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周期型马来丝虫复合表位基因的构建及在真核细胞中的表达

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中华地方病学杂志 2022年第4期41卷 277-283页

作者：陆施娟蒋晗夏瑜椰方政南通大学医学院医学形态学实验室南通226000

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因(CPI502/GAPDH720)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并观察其在人宫颈癌细胞(Hela细胞)中的蛋白表达。方法根据T细胞表位预测的基因序列设计引... 详细信息

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶复合表位基因(CPI502/GAPDH720)真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并观察其在人宫颈癌细胞(Hela细胞)中的蛋白表达。方法根据T细胞表位预测的基因序列设计引物,以质粒pGEM-T-CPI621为模版,利用反转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,将该片段克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)-BmCPI502。根据软件设计合适引物,RT-PCR分别扩增BmCPI502基因和BmGAPDH720基因,pcDNA3.1(+)、BmCPI502、BmGAPDH720分别进行双酶切后进行连接,构建复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720。将复合表位基因重组质粒转染至Hela细胞后,进行RT-PCR验证,获得与预期相符目的条带;将表达产物利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。结果获得了原核表达重组质粒pET28a(+)-BmCPI502,经酶切鉴定得到502 bp特异性片段,与预期值符合;成功构建了复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,酶切鉴定所产生的片段大小与预期符合;复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720转染Hela细胞后得到稳定表达,SDS-PAGE鉴定分析显示重组蛋白相对分子质量(Mr×10^(3))约为50。结论成功构建了周期型马来丝虫复合表位基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI502/BmGAPDH720,并在真核细胞中获得相应的重组蛋白,为进一步研究重组蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。

关键词：周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂 3-磷酸甘油醛脱氢酶重组表位基因

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周期型马来丝虫在长爪沙鼠体内的移行和分布

Current Zoology 1981年第2期27卷 198-199页

作者：朱素贞钟永良张选明饶忠秀郑德福刘美涛卢素惠四川省寄生虫病防治研究所

将含有一定量马来丝虫(Wuchereria malayi)微丝蚴的长爪沙鼠腹腔液混入猴血,喂养实验室驯化的中华按蚊,待幼虫在蚊体内成熟后,用贝氏法分离、计数,按种于雄性沙鼠的一侧腹股沟皮下,每鼠89—156条,然后于1/2小时至256天不同时间解剖61只... 详细信息

将含有一定量马来丝虫(Wuchereria malayi)微丝蚴的长爪沙鼠腹腔液混入猴血,喂养实验室驯化的中华按蚊,待幼虫在蚊体内成熟后,用贝氏法分离、计数,按种于雄性沙鼠的一侧腹股沟皮下,每鼠89—156条,然后于1/2小时至256天不同时间解剖61只沙鼠,分离计数各组织的幼虫(计878条),详细观察不同时间丝虫在沙鼠体内的移行和分布。

关键词：周期型马来丝虫幼虫淋巴管对侧腹股沟长爪沙鼠淋巴组织淋巴系统

周期型马来丝虫人工感染长爪沙鼠所致淋巴系病变的观察

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Current Zoology 1981年第2期27卷 199-200页

作者：钟永良朱素贞张选明饶忠秀郑德福刘美涛卢素惠四川省寄生虫病防治研究所

有关周期型马来丝虫(Wuchereria malayi)引起的肉眼可见病理变化,至今未见报告。现将我们用周期型马来丝虫人工感染长爪沙鼠后在淋巴系出现的肉眼可见的病理变化简报于下。每鼠经右侧腹股沟皮下注射周期型马来丝虫感染期幼虫89—169条... 详细信息

有关周期型马来丝虫(Wuchereria malayi)引起的肉眼可见病理变化,至今未见报告。现将我们用周期型马来丝虫人工感染长爪沙鼠后在淋巴系出现的肉眼可见的病理变化简报于下。每鼠经右侧腹股沟皮下注射周期型马来丝虫感染期幼虫89—169条,共注射53只沙鼠。分别在注射后240、330、543天处死沙鼠,在未用染料作皮内注射的情况下,对有关淋巴管、结进行解剖观察。在解剖观察的53只(在接种后225天内眶窦血内微丝蚴阳性者45只)沙鼠中有25只出现病理变化。病变率为47.2％。

关键词：淋巴系周期型马来丝虫淋巴结肿大长爪沙鼠病变淋巴管淋巴系统人工感染

周期型马来丝虫M29表位基因原核及真核表达载体的构建

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中华传染病杂志 2015年第6期33卷 360-362页

作者：徐倩吴佳倩张波陶然刘芹陆施娟方政南通大学杏林学院医学部 226001 南通大学医学院病原学系

淋巴丝虫病是一种严重危害人类健康的虫媒传染病，流行于81个国家和地区。全球超过7600万人隐性感染，并伴有内部淋巴系统和肾脏系统的隐性损伤；约4400万人反复感染，并伴有肾功能异常。虽然淋巴丝虫病的防治在全球范围内已取得巨大成... 详细信息

淋巴丝虫病是一种严重危害人类健康的虫媒传染病，流行于81个国家和地区。全球超过7600万人隐性感染，并伴有内部淋巴系统和肾脏系统的隐性损伤；约4400万人反复感染，并伴有肾功能异常。虽然淋巴丝虫病的防治在全球范围内已取得巨大成绩，但由于全球气候变暖，传播媒介广泛存在，人口流动加快、大量外来流动人口的涌入，尤其是沿海经济发达地区，外来务工者中有较多微丝蚴阳性者，外源输入的可能性及丝虫病流行的危险因素始终存在。

关键词：周期型马来丝虫真核表达载体表位基因淋巴丝虫病原核全球气候变暖外来流动人口经济发达地区

周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的克隆与真核表达

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中国地方病学杂志 2008年第6期27卷 609-612页

作者：谢东方方政黄为群沈勤童海燕徐邦生南通大学医学院寄生虫学教研室 226001

目的克隆和表达周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶（BmGAPDH）的编码基因。方法依据公布的BmGAPDH基因序列设计引物，以周期型马来丝虫总RNA为模板，反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后，克隆至载体pGEM-TEasy中，... 详细信息

目的克隆和表达周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶（BmGAPDH）的编码基因。方法依据公布的BmGAPDH基因序列设计引物，以周期型马来丝虫总RNA为模板，反转录PCR（RT-PCR）扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后，克隆至载体pGEM-TEasy中，经PCR和双酶切鉴定后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋），构建真核表达载体pcDNA3．1（＋）／BmGAPDH，转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）对获得重组蛋白（rBmGAPDH）进行分析和鉴定。结果转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA，根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的结果一致。SDS-PAGE分析显示重组蛋白rBmGAPDH相对分子质量（Mr）约为43000。结论成功进行了BmGAPDH编码基因的克隆和真核表达。

关键词：周期型马来丝虫 3-磷酸甘油醛脱氢酶真核表达载体 COS-7细胞

周期型马来丝虫HSP70基因原核表达载体的构建及表达产物的分析

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中国地方病学杂志 2006年第5期25卷 494-496页

作者：方政吴建军陈阳黄为群姜声扬石佑琴南通大学基础医学院寄生虫学教研室 226001

目的在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70（HSP70）基因，并对表达产物进行SDS—PAGE分析。方法以重组质粒pGEM—T—HSP70为模板，根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物，用PCR法扩增HSP70基因（包括完整开放读... 详细信息

目的在大肠埃希菌宿主系统中表达周期型马来丝虫热休克蛋白70（HSP70）基因，并对表达产物进行SDS—PAGE分析。方法以重组质粒pGEM—T—HSP70为模板，根据报道的HSP70基因序列设计合成一对引物，用PCR法扩增HSP70基因（包括完整开放读码框架片段及其上下游序列共长2198bp），PCR产物定向插入原核表达载体pGEX-4T-3中，构建的重组质粒pGEX-4T-3-HSP70经双酶切鉴定。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3），用IPTG诱导***融合蛋白的表达。经SDS—PAGE分析并经凝胶图像分析确定目的蛋白的表达水平。结果重组表达质粒pGEx-4lT-3-HSP70全长约7200bp，经双酶切后应得到长度为4968bp的载体和2198bp的目的基因2个片段，1％琼脂糖凝胶电泳显示结果同预期完全相符。HSP70相对分子质量（Mr）为70×10^3，质粒pGEX-4T-3的融合部分（***）表达产物的胁约为26×103，将重组质粒转化BL-21（DE3）菌。经IPTG诱导表达，菌体蛋白的SDS—PAGE图谱显示，诱导组出现特异性蛋白表达条带，其Mr约100×10^3，与预计大小相同。目的蛋白占菌体总蛋白的12％左右。结论成功地构建了重组原核表达载体pGEX一4T一3-HSP70：周期型马来丝虫HSP70基因可在大肠埃希菌中稳定表达，为制备和纯化表达蛋白以及丝虫病疫苗的进一步研究打下基础。

关键词：周期型马来丝虫热休克蛋白质70 基因重组基因表达

周期型马来丝虫GAPDH部分编码基因原核及真核表达载体的构建

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现代预防医学 2010年第22期37卷 4304-4306+4311页

作者：张赛楠方政童海燕方浩谢东方黄为群徐邦生南通大学医学院寄生虫学教研室

[目的]构建我国流行的周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)部分编码基因原核和真核表达质粒以及基因序列分析,为进一步的研究奠定基础。[方法]根据GeneBank中马来丝虫GAPDH基因的已知序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,... 详细信息

[目的]构建我国流行的周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmGAPDH)部分编码基因原核和真核表达质粒以及基因序列分析,为进一步的研究奠定基础。[方法]根据GeneBank中马来丝虫GAPDH基因的已知序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠杆菌(***)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmGAPDH,经测序验证,并进行同源性比较。亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcD-NA3.1(+)-BmGAPDH,转染COS-7细胞后进行RT-PCR验证。[结果]RT-PCR扩增出一条约877 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%。转染的COS-7细胞高水平表达BmGAPDH的mRNA,根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的一致。[结论]成功构建了周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶部分编码基因原核及真核表达载体,为进一步功能研究提供了条件。

关键词：周期型马来丝虫 3-磷酸甘油醛脱氢酶真核表达载体 COS-7细胞

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆及序列分析

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现代预防医学 2007年第13期34卷 2426-2428页

作者：黄为群方政陈阳姜声扬吴建军谢东方江苏南通大学医学院寄生虫学教研室南通 226001 江苏南通大学医学院寄生虫学教研室

[目的]克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease of periodic Brugiamalayi,BmCP)基因到原核载体中,测定其序列,为进一步的研究奠定基础。[方法]从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增出BmCP... 详细信息

[目的]克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease of periodic Brugiamalayi,BmCP)基因到原核载体中,测定其序列,为进一步的研究奠定基础。[方法]从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增出BmCP基因序列,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌(***)DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性重组质粒pMD18-T-BmCP,经测序验证,并进行同源性比较。[结果]RT-PCR扩增出一条约1201bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%。[结论]成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T克隆载体,为进一步研究该基因的功能提供了条件。

关键词：周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因克隆序列分析

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周期型马来丝虫基因稳定转染细胞株的建立

现代预防医学 2015年第21期42卷 3952-3954+3958页

作者：陆施娟徐倩徐邦生方政南通大学医学院形态学实验室

目的将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Bm-CPI)基因的重组质粒pc DNA3.1(+)-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞(Hela细胞)获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法将成功构建的重组质粒pc DNA3.1(+)-Bm-CPI转染Hela细胞... 详细信息

目的将含周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Bm-CPI)基因的重组质粒pc DNA3.1(+)-Bm-CPI转染人宫颈癌细胞(Hela细胞)获得重组质粒稳定转染细胞株,为重组蛋白的获得提供基础。方法将成功构建的重组质粒pc DNA3.1(+)-Bm-CPI转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,通过RT-PCR和SDS-PAGE鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果重组真核表达质粒pc DNA3.1(+)-Bm-CPI转染Hela细胞后,d 14可见G418抗性细胞株开始形成。G418抗性Hela细胞株筛选、扩大培养后RT-PCR扩增出621bp左右的目的条带;SDS-PAGE检测获得了明显的目的条带。结论实验证实pc DNA3.1(+)-Bm-CPI重组质粒被成功转入Hela细胞,并获得稳定表达;为进一步研究Bm-CPI表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。

关键词：周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂转染细胞株