本研究采用反向遗传技术构建的一株基因ⅶ型NDV减毒疫苗株(MG7株),通过滴鼻点眼接种4周龄SPF鸡后,检测其体液免疫、细胞免疫以及攻毒后保护效率和排毒情况等指标,评价MG7株的免疫效果。... 详细信息

为评估致弱的基因ⅶ型新城疫病毒(NDV)的免疫效力,本研究采用反向遗传技术构建的一株基因ⅶ型NDV减毒疫苗株(MG7株),通过滴鼻点眼接种4周龄SPF鸡后,检测其体液免疫、细胞免疫以及攻毒后保护效率和排毒情况等指标,评价MG7株的免疫效果。结果表明:MG7株免疫3周后,能够诱导SPF鸡抗体的产生,且抗体水平(>6.08log_2)高于La Sota株免疫组(5.2log_2)。MG7株免疫1~3周内,PBMCs中CD8α+T淋巴细胞亚群比例呈逐渐上升趋势;MG7免疫后第3周,PBMCs中CD4^+T淋巴细胞亚群的比例明显增加(p基因ⅶ型NDV强毒株进行攻毒试验,在攻毒后第2 d^6 d,MG7株免疫组SPF鸡未检测出排毒;LaSota株免疫组则存在不同程度排毒现象,而空白对照组全部死亡。实验表明,与LaSota株免疫组相比,MG7株能够有效诱导NDV特异性抗体产生和T细胞免疫反应,提高SPF鸡的保护效率和有效阻止排毒。本研究对MG7株免疫效力的评估结果表明其具有作为新型基因ⅶ型NDV疫苗株的潜力,有助于我国ND的防控和根除。

关键词：新城疫疫苗基因ⅶ型体液免疫细胞免疫保护效率

NDV基因ⅶ型与基因Ⅱ型感染CEF后microRNA表达谱分析

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河北农业大学学报 2022年第5期45卷 105-112,F0003页

作者：薄一丹庞洪泽赵款雷白时蒋文明袁万哲张武超刘聚祥河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省兽医生物技术创新中心河北保定071001 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032

本研究旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)流行株HB株(基因ⅶ型)与疫苗株La Sota株(基因Ⅱ型)在感染鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)36 h后宿主细胞microRNA(miRNA)表达谱变化情况。通过高通量测序技术... 详细信息

本研究旨在探究新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)流行株HB株(基因ⅶ型)与疫苗株La Sota株(基因Ⅱ型)在感染鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)36 h后宿主细胞microRNA(miRNA)表达谱变化情况。通过高通量测序技术分别对La Sota株与HB株感染CEF后36 h后的样本与参考鸡源基因组进行系统比对,筛选差异表达miRNA并对其靶基因进行GO功能注释以及KEGG通路富集。最后随机筛选5条miRNA通过实时荧光定量PCR(Real-time quantification PCR,RT-qPCR)进行验证。结果表明,La Sota与HB感染组中已知miRNA分别为56.9%和47.8%;La Sota与HB感染组通过差异性比较后共筛选出10条差异表达miRNA;通过对差异表达基因的靶基因进行GO与KEGG富集发现,其主要在细胞代谢、生物合成以及应激信号传导等通路上出现显著富集;RT-qPCR结果与RNA-seq结果趋势一致,证明了测序结果的可靠性。为进一步揭示不同NDV毒株感染CEF以及在感染过程中miRNA发挥的调控作用提供了研究基础。

关键词：新城疫病毒基因ⅶ型基因Ⅱ型 miRNA 鸡胚成纤维细胞(CEF)

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