检索结果-南通市图书馆

作者：呼丽娜山西大学

学位级别：硕士

谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一种具有抗氧化和解毒重金属功能的硫醇小分子三肽,广泛存在于各种生物体中。GSH在生物体内的含量远高于金属硫蛋白、植物螯合肽等解毒重金属多肽,其通过巯基螯合金属离子,并与GPX酶共同作用来保护生物体。... 详细信息

谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一种具有抗氧化和解毒重金属功能的硫醇小分子三肽,广泛存在于各种生物体中。GSH在生物体内的含量远高于金属硫蛋白、植物螯合肽等解毒重金属多肽,其通过巯基螯合金属离子,并与GPX酶共同作用来保护生物体。通过对其调控基因的改造实现生物体对有害金属耐受性的增强和谷胱甘肽生产能力的提高,具有重要的理论意义和应用价值。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种自由生单细胞纤毛类原生动物,无细胞壁,对环境污染物敏感,具有环境相适应的重要功能基因家族,是经典的探究细胞对环境污染物的降解和解毒、高效抗氧化效应的模式生物。本研究以嗜热四膜虫为研究对象,鉴定了GSH合成途径的谷氨酰半胱氨酸合成酶基因和谷胱甘肽合成酶基因,对基因的功能进行了分析,获得的结果如下:1.嗜热四膜虫谷胱甘肽合成基因GSH1和GSH2的生物信息学分析基于嗜热四膜虫基因组数据库和功能基因组数据库,通过生物信息学分析,鉴定出嗜热四膜虫谷胱甘肽合成途径的关键酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1(TTHERM＿00250970)和谷胱甘肽合成酶基因GSH2(TTHERM＿01049360)。GSH1开放阅读框1881 bp,编码626个氨基酸;GSH2开放阅读框1938 bp,编码645个氨基酸。GSH1和GSH2在营养生长期、饥饿期、有性生殖期表达,接合配对诱导表达水平的显著上调。在金属离子Cd和Pb的胁迫下,野生型嗜热四膜虫的GSH1和GSH2表达水平显著上调。GSH1和GSH2分别进行系统发育分析,发现两个基因,具有相似的进化分支,存在协同进化模式。蛋白质相互作用分析发现二者均与合成谷胱甘肽的前体物质半胱氨酸合成相关的蛋白存在相互作用。***1敲除突变体细胞对Cd和Pb的敏感性增强构建GSH1基因敲除载体p Neo4-GSH1,基因枪转化嗜热四膜虫,通过同源重组和抗性筛选,获得GSH1基因敲除突变体细胞株KO-GSH1。在Cd和Pb的胁迫下,野生型细胞的IC50值分别为30.77μM、15.35μM,而KO-GSH1细胞的IC50值分别为26.46μM、13.39μM,GSH1的敲除导致细胞对重金属离子胁迫的敏感性增强。进一步分析发现,KO-GSH1细胞中谷胱甘肽的含量下降了85%;在Cd和Pb的胁迫下,KO-GSH1细胞中谷胱甘肽的含量分别下降了95%和94%,野生型细胞株谷胱甘肽的含量下分别下降了55%和53%。然而,在Cd和Pb胁迫下,KO-GSH1细胞的MTT1、MTT3和MTT5以及抗氧化酶基因SOD1、GPX1和CAT基因表达水平均显著上调,结果表明KO-GSH1突变体通过上调金属硫蛋白基因和抗氧化酶基因的表达水平来抵抗Cd和Pb的胁迫。***1和GSH2基因过表达细胞对Cd和Pb的耐受性增强构建MTT1启动子调控下的过表达载体pXS75-GSH1和pXS75-GSH2,基因枪转化嗜热四膜虫,筛选获得过表达细胞株OE-GSH1和OE-GSH2。免疫荧光定位分析表明,HA-Gsh1和HA-Gsh2均定位在细胞质中。在Cd和Pb胁迫下OE-GSH1的IC50分别为35.15μM、18.13μM,OE-GSH2的IC50分别为33.98μM、17.58μM均高于野生型,表明OE-GSH1和OE-GSH2均对Cd和Pb的耐受性增强。在Cd和Pb胁迫下,OE-GSH1和OE-GSH2突变体中的GSH1和GSH2的表达水平均显著上调,谷胱甘肽的含量均显著上升。然而金属硫蛋白基因MTT1、MTT3和MTT5以及抗氧化酶基因SOD1、GPX1和CAT的表达水平显著下降。结果表明,OE-GSH1和OE-GSH2细胞通过上调GSH1和GSH2的表达水平增加谷胱甘肽的含量以此来增加对Cd和Pb的耐受性,谷胱甘肽、金属硫蛋白和抗氧化酶系统协同参与了四膜虫对Cd和Pb的解毒功能。综上所述,本研究首次鉴定了四膜虫GSH合成基因,γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1和谷胱甘肽合成酶基因GSH2,嗜热四膜虫GSH1敲除突变体中谷胱甘肽合成下降。在重金属离子胁迫下,敲除突变体细胞中的金属硫蛋白相关基因和抗氧化相关基因表达上调。相反,GSH1和GSH2的上调表达,导致金属硫蛋白相关基因和抗氧化相关基因表达下调。在环境重金属胁迫下,GSH合成途径和金属硫蛋白及抗氧化酶系统存在相互功能补偿,在四膜虫重金属离子解毒过程中发挥重要的调节作用。

关键词：嗜热四膜虫谷胱甘肽 GSH1 GSH2 重金属耐受性

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嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性分析

嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3核酸内切酶活性分析

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作者：杨焕山西大学

学位级别：硕士

DNA错配修复(Mismatch repair,MMR)是保守的损伤修复系统,能够去除DNA复制过程中由于碱基与碱基之间插入和删除所引起的错配。在原核生物中,MutS蛋白识别并结合在错配位点上,之后招募MutL蛋白形成复合物,激活MutH蛋白的核酸内切酶活性,... 详细信息

DNA错配修复(Mismatch repair,MMR)是保守的损伤修复系统,能够去除DNA复制过程中由于碱基与碱基之间插入和删除所引起的错配。在原核生物中,MutS蛋白识别并结合在错配位点上,之后招募MutL蛋白形成复合物,激活MutH蛋白的核酸内切酶活性,从而切割错配位点附近无甲基化的含有GATC序列的DNA。核酸外切酶在单链结合蛋白(single strand DNA-binding protein,SSB)以及UvrD解旋酶的协助作用下,将无甲基化的单链DNA从GATC位点到错配位点全部去除,之后在DNA聚合酶及连接酶的作用下完成修复。真核生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和哺乳动物细胞中,MutS同源物(MutS homologs,MSHs)通过形成异二聚体识别并结合碱基之间的错配以及插入和删除突变区。MSH复合物与MutL同源物(MutL homologs,MLH)相互作用在新链上产生缺口,招募其他因子促进删除并完成新链的合成。MutL同源蛋白Mlh3具有高度保守性。其C端含有DQHA(X)2E(X)4E motif,这个motif结合金属离子后可促进Mlh3核酸内切酶活性。在多种生物体中,Mlh3不仅参与错配修复过程,还参与减数分裂同源重组过程。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)有性生殖过程中生殖系小核延伸并活跃转录,减数分裂过程中染色体同源重组起始于程序化的DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)的形成,DNA错配修复系统能够去除DNA复制过程中所引起的错配并促进同源重组。减数分裂特异表达的错配修复因子Mlh3对四膜虫的有性生殖是必需的,然而具体功能并不清楚。本研究通过对嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3的研究,获得主要结果如下:***3基因的序列比对及蛋白结构模拟利用DNAMAN软件对不同模式生物的MLH3基因进行同源性比对发现,与其他模式生物相比,嗜热四膜虫Mlh3氨基酸序列N端没有保守ATP结合模体。但存在DQHA(X)2E(E)4E模体及其他三个((A/G)Q,ACX,CP/NHGRP)保守模体,共同形成了金属结合位点以及核酸内切酶活性位点。通过Swiss-Model同源建模进行嗜热四膜虫Mlh3蛋白结构的模拟,发现DQHA(X)2E(X)4E模体和C(X)HGR(X)模体空间上相互靠近,表明两个模体可能共同决定了Mlh3的离子结合和核酸内切酶活性。***3基因的合成及原核表达纯化将MLH3密码子优化为大肠杆菌偏爱的密码子并人工合成MLH3基因,构建了重组表达质粒pGEX-MLH3。定点突变Mlh3模体DQHA(X)2E(X)4E中编码天冬氨酸的CAC为编码天冬酰胺的AAC,突变编码谷氨酸的GAA为编码丙氨酸的GCA,获得重组质粒pGEX-MLH3D117N和pGEX-MLH3D117E123A。进一步通过PCR扩增获得截短CVHGRS的缺失C端84个碱基的MLH3截短突变体,获得重组质粒pGEX-MLH3D117NE123AΔ28。转化大肠杆菌重组表达了含有GST标签的蛋白GST-Mlh3、GST-Mlh3-D117N、GST-Mlh3-D117N-E123A、GST-Mlh3-D117N-E123AΔ28,通过GST亲和层析纯化得到GST-Mlh3蛋白及突变蛋白,通过12%SDS-PAGE分析获得电泳纯蛋白。***3具有依赖于金属离子的核酸内切酶活性将Mlh3蛋白与超螺旋DNA共同孵育,琼脂糖凝胶电泳检测Mlh3对超螺旋DNA的切割效率,发现Mlh3具有核酸内切酶活性。金属离子Cu,Mn及Mg显著促进其内切酶活性。当加入ATP时,可以进一步促进其内切酶活性。表明ATP和金属离子协同促进了Mlh3的内切酶活性。随着超螺旋DNA片段的增大,GST-Mlh3对DNA的切割作用由产生缺口转变为完全切割为线性DNA。表明Mlh3对片段较大的超螺旋DNA具有显著的切割作用。***3核酸内切酶活性位点分析将GST-Mlh3-D117N,GST-Mlh3-D117N-E123A作用于超螺旋DNA,发现GST-Mlh3-D117N,GST-Mlh3-D117N-E123A内切酶活性均降低。进一步将C末端的C(X)HGR(X)结构域截除突变,与GST-Mlh3-D117N和GST-Mlh3-D117N-E123A相比,该突变体内切酶活性进一步降低。表明这两个模体共同决定了Mlh3的离子结合和核酸内切酶活性。***-Tag免疫共沉淀鉴定出多种与Mlh3相互作用的因子通过对HA-Mlh3细胞株减数分裂时期的蛋白样进行免疫共沉淀实验,12%SDS-PAGE电泳银染分析及Western-blotting检测后,将目的蛋白样进

关键词：嗜热四膜虫错配修复 Mlh3 定点突变核酸内切酶活性

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嗜热四膜虫chromodomain蛋白Tcd1磷酸化位点的突变和定位分析

嗜热四膜虫chromodomain蛋白Tcd1磷酸化位点的突变和定位分析

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作者：凌晨山西大学

学位级别：硕士

Chromodomain(chromatin organization modifier domain)存在于真核生物当中,通过与组蛋白甲基化位点结合来调控异染色质的形成和转录活性。含有Chromodomain的蛋白质广泛存在于各种真核生物之中,不同生物Chromodomain序列是高度保守的... 详细信息

Chromodomain(chromatin organization modifier domain)存在于真核生物当中,通过与组蛋白甲基化位点结合来调控异染色质的形成和转录活性。含有Chromodomain的蛋白质广泛存在于各种真核生物之中,不同生物Chromodomain序列是高度保守的。Chromodomain中保守的芳香族氨基酸在立体空间区域上彼此靠近构成疏水“box”区域,该疏水结构可以与组蛋白H3第9位和第27位的赖氨酸(H3K9和H3K27)二甲基或三甲基化修饰的位点发生相互作用,通过改变染色质的结构来实现对基因表达的调控。在嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)有性生殖过程中,基因组发生大量重排与修复过程中形成了特异的异染色质体。Pdd1磷酸化及去磷酸对于异染色质体的形成和内部删除序列(IES)的去除是必需的,本研究对嗜热四膜虫chromodomain蛋白Tcd1存在的磷酸化位点进行了分析,并对其磷酸化位点突变后的定位进行了比较,获得主要结果如下:***1蛋白磷酸化位点分析及相互作用蛋白质谱鉴定TCD1(TTHERM1337400)在有性生殖时期特异表达,编码723个氨基酸。Tcd1蛋白有2个chromodomain(CD)和1个chromoshadow domain(CSD)的保守结构域。四膜虫磷酸化蛋白质组学分析表明Tcd1蛋白在四膜虫有性生殖时期S301、S303和S535三个位点发生磷酸化修饰。蛋白质谱鉴定出与Tcd1存在多个相互作用的蛋白。***1的磷酸化修饰影响了其在亲本大核的定位通过定点突变,对TCD1基因进行模拟磷酸化突变,获得模拟磷酸化突变基因TCD1S301D(TCD1S1D),TCD1S301DS303D(TCD1S2D),TCD1S301DS303DS535D(TCD1S3D)。然后分别构建了以上突变体的表达载体pXS75-TCD1S1D、pXS75-TCD1S2D、pXS75-TCD1S3D。分别转化不同交配型四膜虫细胞,筛选获得不同突变体细胞株。Western blotting分析表明Tcd1S1D、Tcd1S2D和Tcd1S3D在四膜虫有性生殖期获得表达。免疫荧光定位分析表明,Tcd1S1D点状定位于细胞质当中,Tcd1S2D和Tcd1S3D在有性生殖初期定位于细胞质中,在新大核上形成均匀的定位,但无法定位于亲本大核上。Tcd1的磷酸化修饰影响了其在有性生殖早期从胞质向亲本大核内的转移。3.去磷酸化的Tcd1在新大核发育后期出现异常凝集通过定点突变,对TCD1基因进行去磷酸化突变,获得模拟磷酸化突变基因TCD1S301A(TCD1S1A),TCD1S301AS303A(TCD1S2A),TCD1S301AS303AS535A(TCD1S3A)。然后分别构建突变基因的表达载体pXS75-TCD1S1A、pXS75-TCD1S2A、pXS75-TCD1S3A。转化不同交配型的四膜虫细胞,Western blotting分析表明Tcd1S1A、Tcd1S2A和Tcd1S3A在四膜虫有性生殖期均在细胞中稳定表达。间接免疫荧光定位分析表明,在细胞有性生殖早期,Tcd1S1A、Tcd1S2A和Tcd1S3A蛋白能够进入亲本大核并点状分布,与野生型Tcd1在亲本大核的定位模式一致。在新大核形成时,Tcd1S1A、Tcd1S2A和Tcd1S3A蛋白能从亲本大核转移到新大核上。在有性生殖末期,HA-Tcd1S1A定位于特异的点状异染色质体,而HA-Tcd1S2A和HA-Tcd1S3A发生聚集形成异常的块状结构。Tcd1的去磷酸化影响其在有性生殖后期在新发育大核中的正常定位。***1的去磷酸化修饰影响了其在有性生殖后期与Pdd1的共定位Pdd1对于异染色质的形成和IES的删除是必需的。有性生殖初期,Tcd1与Pdd1点状分布于亲本大核上,并且可以形成共定位。新大核形成过程中,Tcd1与Pdd1都会共定位于新大核上,并且形成不均一的定位。在有性生殖后期,Tcd1与Pdd1在新形成的大核上会逐渐聚集形成块状定位,并且Tcd1与Pdd1可以共定位于异染色质体。突变体细胞中,HA-Tcd1S3A与Pdd1在有性生殖初期可以正常共定位于细胞核上。新大核发育时期,HA-Tcd1S3A与Pdd1在新大核上不能完全形成共定位。配对细胞分开后,HA-Tcd1S3A与Pdd1逐渐聚集形成不同的定位信号。结果表明Tcd1的动态磷酸化修饰对其在细胞核中的分布是必需的。本研究对Tcd1蛋白的三个磷酸化位点进行磷酸化以及去磷酸化突变,并对它们的定位模式进行比较分析。磷酸化的Tcd1突变体无法定位于亲本大核,抑制了蛋白的入核转运;Tcd1S2D和Tcd1S3D能够均匀定位于新大核上,但无法形成异

关键词：嗜热四膜虫 Tcd1 磷酸化突变细胞定位

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嗜热四膜虫周期蛋白Cyc9及其相关蛋白的功能分析

嗜热四膜虫周期蛋白Cyc9及其相关蛋白的功能分析

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作者：郭玉凤山西大学

学位级别：硕士

在长期的生物进化过程中,从酵母的单倍体交配型进化到纤毛虫多样化的交配型细胞,以及高等生物两性配子细胞结合的生殖方式,细胞为彼此识别融合进化出精细的调控系统。单细胞真核生物有性生殖起始于不同交配型细胞的识别结合,不同的调控... 详细信息

在长期的生物进化过程中,从酵母的单倍体交配型进化到纤毛虫多样化的交配型细胞,以及高等生物两性配子细胞结合的生殖方式,细胞为彼此识别融合进化出精细的调控系统。单细胞真核生物有性生殖起始于不同交配型细胞的识别结合,不同的调控因子及细胞膜表面蛋白直接参与,起始了有性生殖进程。原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)具有7种不同的配对型,不同交配型细胞通过有性生殖过程中基因重排机制随机产生。不同交配型细胞间识别配对时,细胞形态发生改变,配对细胞形成稳定的conjugation junction结构,小核经历连续两次减数分裂,配子交换融合。目前四膜虫细胞性别决定和减数分裂机制取得重要进展,然而细胞识别的分子机制并不清楚。本研究鉴定了饥饿诱导的阶段性特异表达的周期蛋白基因CYC9,并对周期蛋白Cyc9p相关蛋白在细胞配对起始过程中的功能进行了系统分析。获得的主要结果如下:***9在饥饿期和有性生殖期特异表达通过四膜虫大核基因组数据库(http//:***)以及功能基因组数据库(http://***)对嗜热四膜虫CYC9(TTHERM0940290)基因进行分析发现,该基因全长为1915bp,开放阅读框为1218bp,预测编码405个氨基酸,蛋白大小约为45KDa。Cyc9氨基酸序列比对分析发现其中含有一段由95aa组成的保守的周期蛋白框,但没有典型的破坏框,N端有一段富含赖氨酸的区域,推测为泛素化结合位点。Microarray表达谱及qRT-PCR分析表明CYC9基因在生长期不表达,在饥饿期和细胞配对初期具有高表达。通过构建带有HA标签的由MTT1启动子调控表达的重组质粒pXS75CYC9,将该质粒转入野生型细胞株后进行免疫荧光定位分析,发现Cyc9p定位在细胞质中。***9敲除抑制不同交配型细胞的识别配对构建质粒pNeo4-CYC9,转化不同交配型的嗜热四膜虫细胞B2086和Cu428,通过Paromomycin抗性筛选和表型分配,获得CYC9敲除突变细胞株ΔCYC9-B和ΔCYC9-C。对ΔCYC9突变细胞株进行不同交配型细胞识别配对分析,结果表明不同配对型敲除突变细胞株之间不能发生配对结合。进一步对ΔCYC9突变株细胞形态进行观察发现,饥饿诱导的不同配对型突变细胞株混合后,其细胞形态始终与饥饿时相同,并不被诱导出现细胞极性突出结构。构建pBsrCYC9重组质粒,转化ΔCYC9-B和ΔCYC9-C突变株,恢复CYC9的表达。结果发现营救之后部分细胞可以恢复配对,且配对细胞可以正常完成有性生殖发育,表明CYC9为细胞的识别配对所必需。***9相关基因的鉴定分析对野生型和ΔCYC9突变细胞株总RNA进行差异转录组分析,结果发现CYC9的表达缺失导致嗜热四膜虫性别决定基因MTA6表达量下降了约10倍,MTB6表达量下降了约20倍。此外,编码周期蛋白依赖性蛋白激酶催化亚基的基因CKS1表达量下降了约25倍。为进一步了解周期蛋白Cyc9p调控通路参与的因子及其功能,通过功能基因组数据库(http://***)鉴定了与CYC9共表达的周期蛋白依赖性激酶基因CDK19。***9相关基因CDK19,CKS1敲除干扰细胞识别配对分别构建敲除质粒pNeo4CDK19和pNeo4CKS1,转化不同交配型的嗜热四膜虫细胞Cu427和Cu428,通过Paromomycin抗性筛选和表型分配,获得CDK19和CKS1敲除突变体细胞。将不同交配型CDK19敲除突变细胞株进行配对观察,结果发现,敲除CDK19后细胞不能进行配对;将不同配对型的CKS1敲减突变株进行配对发现,CKS1基因敲减后细胞的配对率仅达到20%-30%,表明Cdk19和Cks1共同参与调控交配型细胞的配对识别。本研究首次对嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC9及其相关因子的功能进行了分析,CYC9基因在生长期不表达,在饥饿期和有性生殖细胞配对初期具有高表达,Cyc9p定位在细胞质中。CYC9,CKS1,CDK19为嗜热四膜虫不同交配型细胞的识别和配对所必需,CYC9的敲除同时抑制了四膜虫性别决定基因MTA6和MTB6的表达。结果表明周期蛋白Cyc9及相关因子Cdk19,Cks1共同参与调控嗜热四膜虫有性生殖过程中细胞的识别配对。

关键词：嗜热四膜虫周期蛋白有性生殖细胞识别

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嗜热四膜虫中Chromodomain蛋白Tcd3和Tcd4的表达调控与功能分析

嗜热四膜虫中Chromodomain蛋白Tcd3和Tcd4的表达调控与功能分析

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作者：张理光山西大学

学位级别：硕士

Chromodomain (chromatin organization modifier domain)是一个由30～50个氨基酸组成的保守的蛋白质结构域,含有Chromodomain的蛋白质广泛存在于多种生物中的染色质结合蛋白中,通过与组蛋白或RNA的作用参与了异染色质的形成及基因的表... 详细信息

Chromodomain (chromatin organization modifier domain)是一个由30～50个氨基酸组成的保守的蛋白质结构域,含有Chromodomain的蛋白质广泛存在于多种生物中的染色质结合蛋白中,通过与组蛋白或RNA的作用参与了异染色质的形成及基因的表达调控。四膜虫中程序性全基因组重排在有性生殖过程中发生,siRNA, MeH3K9, Pdd1p和Pdd3p参与这一过程,然而其详细机制仍不清楚。本研究从四膜虫基因组中筛选到两个含有Chromodomain的基因TCD3(Tetrahymena Chromo Domain 3)与TCD4(Tetrahymena Chromo Domain 4),对这两个基因的表达调控和细胞定位进行了研究,获得的主要结果如下： ***3和TCD4序列分析通过生物信息学的方法,从四膜虫大核基因数据库鉴定了TCD3 (TTHERM0585180)和TCD4 (TTHERM0585190),两个基因串联于同一条大核染色体上,间隔237bp,两个基因内均具有GT-AG的内含子。TCD3和TCD4基因拟编码的蛋白334个和344个氨基酸残基组成,分子量分别为40.26kDa和41.11kDa,等电点(pI)分别为4.590和5.435。全基因表达Microarray分析表明TCD3和TCD4在四膜虫营养生殖阶段和饥饿期不表达,在有性生殖过程中8h时表达量最高,并且两者的表达谱一致。 ***3和TCD4的5’和3’-RACE TCD3和TCD4的ORF分别为1005bp和1035bp,大核染色体中基因全长分别为1241bp和1429bp,各含有两个内含子。5’RACE和3’RACE表明TCD3和TCD4的5’端非编码区(5’-UTR)长度分别为40bp和43bp,3’端非编码区(3’-UTR)长度分别为90bp和189bp。Chromodomain聚类分析表明Tcd3和Tcd4与pddlp蛋白的Chromodomain最为相似,SWISS—MODEL预测发现Tcd4的Chromodomain缺失α-螺旋结构。 ***3和Tcd4的免疫荧光定位构建含有HA标签的表达载体OE-PBX-TCD3和OE-PBX-TCD4,转化四膜虫CU428和B2086细胞株,通过巴龙霉素筛选,PCR鉴定,获得HA-Tcd3和HA-Tcd4的过表达细胞株。激光共聚焦显微镜对HA-Tcd3和HA-Tcd4的免疫荧光定位发现：HA-Tcd3定位于四膜虫有性生殖核发育的亲本大核和新发育的大核中;HA-Tcd4则定位于conjusome和新发育的大核中。 TCD3和TCD4相似的序列特征,保守的Chromodomain位置,一致的表达谱,表明两个基因中的一个很可能源于基因复制,进而加强该基因的功能。TCD3和TCD4在四膜虫接合生殖时期特异表达,都能够定位于新的发育的大核中,表明Tcd3和Tcd4极有可能参与了新的大核发育过程中程序性基因组重排。Tcd3和Tcd4在亲本大核和conjusome特异的定位,以及不同的模型结构,暗示基因TCD3和TCD4在进化过程中产生了新的功能。这些研究为进一步探讨chromodomain蛋白的功能提供了新的数据。

关键词： Chromodomain 嗜热四膜虫 TCD3 TCD4 RACE

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嗜热四膜虫自噬相关蛋白Atg5在核程序性降解中的功能分析

嗜热四膜虫自噬相关蛋白Atg5在核程序性降解中的功能分析

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作者：刘亚山西大学

学位级别：硕士

在真核生物中自噬是一种高度保守的分解代谢过程,通过溶酶体与自噬体相融合从而降解多余的细胞成分或有害物质,用以维持细胞生理稳态和响应饥饿或其他恶劣环境。自噬可以分为非选择性和选择性自噬,选择性自噬根据其降解底物的不同又可... 详细信息

在真核生物中自噬是一种高度保守的分解代谢过程,通过溶酶体与自噬体相融合从而降解多余的细胞成分或有害物质,用以维持细胞生理稳态和响应饥饿或其他恶劣环境。自噬可以分为非选择性和选择性自噬,选择性自噬根据其降解底物的不同又可以分为线粒体自噬、内质网自噬和细胞核自噬等。嗜热四膜虫有性生殖时期亲本大核的程序性死亡(programmed nuclear death,PND)是一种独特的细胞核自噬类型,多种自噬相关蛋白参与调控PND过程。本研究从嗜热四膜虫中鉴定了ATG5自噬相关基因,对ATG5基因在PND过程中的功能进行了分析。主要结果如下:1.自噬相关基因ATG5生物信息学分析:基于人和酿酒酵母Atg5氨基酸序列,在嗜热四膜虫基因组数据库(http://***)中进行同源序列比对发现基因TTHERM0494030与人和酵母的Atg5蛋白同源,都具有APG5保守结构域。因此,预测TTHERM0494030基因为四膜虫自噬相关基因ATG5。系统发育分析表明,嗜热四膜虫Atg5蛋白与原生动物草履虫中Atg5蛋白的进化地位相近。对嗜热四膜虫自噬相关蛋白Atg5潜在的相互作用蛋白进行预测,发现其可能与核心自噬蛋白包括Atg8与Vps34存在相互作用。而Atg8和Vps34是嗜热四膜虫PND过程中重要的调控因子。之后,对ATG5基因表达图谱进一步分析发现ATG5在生长期、饥饿期和有性生殖时期均有表达,接合10 h时特异性高表达,而这一时间点对应于亲本大核PND阶段。这一结果暗示嗜热四膜虫自噬相关蛋白Atg5可能参与调控亲本大核PND过程。***5参与调控亲本大核PND过程:为了研究自噬蛋白Atg5在PND过程中的功能,构建了带有HA标签的过表达质粒pXS75-ATG5,利用基因枪转化至嗜热四膜虫中,通过巴龙霉素浓度梯度筛选获得过表达ATG5突变细胞株。亚细胞定位分析显示在有性生殖2 h、4 h和6 h,自噬相关蛋白Atg5均定位于细胞质中;8 h,Atg5开始定位于亲本大核上,直至亲本大核退化消失。经Cd诱导ATG5高效表达后,亲本大核核膜与自噬溶酶体的融合以及亲本大核酸化并未受到影响,但延缓了亲本大核整体凝缩降解,表明Atg5可能全程参与调控亲本大核的PND过程。为了进一步揭示Atg5在PND中的调控功能,我们构建了RNAi-ATG5敲减突变细胞株。有性生殖8 h,敲减ATG5引起19.4%的配对细胞中小核减数分裂产物降解受阻;有性生殖10 h,12.7%的配对细胞中亲本大核向细胞底部的迁移受到影响,同时亲本大核无法正常凝缩降解,无法正常酸化;有性生殖36 h,仍有22%的配对分离细胞中存在未降解的亲本大核。这些结果表明Atg5参与调控小核减数分裂产物和亲本大核的程序性降解。***5通过介导Atg8.2的定位以及脂化调控亲本大核的降解:Atg8是自噬体膜延伸和降解货物识别的关键因子,Atg8的招募和定位依赖于Atg12-Atg5-Atg16复合物。在本研究中,通过免疫共沉淀以及质谱分析,发现Atg5与Atg8.2存在相互作用,因此进一步构建了融合HA标签的过表达质粒pXS75-ATG8.2,间接免疫荧光定位分析,野生型和OE-ATG8.2的配对细胞中,Atg8.2被招募到亲本大核附近并逐渐定位到亲本大核核膜上。RNAi-ATG5突变细胞和OE-ATG8.2突变细胞配对,在亲本大核PND过程中,Atg8.2的招募受到影响,无法定位至亲本大核核膜上。为了进一步研究敲减Atg5对PND过程中Atg8.2功能的影响,通过Western Blot检测HA-Atg8.2和HA-Atg8.2-PE蛋白表达水平。结果表明,敲减Atg5后,Atg8.2的脂化显著受到影响。上述结果表明Atg5通过影响PND过程中Atg8.2的定位和脂化,进而参与调控亲本大核的降解。综上所述,本研究鉴定了嗜热四膜虫自噬相关基因ATG5,亚细胞定位分析Atg5在PND过程中定位于亲本大核,过量表达ATG5延缓了亲本大核整体凝缩降解,敲减ATG5引起细胞中小核减数分裂产物降解受阻,同时亦会阻碍PND过程中亲本大核向细胞底部迁移、酸化以及正常凝缩降解。进一步分析证实Atg5与Atg8.2存在相互作用,ATG5调控Atg8.2的脂化并进一步影响其在亲本大核上的定位。

关键词：自噬相关蛋白Atg5 选择性自噬细胞核程序性降解嗜热四膜虫

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嗜热四膜虫信息素家族基因在有性生殖中的功能分析

嗜热四膜虫信息素家族基因在有性生殖中的功能分析

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作者：乔心山西大学

学位级别：硕士

信息素(Gamone,GAM)是物种个体间传递信息的一种物质,具有通讯功能,由一个个体分泌到体外,作用于另一个个体从而让另一个个体表现出生理上、行为上的改变。信息素存在于从低等原核生物到高等真核生物等各个不同的生物中,在原生生物中,... 详细信息

信息素(Gamone,GAM)是物种个体间传递信息的一种物质,具有通讯功能,由一个个体分泌到体外,作用于另一个个体从而让另一个个体表现出生理上、行为上的改变。信息素存在于从低等原核生物到高等真核生物等各个不同的生物中,在原生生物中,其结构和类型具有较大的差异性。四膜虫(Tetrahymena thermophila)是原生生物中的一种模式生物,具有无性生殖和有性生殖方式,在有性生殖过程中,不同交配型四膜虫细胞通过相互碰撞来配对结合,然而具体的作用机制并不清楚。本研究鉴定了一组可能具有信息素的功能的基因,探究了其构成和功能分析。主要的研究结果如下:***1、GAM2的鉴定基于嗜热四膜虫大核基因组数据库,鉴定出9个GAM家族基因,GAM1(318bp)编码106个氨基酸,GAM2(339bp)编码112个氨基酸,两基因均无内含子。GAM1和GAM2在饥饿期上调表达,推测可能诱导了四膜虫的有性生殖。***1、GAM2敲减细胞株的构建构建重组质粒pNEO4-GAM1、pNEO4-GAM2。通过基因枪转化法将这两个重组载体分别转化到不同交配型嗜热四膜虫细胞B2086(II)、Cu427(VI)、Cu428(VII)中,通过巴龙霉素筛选法,获得四膜虫GAM1、GAM2的敲减细胞株KO-GAM1-Cu427、KO-GAM1-Cu428、KO-GAM1-B2086、KO-GAM2-Cu427、KO-GAM2-Cu428、KO-GAM2-B2086,KO-GAM1-Cu428和KO-GAM1-B2086的突变细胞株无法配对;KO-GAM2-Cu427和KO-GAM2-Cu428的突变细胞株无法配对。结果表明GAM1和GAM2调控嗜热四膜虫细胞有性生殖的启始过程***1在大肠杆菌中的融合表达突变大肠杆菌终止密码子TAA为四膜虫中的终止密码子TGA后,构建了切除信号肽后的重组质粒p SUMO-GAM1-ΔN42和pMBP-GAM1-ΔN42。转化大肠杆菌BL21后,0.1mmol/L IPTG,诱导表达出与SUMO和MBP融合表达的GAM1蛋白,SDS-PAGE结果分析发现:切除信号肽的重组质粒能够更好的表达蛋白,且MBP标签促进了GAM1蛋白在上清中的表达量。重组蛋白经Ni柱亲和纯化后获得电泳纯化的蛋白。GAM1蛋白可提高四膜虫交配起始阶段的配对识别。4.重组表达GAM1的大肠杆菌提高了对Cu和Cd的耐受性用不同浓度梯度的Cu和Cd处理细胞,重组大肠杆菌BL21/SUMO-GAM1和BL21/MBP-GAM1的增殖与Cu和Cd浓度呈负相关,随着Cu和Cd浓度的增加,重组大肠杆菌BL21/p SUMO-GAM1和BL21/pMBP-GAM1起提高了对铜离子和镉离子的耐受性。1 mmol/L Cu和400μmol/L Cd处理重组大肠杆菌BL21/pMBP-GAM1,表达有MBP-GAM1的细胞株增殖高于对照组,表明GAM的表达提高了细胞对重金属离子的抵抗。***1基因对环境的响应及突变体细胞构建与野生对照组相比,Cu和Ag诱导GAM1的表达量分别上调73倍和31.5倍;Ni和Cd的胁迫导致GAM1的表达量上调了32000倍和12000倍,然而温度和PH对GAM1表达量的影响不显著。构建重组质粒pNEO4-GAM1-GFP,其中含有绿色荧光蛋白GFP,并由GAM1独特的高效启动子进行启动,通过基因枪转化法将重组载体转化入嗜热四膜虫细胞中,获得含有绿色荧光基因的重组四膜虫细胞株GAM1-GFP-Cu428和GAM1-GFP-B2086,在Cd诱导时,表达产生含有绿色荧光的蛋白。总之,本研究从四膜虫中鉴定了GAM家族基因,对GAM1和GAM2在有性生殖过程中的功能进行初步分析;对GAM1进行了异源的表达和纯化,分析了蛋白功能。通过环境应激响应分析,发现了GAM1的强诱导型启动条件,构建了GAM启动子调控的GFP突变细胞株,为进一步筛选新型单细胞生物传感器奠定了基础。

关键词：信息素嗜热四膜虫有性生殖重金属离子

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嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1的功能分析

嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1的功能分析

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作者：杨茹霞山西大学

学位级别：硕士

错配修复是一种高度保守的DNA修复途径,在DNA复制、修复和基因重组过程中发挥着重要作用。在真核生物中,MutS识别DNA子链上的错配碱基并与之相结合,从而招募核酸内切酶MutL形成三元复合物。真核生物中包含三种MutL异二聚体复合物MutLα,... 详细信息

错配修复是一种高度保守的DNA修复途径,在DNA复制、修复和基因重组过程中发挥着重要作用。在真核生物中,MutS识别DNA子链上的错配碱基并与之相结合,从而招募核酸内切酶MutL形成三元复合物。真核生物中包含三种MutL异二聚体复合物MutLα,MutLβ,和MutLγ。Mlh1是MutL核心亚基,MutL复合物不仅参与DNA错配修复(MMR),而且在减数分裂基因重组中起到拆分异源双链DNA的作用。单细胞真核生物嗜热四膜虫包含两个细胞核,二倍体生殖小核(MIC)和多倍体体细胞核(MAC)。有性生殖过程中小核进行减数分裂,配子融合后经有丝分裂产生新大核和新小核并传递给后代。在减数分裂前期,DNA双链断裂(DSB)触发小核伸长,从而促进同源配对和交叉互换(CO)。新大核的基因组发育自合子核,但经历了内部序列删除(IES)和DNA多轮复制。前期我们的研究表明嗜热四膜虫错配修复蛋白Mlh3参与调控基因组复制、染色体分离及DNA删除,然而MutL核心亚基Tmlh1在其中发挥的作用并不清楚。本研究首次围绕嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1进行研究,获得主要结果如下:***1的鉴定和敲除突变体构建嗜热四膜虫错配修复蛋白TMLH1(TTHERM0127000)的基因全长4553 bp,开放阅读框2271 bp,编码756个氨基酸。TMLH1在四膜虫营养生长期和饥饿期低水平表达,在有性生殖2 h-4 h表达水平上调,然后下调,10 h后表达水平再次上调。构建了不同交配型的TMLH1敲除细胞株,突变体细胞增殖和传代时间延长。γ-H2A.X检测表明,突变体细胞DNA损伤修复效率降低。有性生殖配对率降低、发育过程迟缓且微核异常形成。结果表明,敲除TMLH1基因导致DNA损伤修复缺陷和基因组不稳定,影响细胞增殖和有性生殖起始。***1在嗜热四膜虫发育过程中具有不同的定位模式为研究四膜虫中Tmlh1蛋白的定位与功能,构建带有HA标签的Tmlh1过表达细胞株。免疫荧光定位显示,营养生长时期的小核具有强的定位信号,大核中存在微弱信号。在有性生殖前期,Tmlh1定位于生殖系小核及转录活跃的亲本大核。在核选择和anlagen时期,Tmlh1定位信号只存在于功能核上,并且从即将凋亡的小核和亲本大核上消失。在减数分裂和有丝分裂时期,Tmlh1同α-tubulin存在共定位,且形成纺锤丝结构;有性生殖后期,Tmlh1与Pdd1发生共定位,表明Tmlh1在四膜虫虫细胞发育的不同阶段具有多样化的功能。***1具有核酸内切酶活性Tmlh1蛋白N端(NTD;1-416)高度保守,包含保守ATP酶结构域;C端(CTD;492-756)相对保守,包含二聚体结合区S1 site、MIP盒因子结合位点S2 site、PCNA互作区PIP-box motif以及C末端同源基序CTH motif。Tmlh1结构模拟显示由柔性linker连接的NTD、CTD在空间上同MutL亚基形成二聚体复合物,呈现出MutL家族典型的哑铃状拓扑结构。优化密码子并合成TMLH1基因,构建重组质粒并经大肠杆菌表达,利用亲和层析柱纯化蛋白。酶切活性分析表明,体外条件下Tmlh1对ds DNA具有浓度依赖性、可被金属离子Cu刺激的独立核酸内切酶活性;ATP/ADP抑制该活性,并且金属离子的存在使抑制作用增强。***1互作因子分析为了研究嗜热四膜虫中Mlh3是否与Tmlh1形成功能性复合物MutLγ,我们分别用GST和6His-MBP标记Tmlh1与Mlh3,pull-down证明Tmlh1与Mlh3之间存在直接的相互作用,并且Tmlh1的C末端结构域可单独与Mlh3结合。进一步构建Tmlh1-ΔC10截短突变体。结果表明,CTH motif(残基746-756)的缺失导致Tmlh1蛋白稳定性降低,且影响了与Mlh3的相互作用。Tmlh1的CO-IP-MS结果显示,嗜热四膜虫体内存在多种Tmlh1互作因子,包括错配修复MutS家族蛋白,交叉互换因子Rad51、Dmc1,微管蛋白Atu1、Gtu1、新大核异染色质形成和组蛋白甲基转移酶Ezl1、染色质结构重塑因子Hmb1。综上所述,本研究首次鉴定出嗜热四膜虫错配修复蛋白Tmlh1,获得了TMLH1敲除突变体,免疫荧光定位发现Tmlh1具有多样化的定位模式。体外表达和纯化出Tmlh1蛋白,发现Tmlh1具有核酸内切酶活性。Tmlh1参与DNA同源重组、大核基因组重排及染色体的正确分离,从而维持四膜虫生长发育和有性生殖过程中基因组的稳定性。研究结果为进一步理解错配修复蛋白Mlh1在真核生物中的功能进化提供了重要理论基础。

关键词： Tmlh1 错配修复核酸内切酶同源重组嗜热四膜虫

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嗜热四膜虫中染色体浓缩调节因子RCC1的鉴定及功能分析

嗜热四膜虫中染色体浓缩调节因子RCC1的鉴定及功能分析

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作者：段文靖山西大学

学位级别：硕士

Ran (Ras-like nuclear protein)是一种在真核生物中高度保守的小分子GTPase蛋白,属于小G蛋白家族。Ran蛋白与不同的调节因子和辅助因子相互作用,参与核膜重建、纺锤体的组装、DNA复制、细胞周期的调节和核质间物质的运输等。Ran蛋白在... 详细信息

Ran (Ras-like nuclear protein)是一种在真核生物中高度保守的小分子GTPase蛋白,属于小G蛋白家族。Ran蛋白与不同的调节因子和辅助因子相互作用,参与核膜重建、纺锤体的组装、DNA复制、细胞周期的调节和核质间物质的运输等。Ran蛋白在其辅助蛋白的调控下进行RanGTP和RanGDP两种结合态之间不断循环转变,表现出功能的多样性。染色体浓缩调节因子RCC1 (regulator of chromosome condensation 1)是唯一已知的Ran的鸟嘌呤核苷酸交换因子,含有保守的RLD (RCC1-like domain)结构域,与Ran蛋白结合,促进Ran-GDP转变为RanGTP结合态,从而促进核质运输,同时在染色体端粒沉默、细胞周期的调控和微管的组装发挥重要功能。嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种营自由生活的淡水单细胞原生生物,具有核的二态性,即含有多倍体的体细胞大核和二倍体生殖小核。生殖方式主要有无性生殖和有性生殖两种方式。无性生殖时期,大核无丝分裂而小核进行有丝分裂;有性生殖时期,小核进行减数分裂和有丝分裂后进行核的交换进而形成合子核,产生新的大核和小核而旧大核降解。嗜热四膜虫细胞中核结构精细动态的变化使其成为研究细胞核结构和发育的良好模式生物。本课题组先前研究表明嗜热四膜虫中Ran和RanBP1蛋白调控了大核的无丝分裂,它们的异常表达会使细胞增殖速度变慢,但至今还没有发现关于嗜热四膜虫中RCC1蛋白的相关研究。本研究首次从嗜热四膜虫大核基因组中鉴定出一个新的RCC1基因,并在生物信息学水平和细胞分子水平进行了分析,研究结果如下：1.生物信息学分析通过同源序列比对,我们从四膜虫基因组数据库(http://***)鉴定了人的RCC1同源物TTHERM0530380基因,该基因全长2541 bp,开放阅读框2181 bp,预测编码726个氨基酸。对其氨基酸序列分析发现RCC1含有一个RLD结构域,将其编码基因命名为四膜虫RCC1。Real-timePCR检测RCC1的转录水平,发现RCCl在嗜热四膜虫不同细胞周期中都有表达,并在有性生殖时期表达水平达到最高。本研究结果与四膜虫功能基因组数据库(http://***)中该基因的microarray表达谱相一致,进一步证实了RCC1在四膜虫发育过程中的动态表达。聚类分析表明RCC1分子进化和物种进化相一致,表明了在生物进化过程中,RCC1蛋白具有保守的功能。2. HA-RCC1的细胞定位构建含有HA标签的重组质粒pXS75-RCC1,将pXS75-RCC1转入野生型的B2086和Cu428四膜虫细胞中,通过同源重组RCC1基因替代MTT1基因,RCC1在Cd2+诱导下受到MTT1基因启动子的调控,梯度增加巴龙霉素浓度筛选突变体细胞株,通过PCR鉴定获得整合HA-RCC1基因的突变体细胞株。HA单克隆抗体免疫荧光定位分析表明,在营养生长期,HA-RCC1特异地定位于大核和小核,饥饿时期同样定位于大核和小核中,在有性生殖时期,亲本大核和小核仍有定位。此外RCC1还定位于降解的旧大核上,直到亲本大核完全降解,表明RCC1是细胞核特异的功能因子。***1的过表达影响细胞核分裂在MTT1启动子调控下的HA-RCC1基因,通过不同浓度的Cd2+诱导,实现HA-RCC1基因的过表达。通过DAPI染料对过表达RCC1的细胞株中的细胞核进行染色,观察细胞核分裂的过程。分析过表达HA-RCC1对细胞发育的影响,结果显示RCC1过量表达导致细胞中大核无丝分裂异常,进而抑制了大核的无丝分裂,最终产生部分无大核的异常细胞。***1的敲减引起小核异常分裂为了进一步分析RCC1的功能,构建了RCC1基因敲除质粒pNeo4-RCC1, pNeo4-RCC1转化野生型四膜虫细胞,通过巴龙霉素浓度梯度筛选,细胞表型分配获得RCC1基因敲减突变体细胞株。结果表明RCC1基因对后代的发育是必须的。进一步分析RCCl敲减对细胞发育的影响,DAPI染色敲减RCC1细胞株,观察细胞核分裂的过程,发现发育的细胞中产生多个小核,大核无丝分裂受到抑制,而且抑制了细胞增殖速率。总之,本研究首次从嗜热四膜虫中鉴定出一个新的RCC1基因,RCC1的异常表达影响了细胞正常的核分裂,这种异常表型与Ran1的突变体GTP锁定态和GDP锁定态、异常表达RanBP1的表型是一样的,暗示RCC1可能通过改变Ran-GTP的浓度梯度,进而影响细胞的核发育。RCC1的正常表达对嗜热四膜虫细胞的增殖过程起到重要的调控作用。

关键词：染色体浓缩调节因子RCC1 嗜热四膜虫细胞定位核分裂

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不同分化形态的嗜肺军团菌对嗜热四膜虫BF1的感染和胞内增殖特征

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应用与环境生物学报 2006年第4期12卷 518-522页

作者：黄绍松白庆笙陆勇军徐润林中山大学生命科学学院生物化学系中山大学生命科学学院有害生物防治和资源利用国家重点实验室中山大学生命科学学院生物科学与技术系

嗜肺军团菌是一种广泛分布于淡水生态环境中的条件性胞内致病菌,其不同的分化形态与菌体的存活、感染力和毒力有密切关系.本文对不同分化形态的表达绿色荧光蛋白的嗜肺军团菌在不同感染复数(multiplicityofinfec-tion,MOI)下感染嗜热四... 详细信息

嗜肺军团菌是一种广泛分布于淡水生态环境中的条件性胞内致病菌,其不同的分化形态与菌体的存活、感染力和毒力有密切关系.本文对不同分化形态的表达绿色荧光蛋白的嗜肺军团菌在不同感染复数(multiplicityofinfec-tion,MOI)下感染嗜热四膜虫BF1株的条件以及胞内增殖的特征进行了研究.结果表明,胞内的军团菌比大肠杆菌有更强的抗消化能力,30℃时处于对数生长期的嗜肺军团菌即使在MOI等于100的情况下仍然在24h内被四膜虫消化殆尽,而平板培养至稳定期的菌体即使MOI只有50即可实现胞内增殖,并在18h内使宿主数量急剧下降.饲喂军团菌后,四膜虫都有一个数量先上升的过程,然后依MOI的不同呈现稳定或下降的趋势.本文还通过荧光显微镜观察描述了一定MOI下四膜虫对稳定期菌体的消化和形态变化的动态过程.

关键词：嗜肺军团菌嗜热四膜虫细胞分化胞内增殖

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