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抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性

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抗沉默因子Asf1调控嗜热四膜虫细胞核的稳定性

作者：陈波山西大学

学位级别：硕士

组蛋白分子伴侣能协助组蛋白参与染色质的组装和解凝,进而调控基因的表达,对核小体的组装解凝起到了重要作用。不同组蛋白分子伴侣对核小体装配解凝有不同的作用,进而影响核小体的稳定性、结构以及染色体状态,从而影响生物的发育过程。... 详细信息

组蛋白分子伴侣能协助组蛋白参与染色质的组装和解凝,进而调控基因的表达,对核小体的组装解凝起到了重要作用。不同组蛋白分子伴侣对核小体装配解凝有不同的作用,进而影响核小体的稳定性、结构以及染色体状态,从而影响生物的发育过程。高等真核生物细胞中组蛋白异二聚体H3/H4的分子伴侣Asfl(anti-silencing function 1,Asfl)参与依赖DNA复制及不依赖DNA复制的核小体装配,同时参与转录调控,基因沉默以及DNA损伤修复等过程,在不同生物中Asfl具有一定的功能保守性,同时进化出新的功能。嗜热四膜虫是一种重要的真核模式生物,细胞包含一个二倍体的生殖小核和—个多倍体的体细胞大核。在营养生长时期,嗜热四膜虫细胞小核进行有丝分裂,而大核进行无丝分裂;在有性生长时期,细胞进行配对,小核通过减数分裂和有丝分裂产生配子核,新大核通过合子核基因重排形成,亲本大核凋亡。四膜虫核的二态性及多样化的核发育形态成为研究组蛋白及其分子伴侣重要的模式体系。本研究对组蛋白分子伴侣Asfl在四膜虫细胞中的功能进行了系统分析,获得主要结果如下：1.嗜热四膜虫中ASFl基因生物信息学分析嗜热四膜虫ASF1(TTHERM0442300)基因全长756 bp,无内含子,预测编码的N端1-155位是保守的Asfl功能结构域,酸性C端区域参与调节功能,N端结构域序列同源进化树分析表明,Asfl的分子进化与物种进化基本一致。RT-PCR结果表明,ASF1在嗜热四膜虫的各个时期均有表达,并且在有性生殖4-6 h转录水平达到最高。2. HA-Asfl定位在大核和小核我们构建了重组质粒pNeo-HA-ASF1,并将其转化四膜虫细胞,巴龙霉素抗性条件下筛选得到稳定表达HA-Asfl的细胞株。通过免疫荧光定位分析表明,HA-Asfl在营养生长时期,饥饿时期以及有性生长时期定位于大核、小核以及新形成的大小核中,发育前期大核的信号更强,而到了Anlagen时期小核信号增强,而在即将凋亡的亲本大核中,定位信号逐渐减弱最后消失。3.过表达ASFl后核变大并影响细胞的增殖构建过表达pXS-ASF1重组质粒并将其转入野生型四膜虫细胞,通过巴龙霉素筛选,PCR鉴定,ASF1通过同源重组替代MTTl基因,使ASF1在Cd2+诱导下受MTTl启动子调控而过量表达Asfl。过表达ASF1后,免疫荧光定位分析HA-Asf1在四膜虫营养生长期、饥饿期和有性生长期定位于大核、小核以及新形成的大小核中。定位模式与在自身启动子调控下Asfl的定位模式基本一致。过表达ASF1细胞株的大核小核均出现核型变大,并抑制细胞增殖。4.敲减ASFl后导致大核形态异常及小核缺失构建敲除质粒pNeo-ASF1并转入野生型四膜虫细胞,通过巴龙霉素筛选,PCR鉴定,Neo4部分替代ASF1基因。敲减ASF1的细胞株筛选过程出现无小核细胞株,细胞生长抑制,不能进行正常的有性生殖过程和产生有性生殖后代。大核形态异常,部分细胞观察到有大核逐出体的存在。嗜热四膜虫Asf1是进化上保守的功能蛋白,含有保守的功能结构域。特异定位在不同发育阶段的转录活跃的大核和转录沉默的小核中,而在凋亡的大核中信号消失。过表达Asf1导致细胞核增大,而敲减ASF1的细胞株出现小核缺少,大核形态异常。结果表明嗜热四膜虫Asf1不仅参与功能大核和小核染色质的解凝和组装,而且它的正常表达对细胞核的形态和结构维持发挥重要的调控作用。

关键词： Asfl 嗜热四膜虫细胞定位核的稳定性

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多种药物对嗜热四膜虫生长影响的研究

多种药物对嗜热四膜虫生长影响的研究

作者：李文秋哈尔滨师范大学

学位级别：硕士

牛至精油、白点清、指环清、孢虫净均为杀灭水产养殖生物寄生虫的常见药物,其作用的代谢过程和分子机制较为复杂,有待进一步探索。牛至精油为天然植物提取物,作用范围较广且成分较为清晰,是研究植物提取剂对寄生虫影响分子机制的良好材... 详细信息

牛至精油、白点清、指环清、孢虫净均为杀灭水产养殖生物寄生虫的常见药物,其作用的代谢过程和分子机制较为复杂,有待进一步探索。牛至精油为天然植物提取物,作用范围较广且成分较为清晰,是研究植物提取剂对寄生虫影响分子机制的良好材料。本研究以单细胞模式原生动物嗜热四膜虫作为实验对象,通过测定其细胞密度,判断牛至精油等四种药物对嗜热四膜虫的生长影响,并利用转录组测序方法,从细胞及基因层次分析牛至精油影响嗜热四膜虫生长的可能作用机制,本研究的主要结果如下:(1)绘制嗜热四膜虫的生长曲线,测定其在正常培养条件下达到生长平台期为48h,细胞生长密度约为130万cells/m L,并以对数生长初期(～12万cells/m L)的嗜热四膜虫细胞群体密度作为后续药物处理时的细胞初始密度。(2)将嗜热四膜虫暴露于一系列不同浓度的牛至精油、白点清、指环清、孢虫净药物溶液中,曲线结果表明牛至精油等四种药物均对嗜热四膜虫的生长有抑制作用。牛至精油、白点清、指环清、孢虫净作用下嗜热四膜虫24h EC值分别为2.16×10g/m L,3.57×10g/m L,7.75×10g/m L,1.41×10g/m L。(3)对牛至精油作用下0 h和24 h的嗜热四膜虫的基因表达情况进行分析,根据高通量转录组测序结果,GO功能富集和KEGG通路分析发现,特异上调差异表达基因无功能富集,特异下调差异表达基因功能主要富集在RNA加工、蛋白质分解代谢、细胞定位和信号转导等过程。特异下调差异表达基因主要涉及细胞自噬及细胞周期等通路。而这些过程或通路上基因表达水平的下调可能会抑制细胞的生长。(4)根据牛至精油作用下嗜热四膜虫相关基因表达变化和通路分析,绘制了其影响嗜热四膜虫细胞生长的可能模型,为探讨不同药物影响细胞生长的分子调控机理提供线索,有助于理解和认识杀虫药物对细胞生长调控的作用。

关键词：杀虫药物牛至精油嗜热四膜虫转录组差异表达基因

嗜热四膜虫——具有发展潜力的功能基因组学研究模型

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生命科学 2006年第5期18卷 447-451页

作者：杨秋峰刘永杰南京农业大学动物疫病与免疫重点开放实验室南京210095

在真核生物的分子生物学和遗传学研究方面,纤毛类原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)已经被证明是一种有价值的生物学模型。通过对它的研究,人们发现并且掌握了核酶的分子机制、RNA的自我拼接、端粒的结构和功能、DNA序列重组... 详细信息

在真核生物的分子生物学和遗传学研究方面,纤毛类原生动物嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)已经被证明是一种有价值的生物学模型。通过对它的研究,人们发现并且掌握了核酶的分子机制、RNA的自我拼接、端粒的结构和功能、DNA序列重组等机理。这种原生动物的基因组功能分别由两个细胞核执行,即二倍体的小核与生殖过程有关,而多倍体的大核决定细胞的基因转录,并为转化基因的表达提供了强有力的手段。

关键词：嗜热四膜虫功能基因组学表达体系

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姜黄素对嗜热四膜虫的氧化应激、凋亡诱导及线粒体损伤作用

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四川师范大学学报（自然科学版） 2022年第3期45卷 394-401页

作者：葸灵娟张梦玘林志康赵宇侠上海中医药大学研究生院上海200120 上海健康医学院医学技术学院上海201138

以嗜热四膜虫为模式生物从氧化应激、凋亡及线粒体损伤作用探讨姜黄素的毒性效应,为姜黄素用药及生态安全提供依据.急性毒性实验:姜黄素(0.625、1.25、2.5μg/mL)作用四膜虫2 h,通过快速细胞分析仪计数细胞,光学显微镜观察细胞形态变化... 详细信息

以嗜热四膜虫为模式生物从氧化应激、凋亡及线粒体损伤作用探讨姜黄素的毒性效应,为姜黄素用药及生态安全提供依据.急性毒性实验:姜黄素(0.625、1.25、2.5μg/mL)作用四膜虫2 h,通过快速细胞分析仪计数细胞,光学显微镜观察细胞形态变化;氧化应激:荧光酶标仪检测细胞内活性氧(ROS)水平及乳酸脱氢酶活性(LDH);线粒体损伤:JC-1探针法检测线粒体膜电位(MMP)的变化;凋亡实验:Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染流式细胞仪检测细胞凋亡率.实验结果显示,姜黄素对四膜虫的毒性呈剂量依赖效应,0.625、1.25、2.5μg/mL分别抑制了16%、32%、37%,2.5μg/mL处理组细胞形态发生显著变化;此外1.25、2.5μg/mL处理组的细胞内ROS分别增加了35%、44%(P膜通透性,与对照组相比分别增加了10%、17%、45%.2.5μg/mL的姜黄素处理组能够引起线粒体膜电位(MMP)去极化(P嗜热四膜虫存在毒性作用,抑制细胞增殖,并通过氧化应激作用破坏细胞膜,增加细胞膜通透性,2.5μg/mL的姜黄素能够诱导四膜虫细胞凋亡并伴随线粒体损伤,暗示姜黄素可能通过激活线粒体途径诱导嗜热四膜细胞的凋亡.

关键词：嗜热四膜虫姜黄素细胞凋亡线粒体活性氧

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利用微量热法研究镉和铜对嗜热四膜虫的毒性效应

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利用微量热法研究镉和铜对嗜热四膜虫的毒性效应

秋水仙素对嗜热四膜虫接合生殖期间皮层骨架蛋白主要组分影响的研究

中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会

作者：陈小娟沈韫芬刘义冯伟松缪炜中国科学院水生生物研究所中国科学院水生生物研究所武汉大学化学与分子科学学院中国科学院水生生物研究所中国科学院水生生物研究所

＜正＞生物体的生命活动伴随着代谢热的产生,用足够灵敏度的微量热计可直接测量细胞的代谢活性,得到细胞整个代谢过程的热活性信息。微量热法具有良好的重现性,在各种物质和实验条件对代谢的影响的研究中非常有效,将成为生态和环境毒... 详细信息

＜正＞生物体的生命活动伴随着代谢热的产生,用足够灵敏度的微量热计可直接测量细胞的代谢活性,得到细胞整个代谢过程的热活性信息。微量热法具有良好的重现性,在各种物质和实验条件对代谢的影响的研究中非常有效,将成为生态和环境毒理学研究中新的有力工具。

关键词：嗜热四膜虫微量热法毒性效应

来源： cnki会议评论

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秋水仙素对嗜热四膜虫接合生殖期间皮层骨架蛋白主要组分影响的研...

利用抑制性差减杂交技术（SSH）构建嗜热四膜虫DDT胁迫差减文库

上海市动物学会1999年年会

作者：李书强庞延斌华东师范大学生物系华东师范大学生物系

该文以交配型嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）BF株亚系BF1、BF5细胞为材料,培养到对数生长期,饥饿处理后混合,此时在饥饿液中加入秋水仙素母液,使其最终浓度为10-4mol/L。通过显微观察,并结合生化抽提和SDS-PAGE,我们着重分析嗜... 详细信息

该文以交配型嗜热四膜虫（Tetrahymena thermophila）BF株亚系BF1、BF5细胞为材料,培养到对数生长期,饥饿处理后混合,此时在饥饿液中加入秋水仙素母液,使其最终浓度为10-4mol/L。通过显微观察,并结合生化抽提和SDS-PAGE,我们着重分析嗜热四膜虫 BF1和BF5在接合过程中形态方面的变化以及在接合膜形成期和动核交换期其皮层骨架蛋白主要组分的变化。实验发现,受影响严重的少量虫体甚至会变成球形,丧失接合能力。在皮层骨架蛋白变化方面,经秋水仙素处理后的蛋白样品中,65KD和91KD消失,38KD、 46KD和49KD与同一时期正常蛋白样品相比,含量明显降低,而55KD、76KD和85KD含量变化不大,由于秋水仙素是微管解聚剂,这些现象进一步证实了嗜热四膜虫皮层骨架蛋白的重要组分-微管蛋白确实存在有稳定型和非稳定型两种,特别是非稳定型微管蛋白在嗜热四膜虫形态发生过程中有着重大意义。

关键词：秋水仙素嗜热四膜虫皮层骨架蛋白接合生殖

来源： cnki会议评论

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利用抑制性差减杂交技术（SSH）构建嗜热四膜虫DDT胁迫差减文库

环境相关浓度三氯生和三氯卡班暴露对嗜热四膜虫体内抗氧化酶活力的影响

中国动物学会原生动物学分会第十二次学术讨论会

作者：缪炜万明亮傅诚杰吴海中国科学院水生生物研究所中国科学院水生生物研究所中国科学院水生生物研究所复旦大学遗传所

＜正＞由于持久性有机污染物（POPs）在环境中的高持留性和具有高度的亲脂性,可借助空气吸入,水生和陆生食物链传递,对水生态系统的生物多样性和人类自身健康

关键词： DDT SSH 嗜热四膜虫致毒机理毒性评价

来源： cnki会议评论

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环境与健康杂志 2013年第12期30卷 1048-1050页

作者：高礼程鹏白琦锋张海谋袁涛上海交通大学环境科学与工程学院上海200240 宁夏大学资源环境学院湖北大学生命科学学院

目的研究两种抗菌剂三氯生(triclosan,TCS)和三氯卡班(triclocarban,TCC)在环境相关浓度水平对嗜热四膜虫体内抗氧化酶活力的影响。方法将处于对数生长期的嗜热四膜虫分别暴露于0(对照)、0.1、100μg/L的TCS和TCC培养24 h,测定嗜热四膜... 详细信息

目的研究两种抗菌剂三氯生(triclosan,TCS)和三氯卡班(triclocarban,TCC)在环境相关浓度水平对嗜热四膜虫体内抗氧化酶活力的影响。方法将处于对数生长期的嗜热四膜虫分别暴露于0(对照)、0.1、100μg/L的TCS和TCC培养24 h,测定嗜热四膜虫体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)和乳酸脱氢酶(LDH)的活力。结果与对照组比较,各浓度TCS和TCC暴露均可诱导嗜热四膜虫体内SOD活力明显升高(P嗜热四膜虫体内CAT和GST活力均明显升高(P嗜热四膜虫产生抗氧化应激。

关键词：三氯生三氯卡班嗜热四膜虫超氧化物歧化酶过氧化氢酶谷胱甘肽-S转移酶乳酸脱氢酶环境相关浓度

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含荧光素酶四膜虫B2086-LUC全细胞生物传感器的构建及其对重金属离子的响应

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中国环境科学 2013年第6期33卷 1075-1080页

作者：张鹏幸许静卢剑功王伟山西大学生物技术研究所化学生物学与分子工程教育部重点实验室山西太原030006

为了获得可用于快速检测环境中重金属污染的全细胞生物传感器,本研究将含有HA标签的萤火虫荧光素酶(LUC)基因重组到含有四膜虫金属硫蛋白MTT1启动子和微管蛋白终止子序列的载体pBX中,获得重组质粒pBX-LUC,用基因枪粒子轰击法将pBX-LUC... 详细信息

为了获得可用于快速检测环境中重金属污染的全细胞生物传感器,本研究将含有HA标签的萤火虫荧光素酶(LUC)基因重组到含有四膜虫金属硫蛋白MTT1启动子和微管蛋白终止子序列的载体pBX中,获得重组质粒pBX-LUC,用基因枪粒子轰击法将pBX-LUC转化入四膜虫细胞中,通过同源重组和巴龙霉素抗性筛选,LUC基因整合到四膜虫大核基因组MTT1位点,获得含有LUC基因的细胞株B2086-LUC.B2086-LUC对重金属镉和汞的响应敏感,可检测的最低浓度为5-10ng/mL;对铜和锌的响应较弱,可检测的最低浓度为0.5-1mg/mL.因此,四膜虫B2086-LUC可作为环境中镉和汞污染快速检测的全细胞生物传感器.

关键词：萤火虫荧光素酶嗜热四膜虫镉汞生物传感器

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