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吡咯伯克霍尔德氏菌B1213产葡聚糖酶条件的优化

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中国食品学报 2023年第4期23卷 168-180页

作者：魏莱程睿文王富强徐一人马景浩崔梓豪马艳莉徐江琪田进英范光森北京工商大学食品与健康学院北京100048 北京工商大学、北京市食品添加剂工程技术研究中心北京100048 南阳理工学院、河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室河南南阳473004 北京工商大学食品风味化学北京市重点实验室北京100048

以吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为研究对象,优化其发酵产葡聚糖酶条件。首先,通过单因素实验对其培养条件(碳源种类、碳源粒度、碳源质量浓度、氮源种类、氮源质量浓度、转速、温度、装液量、接种量、初始pH值、表面活性剂种类、表面活性剂... 详细信息

以吡咯伯克霍尔德氏菌B1213为研究对象,优化其发酵产葡聚糖酶条件。首先,通过单因素实验对其培养条件(碳源种类、碳源粒度、碳源质量浓度、氮源种类、氮源质量浓度、转速、温度、装液量、接种量、初始pH值、表面活性剂种类、表面活性剂质量浓度和时间)进行初步优化,然后通过Plackett-Burman试验,筛选出4个显著影响B1213产葡聚糖酶的因素,再利用最陡爬坡试验确定其产葡聚糖酶的最大响应区域,最后通过Box-Behnken试验设计确定其最优产葡聚糖酶条件为:40~60目麦麸质量浓度50 g/L,酵母浸粉质量浓度8 g/L,初始pH 6.6,装液量30 mL/250 mL,接种量0.15%,曲拉通100质量浓度25 g/L,温度30℃,转速160 r/min和培养时间83 h。在此培养条件下B1213产葡聚糖酶活力达到1230 U/mL。研究结果为细菌B1213在白酒酿造中的应用提供理论基础。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌葡聚糖酶响应面法发酵条件麦麸

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树根际微生物数量及功能多样性的影响

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林业科学 2016年第5期52卷 126-133页

作者：任嘉红李浩刘辉叶建仁吴小芹南京林业大学林学院南京210037 长治学院生物科学与技术系长治046011

【目的】为揭示生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007进入自然环境后对周围的微生态因子是否存在威胁,对其进入自然环境后的微生态效应和生物安全性做出正确评估。【方法】采用固体平板法研究JK-SH007菌株对美洲黑杨盆栽苗土壤微生物种群... 详细信息

【目的】为揭示生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007进入自然环境后对周围的微生态因子是否存在威胁,对其进入自然环境后的微生态效应和生物安全性做出正确评估。【方法】采用固体平板法研究JK-SH007菌株对美洲黑杨盆栽苗土壤微生物种群数量的影响,对4种主要土壤酶(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脱氢酶、转化酶)的活力进行测定,并通过Biolog ECO微孔板法分析JK-SH007菌株对美洲黑杨土壤功能多样性的影响。【结果】从整体趋势来看,在美洲黑杨根际引入JK-SH007菌株后,随着时间延长,根际土壤中的细菌、放线菌、真菌数量逐渐高于对照,且差异显著,在接种后150天接种处理达到峰值(3.36×109cfu·g^(-1)干土;7.50×107cfu·g^(-1)干土;1.14×107cfu·g^(-1)干土),随后显著降低,但仍优于未接种处理;JK-SH007处理后土壤酶活性均有所增强,土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、脱氢酶、转化酶活性均大于对照,其中,接种对碱性磷酸酶、转化酶活性的促进最为明显;根际土壤中微生物的AWCD值(除了在接种后30,90天时),接种处理和未接种处理的AWCD值相当,几乎持平;而接种后10,20,60,120,150,180天时接种处理土样微生物的AWCD值均高于CK;土壤微生物多样性(Shannon指数、Simpson指数和Mc Intosh指数)在接种前期没有明显的规律性,与对照几乎持平,120,150,180天时,接种JK-SH007处理的Simpson指数、Shannon指数、Mc Intosh指数均高于对照,但差异不显著。【结论】在根际引入JK-SH007对美洲黑杨根际土壤微生物的整体活性和功能多样性的提高有一定的促进作用,在一定程度上丰富了土壤微生物种群,有利于保持和促进土壤肥力和健康状况,但这些影响随着时间的延长而减弱;同时也说明JK-SH007菌株的施入不会对环境中土著微生物构成威胁或威胁较小,符合Bcc菌的安全应用范围,进一步证明该菌株的生物安全性,为将来该菌株的野外应用及生防菌剂的开发奠定基础。

关键词：美洲黑杨吡咯伯克霍尔德氏菌微生物种群安全性

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007吲哚-3-乙酰胺IAA合成功能及其依赖途径鉴定

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林业科学 2019年第9期55卷 121-129页

作者：刘婉慧陈飞飞叶建仁王朝恩康熠付欢欢南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京林业大学林学院

【目的】探索吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)合成生长素吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)的能力,并阐明*** JK-SH007存在色氨酸依赖型的吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide, IAM)IAA合成途径。【方法】使用Salkowski比色法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行L-色氨酸对*** JK-SH007合成IAA能力影响的检测;以*** JK-SH007全基因组为模板,设计特异性引物克隆iaaM和iaaH基因,并使用生物信息学方法对其蛋白质和亲缘关系进行分析;通过实时荧光定量PCR方法分析*** JK-SH007中的iaaM和iaaH基因在L-色氨酸处理下的差异表达。【结果】*** JK-SH007菌株能够合成15.663μg·mL-1的IAA,在以L-色氨酸为前体的条件下其合成IAA的量显著增加,达到了44.404μg·mL-1。iaaM和iaaH基因均含有一个完整的开放阅读框,其中iaaM基因全长1 782 bp,编码593个氨基酸,属于Aminooxidase super family家族;iaaH基因全长1 368 bp,编码455个氨基酸,属于Amidase super family家族。在L-色氨酸的处理下,*** JK-SH007中的iaaM和iaaH基因的表达量均显著增加。【结论】*** JK-SH007具有合成IAA的能力,L-色氨酸对其合成IAA具有显著促进作用,且克隆得到了iaaM和iaaH基因,其在进化上具有一定的保守性,证明*** JK-SH007中存在吲哚-3-乙酰胺IAA合成途径。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌吲哚-3-乙酸吲哚-3-乙酰胺途径色氨酸2-单加氧酶基因吲哚乙酰胺水解酶基因

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵条件及其对杨树溃疡病的防治效果

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中国生物防治 2010年第3期26卷 300-306页

作者：任嘉红班虎栋叶建仁李浩南京林业大学森林资源与环境学院南京210037 长治学院生物科学与技术系长治046011

本文研究了拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia pyrrocinia菌株JK-SH007产抗菌物质的最佳发酵条件及其对杨树溃疡病的野外防治效果。结果表明,牛肉膏、蛋白胨是发酵培养基中最佳营养物质,有利于菌株JK-SH007抗菌物质的产生;培养基... 详细信息

本文研究了拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia pyrrocinia菌株JK-SH007产抗菌物质的最佳发酵条件及其对杨树溃疡病的野外防治效果。结果表明,牛肉膏、蛋白胨是发酵培养基中最佳营养物质,有利于菌株JK-SH007抗菌物质的产生;培养基初始pH、培养时间、温度、培养体积、不同牛肉膏、蛋白胨组合等对菌株生长及其抗菌物质的产生有明显的影响,初始pH7、牛肉膏2g、蛋白胨20g、以1/2装液量装液、30℃振荡培养36h可获得较高产量的胞外分泌型抗菌物质;菌株JK-SH007的发酵液对杨树溃疡病的野外防效可达40.54%。

关键词：杨树溃疡病吡咯伯克霍尔德氏菌抗菌物质发酵防治效果

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆及表达分析

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南京林业大学学报（自然科学版） 2018年第4期42卷 127-133页

作者：陈飞飞黄金思王翕韫刘婉慧叶建仁南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京林业大学林学院江苏南京210037

【目的】克隆吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)多聚半乳糖醛酸酶基因(BpPG),并阐明Bp PG基因在*** JK-SH007定殖中的生物学功能。【方法】通过设计特异性引物(PG-F、PG-F)克隆Bp PG基因,并对其全长基因进... 详细信息

【目的】克隆吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007(Burkholderia pyrrocinia JK-SH007)多聚半乳糖醛酸酶基因(BpPG),并阐明Bp PG基因在*** JK-SH007定殖中的生物学功能。【方法】通过设计特异性引物(PG-F、PG-F)克隆Bp PG基因,并对其全长基因进行生物信息学分析;采用MEGA 5.0软件进行系统发育树分析;将*** JK-SH007接种杨树,利用实时荧光定量PCR方法,分析Bp PG基因在*** JK-SH007定殖过程中的差异表达。【结果】Bp PG基因全长2 001 bp,编码666个氨基酸,预测蛋白质分子量69.23 ku,理论等电点为8.37;Bp PG蛋白有6个蛋白质结合位点,属于Glycosyl hydrolases family 28家族,为亲水性蛋白,不具有信号肽。二级结构主要包括α-螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲,三级结构预测结果与二级结构相符。系统进化分析表明,Bp PG与PG(Gen Bank序列号WP 034181566.1)具有同源性。实时荧光定量PCR结果显示*** JKSH007定殖过程中,不同时期的Bp PG基因表达量存在差异。【结论】克隆得到Bp PG基因,Bp PG基因在进化上是保守的,其极有可能在*** JK-SH007定殖过程中发挥作用。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌多聚半乳糖醛酸酶基因分子克隆表达分析

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007抗菌蛋白的分离纯化

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微生物学通报 2010年第6期37卷 872-880页

作者：任嘉红吴小芹刘辉叶建仁南京林业大学森林资源与环境学院江苏南京210037 长治学院生化系山西长治046011

对拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007菌株抗菌蛋白进行了初步研究。研究发现,JK-SH007菌株的抗菌粗蛋白对热和蛋白酶K不敏感,碱性环境不利于抑菌蛋白活性的发挥。JK-SH007菌株的无菌发酵滤液经硫酸铵沉淀、... 详细信息

对拮抗细菌吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007菌株抗菌蛋白进行了初步研究。研究发现,JK-SH007菌株的抗菌粗蛋白对热和蛋白酶K不敏感,碱性环境不利于抑菌蛋白活性的发挥。JK-SH007菌株的无菌发酵滤液经硫酸铵沉淀、透析(3.5kD)、冷丙酮沉淀(-20℃)、Sephadex G-50葡聚糖凝胶分子筛层析及DEAE-Sephadex A-25离子交换层析分离纯化,得到了蛋白组分A-Ⅱ-2,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测不是单一组分,该复合组分具有明显抑制3种杨树溃疡病病原真菌金黄壳囊孢(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phomopsis macrospore)、七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)生长的作用。

关键词：杨树溃疡病吡咯伯克霍尔德氏菌抗菌蛋白分离纯化拮抗细菌

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007产嗜铁素的相关基因克隆及条件优化

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中国生物防治学报 2019年第4期35卷 630-641页

作者：陈艳彬韩燕燕王斐叶建仁任嘉红长治学院生物科学与技术系长治046011 南京林业大学林学院南京210037

为了明确吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia Pyrrocinia JK-SH007是否产嗜铁素,揭示其生防机制,本文通过CAS检测该菌株产嗜铁素的能力,并对其嗜铁素合成相关基因cepR进行克隆及序列分析,同时采用单因素试验及响应面法对菌株JK-SH007产嗜... 详细信息

为了明确吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia Pyrrocinia JK-SH007是否产嗜铁素,揭示其生防机制,本文通过CAS检测该菌株产嗜铁素的能力,并对其嗜铁素合成相关基因cepR进行克隆及序列分析,同时采用单因素试验及响应面法对菌株JK-SH007产嗜铁素条件进行优化。结果表明,菌株JK-SH007具有明显的产嗜铁素能力,其嗜铁素合成相关基因cepR大小为720 bp,与B. pyrrocinia(EU034001)的亲缘关系最近,同源性为99%,两者序列相似性为97%,13个位点出现SNP;另外菌株JK-SH007cepR基因编码的氨基酸序列有3个氨基酸发生了替换,两者一致性为97%。该菌产嗜铁素最优培养时间是15 h、p H 8、转速200r/min、最佳碳源和氮源分别是甘油和氯化铵;PB试验筛选出影响该菌株产嗜铁素的关键性因素分别是p H、加碳量、加氮量;CCD试验结果显示,p H和加氮量的交互作用较明显;最终采用Design-Expert软件分析出菌株JK-SH007产嗜铁素最佳方案为碳源加入量15.00 g/L、氮源加入量10.50 g/L、温度30℃、pH7.36,优化后菌株产嗜铁素能力由18.59提升到37.86,响应面优化产嗜铁素条件的效果是显著的,嗜铁素产量得到明显提高。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌嗜铁素 cepR基因

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007高GC基因PCR体系的扩增研究

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西南林业大学学报（自然科学） 2017年第1期37卷 130-137页

作者：张鹏飞吴伟陈飞飞叶建仁任嘉红山西师范大学生命科学学院山西临汾041000 长治学院生物科学与技术系山西长治046011 南京林业大学林学院江苏南京712100

对生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组上高GC基因PCR扩增体系进行探讨。通过对该菌株基因组进行100℃处理5 min;PCR反应体系为10μL,在体系中使用高保真LA Taq(Mix)酶,并分别加入不同体积分数的DMSO、2×GC bufferⅠ、2×GC buffer... 详细信息

对生防菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007基因组上高GC基因PCR扩增体系进行探讨。通过对该菌株基因组进行100℃处理5 min;PCR反应体系为10μL,在体系中使用高保真LA Taq(Mix)酶,并分别加入不同体积分数的DMSO、2×GC bufferⅠ、2×GC bufferⅡ,然后选用适当的PCR程序对产几丁质酶基因(bcc1,GC含量71.1%)进行扩增,在此基础上,选择最适体系对产ACC脱氨酶基因(acd S,GC含量66.86%)、内切葡聚糖酶基因(GC含量74.71%)、色氨酸单加氧酶基因(iaa M,GC含量6.62%)、嗜铁素合成相关基因(cepR,GC含量64.44%)进行PCR扩增,将扩增出的片段与PMD19-T vector连接后转化至大肠杆菌JM-109中进行测序。结果表明:JK-SH007菌株基因组经高温处理后,在PCR反应体系中加入10%DMSO可成功扩增出该菌株bcc1基因(2 484 bp)。该体系同样适用于acd S、内切葡聚糖酶、iaa M、cepR等基因,而且测序结果与预期的序列一致。因此,该体系具有广泛性,而且简单可靠,成本低,扩增效率高,具有很强的实用性,为洋葱伯克霍尔德氏菌群菌株及其他菌株高GC含量基因的克隆提供了参考依据。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌基因测序高GC PCR扩增

吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007合成IAA及其吲哚-3-乙酰胺途径分析

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吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007合成IAA及其吲哚-3-乙酰胺途径分析

作者：刘婉慧南京林业大学

学位级别：硕士

吲哚-3-乙酸(IAA)作为一种天然存在的植物生长素,能对植物的发育起到重要促进作用。与植物生长发育或病害过程有关联的微生物中,许多也具有产生IAA的能力,从而使这些微生物影响和改变植物的生理过程。阐明植物生长促进细菌(PGPB)的IAA... 详细信息

吲哚-3-乙酸(IAA)作为一种天然存在的植物生长素,能对植物的发育起到重要促进作用。与植物生长发育或病害过程有关联的微生物中,许多也具有产生IAA的能力,从而使这些微生物影响和改变植物的生理过程。阐明植物生长促进细菌(PGPB)的IAA合成情况以及IAA合成机制有助于理解这类微生物的促生机制。吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007可以促进杨树等林木的生长,是一株良好的PGPB。已知其能够合成植物激素IAA是其发挥促生作用的原因之一。本研究将进一步分析外部环境条件对*** JK-SH007分泌IAA的影响,并对其IAA的合成途径进行功能分析。主要研究结果如下:(1)*** JK-SH007分泌IAA的能力通过Salkowski比色法、酶联免疫吸附法(ELISA)及高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)三种方法进行鉴定,表明*** JK-SH007可以合成IAA,且能合成IAA合成通路相关中间体吲哚-3-丙酮酸(IPyA)、吲哚-3-乙腈(IAN)、吲哚-3-乙酰胺(IAM)以及色胺(TAM);研究了*** JK-SH007菌株生长与合成IAA的关系,表明菌株生长稳定期的IAA合成量最高;研究了L-色氨酸(L-Trp)、温度和pH对*** JK-SH007合成IAA的影响,表明L-Trp对菌株分泌IAA具有显著促进作用,*** JK-SH007合成IAA的最佳温度是37℃,最适pH为7。(2)通过*** JK-SH007无细胞提取物的IAA生成试验和利用*** JK-SH007全基因组和NCBI及KEGG数据库的比对注释分析,表明*** JK-SH007中含有IAM途径和TAM途径所需的全部基因,说明*** JK-SH007极有可能通过完整的IAM途径和TAM途径合成IAA。(3)运用PCR技术对*** JK-SH007中IAM途径关键基因——编码色氨酸2-单加氧酶基因iaaM及编码吲哚乙酰胺水解酶基因iaaH进行克隆,并通过生物信息学分析,表明:基因iaaM全长1 782 bp,可以编码593个氨基酸,蛋白分子量为64.81 kD,不具有信号肽;基因iaaH全长1 368 bp,能够编码455个氨基酸,蛋白分子量为47.28 kD,不具有信号肽。通过二级结构和系统发育分析说明两者在进化上均具有一定保守性;iaaM和iaaH基因在L-Trp处理下差异表达的实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)分析显示,两者表达量均显著提高,表明IAM途径在*** JK-SH007合成IAA的过程中发挥了一定作用。(4)通过原核蛋白表达和底物喂养试验验证IAM途径的两个关键酶——色氨酸2-单加氧酶和吲哚乙酰胺水解酶的活性,表明两者均具有活性,IAM途径在*** JK-SH007中具有活性且具有一定作用。本研究表明*** JK-SH007具有合成IAA及其中间体的能力,L-Trp对菌株合成IAA具有显著促进作用,温度37℃、pH为7是*** JK-SH007合成IAA的最佳条件;*** JK-SH007的全基因组分析表明其可能具有完整的IAM和TAM合成途径,并分别从分子及蛋白水平对*** JK-SH007基于IAM的IAA合成途径进行了功能验证,揭示了IAM途径在*** JK-SH007 IAA合成中的分子功能机制,为探究*** JK-SH007的促生机制奠定了基础。

关键词：吡咯伯克霍尔德氏菌吲哚-3-乙酸 L-色氨酸吲哚-3-乙酰胺