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作者：王肇聪华中科技大学

学位级别：硕士

目的:在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)吉非替尼(Gefitinib,Gef)敏感细胞PC9及耐药细胞PC9/G中,研究海带提取物岩藻黄质(Fucoxanthin,FX)、鹅掌菜酚(Eckol,EC)对吉非替尼敏感性的影响及其分子机制。方法:体外培养NSCLC细胞PC9、PC9/G,将细胞分为对照组、Gef组、FX 组、EC 组、FX 联用 Gef(FX+Gef)组以及 EC 联用 Gef(EC+Gef)组。CCK8法检测药物对PC9、PC9/G细胞存活率的影响。构建人非小细胞肺癌PC9细胞裸鼠移植瘤模型,体内水平考察FX、EC单用及与Gef联用后对肿瘤生长的影响。免疫组化法检测肿瘤组织中Ki67的表达。Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测药物对PC9、PC9/G细胞凋亡率的影响。单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色法检测药物处理后PC9、PC9/G细胞自噬水平的变化。Western blotting法检测药物处理后,PC9、PC9/G细胞中自噬相关蛋白p62、BECN、LC3B以及耐药相关信号通路蛋白的表达。结果:Gef对PC9、PC9/G细胞的半数抑制浓度(Halfmaximal inhibitory concentration,IC50)分别为 0.028±0.011μM、6.440±1.532μM,与 PC9 细胞相比,PC9/G细胞的吉非替尼耐药倍数达322。本研究选用的细胞符合Gef敏感细胞、耐药细胞株的特征。在PC9、PC9/G细胞中,Gef、FX、EC单用以及联用对PC9、PC9/G细胞均有增殖抑制作用(P耐药相关的MEK/ERK信号通路。结论:海带提取物FX、EC可在体内外水平提高NSCLC细胞对Gef的敏感性,其作用机制可能是通过诱导凋亡、抑制细胞自噬、调控EGFR/AXL-MEK-ERK信号通路而实现。

关键词：岩藻黄质鹅掌菜酚非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼耐药凋亡自噬

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吉非替尼联合CIK细胞对A549/GR细胞的体外实验研究

吉非替尼联合CIK细胞对A549/GR细胞的体外实验研究

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作者：侯燕军山西医科大学

学位级别：硕士

目的：国内外的临床研究充分肯定了吉非替尼为主要力量对于改善晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)生活质量及生存周期。吉非替尼为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)。吉非替尼对NSCLC患者... 详细信息

目的：国内外的临床研究充分肯定了吉非替尼为主要力量对于改善晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)生活质量及生存周期。吉非替尼为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)。吉非替尼对NSCLC患者特别是有EGFR激酶区域特征性的突变(外显子19缺失及外显子21L858R突变)的具有显著疗效。但随着患者治疗时间的延长,最终均产生耐药而导致疾病进展得不到控制。而且,并非所有负载具有EGFR激酶区域特征性突变的(外显子19缺失及外显子21L858R突变)NSCLC者都有很强的疗效,极易发生耐药的有一部分是初始有效的病人。因此,研究如何提高吉非替尼的药效及如何防止吉非替尼的耐药;并且探索可以具有协同作用的新治疗手段,开创新的联合治疗模式,对于更大程度发挥吉非替尼的作用及提高非小细胞肺癌患者临床治疗手段,具有临床意义及治疗价值。本研究旨在阐明吉非替尼与细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine induced killer cells, CIK细胞)联合应用于人肺腺癌细胞体内外的意义,探讨其在克服吉非替尼耐药及增强其疗效作用及意义。方法：采取健康志愿者外周血中单个核细胞,添加IFN-y和IL-2,抗CD3单抗联合诱导至CIK细胞。应用MTT比色法检测吉非替尼组,CIK细胞组及CIK联合吉非替尼组对吉非替尼耐药细胞的增殖的抑制;采用流式细胞术检测吉非替尼组,CIK组,CIK联合吉非替尼组对靶细胞凋亡的影响;采用免疫印迹法检测磷酸化测和总EGFR,Akt,Erk1/2,β-actin的表达;结果：1.体外实验说明CIK对A549/GR细胞杀伤力高于于A549细胞(P吉非替尼即能使CIK:A549/GR效靶比为5：1组中的联合杀伤率比单纯使用CIK细胞组(相同效靶比)细胞杀伤率增加至2.4倍,比单纯使用吉非替尼组(同剂量)增加7.2倍。且联合杀伤率与效靶细胞比值增高成正比。 2.效靶比CIK:A549/GR为5：1联合吉非替尼组与单纯使用吉非替尼组相比凋亡效应非常明显。 3.免疫印迹法检测结果表明：经过CIK联合吉非替尼组作用后的A549/GR细胞总EGFR, Akt,Erk1/2,β-actin均比对照组下降明显。结论：***可明显加强吉非替尼对A549/GR细胞的增殖抑制作用及凋亡效应。 ***具有部分逆转A549/GR细胞株耐吉非替尼的作用。 ***逆转吉非替尼耐药的原理可能是下调EGFR,Akt,Erk1/2,β-actin等的表达。

关键词： A549/GR CIK细胞吉非替尼耐药

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肺金生方抗非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药性的分子机制研究

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浙江中西医结合杂志 2020年第4期30卷 286-290页

作者：姚成高文仓浙江中医药大学附属第二医院肿瘤科杭州310005

目的探讨肺金生方抗非小细胞肺癌(NSCLC)酪氨酸磷酸酶抑制剂(TKIs)靶向药物耐药的作用及分子机制。方法选用NSCLC细胞系HCC827,按0.01、0.05、0.10、0.50和1.0μM浓度梯度诱导构建吉非替尼耐药细胞株,采用CCK8法检测耐药株是否构建成功... 详细信息

目的探讨肺金生方抗非小细胞肺癌(NSCLC)酪氨酸磷酸酶抑制剂(TKIs)靶向药物耐药的作用及分子机制。方法选用NSCLC细胞系HCC827,按0.01、0.05、0.10、0.50和1.0μM浓度梯度诱导构建吉非替尼耐药细胞株,采用CCK8法检测耐药株是否构建成功,采用荧光定量PCR(q-PCR)检测耐药株c-MET扩增水平。20只BALB/c裸鼠按随机数字表法分成空白对照组、吉非替尼组、肺金生方组和肺金生方+吉非替尼组,每组5只。按每只4×10~7/200μL将吉非替尼耐药细胞株注射于裸鼠后肢皮下,构建皮下移植瘤模型。四组均腹腔注射生理盐水,吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg灌胃;肺金生方组给予肺金生方剂量53.6g/kg灌胃;肺金生方+吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg+肺金生方剂量53.6g/kg联合灌胃给药。给药频次每2天1次,连续给药4周。CCK8法检测耐药HCC827 GR细胞增殖率,流式细胞技术检测耐药HCC827 GR细胞凋亡率,Western blot检测耐药HCC827 GR细胞p-EGFR、p-MET、p-AKT、p-ERK1/2表达水平。结果与空白对照组比较,吉非替尼组裸鼠皮下移植瘤瘤重无差异[(1.34±0.16)g比(1.41±0.13)g,P>0.05],肺金生方组裸鼠皮下移植瘤瘤重明显减轻[(0.77±0.28)g比(1.41±0.13)g,P吉非替尼+肺金生方组裸鼠皮下移植瘤明显小于肺金生方组和吉非替尼组[(0.34±0.16)g比(0.77±0.28)g、(1.34±0.16)g,P均吉非替尼联用能够明显抑制耐药HCC827 GR细胞的增殖能力[(43.45±4.47)%、(24.25±5.21)%比(100.00±2.14)%,P均吉非替尼+肺金生方组细胞凋亡率显著高于空白对照组[(7.40±0.56)%、(12.80±0.72)%比(3.05±0.54)%,P均吉非替尼+肺金生方组c-MET和p-c-MET表达水平明显降低,并明显抑制下游AKT/ERK1/2磷酸化水平。结论肺金生方或和吉非替尼联用能有效抑制吉非替尼耐药皮下移植瘤的生长,抑制耐药细胞的增殖并促进凋亡,其作用机制可能与下调c-MET蛋白表达以及下游AKT/ERK1/2磷酸化水平有关。

关键词：裸鼠非小细胞肺癌 HCC827 肺金生方吉非替尼耐药 c-MET

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脂多糖对核转录因子-κB的激活在人肺非小细胞肺癌获得性耐药细胞中的作用

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国际免疫学杂志 2017年第3期40卷 238-242页

作者：臧家兰胡勇秦晓冰严大理吴建中马蓉冯继锋哈尔滨市第一医院肿瘤科 150010 南京医科大学附属肿瘤医院 210009 徐州市第一人民医院肿瘤内科 221000

目的本研究旨在通过检测脂多糖（lipopolysaccharide ,LPS）作用后人非小细胞肺癌耐药株细胞内核转录因子（nuclear factor-κB,NF）-κB p65表达量的变化,探讨LPS作用下NF-κB表达量的增高与吉非替尼获得性耐药产生的相关性.方法成... 详细信息

目的本研究旨在通过检测脂多糖（lipopolysaccharide ,LPS）作用后人非小细胞肺癌耐药株细胞内核转录因子（nuclear factor-κB,NF）-κB p65表达量的变化,探讨LPS作用下NF-κB表达量的增高与吉非替尼获得性耐药产生的相关性.方法成功诱导非小细胞肺癌细胞株HCC827对吉非替尼产生稳定的获得性耐药后,按设置的分组用LPS及吉非替尼处理细胞,采用CCK-8法检测处理后吉非替尼对细胞的半数抑制浓度（IC50值）,并与各自对照组相比较.细胞增殖曲线显示LPS作用对细胞增殖的影响.采用克隆形成实验显示LPS作用后对细胞增殖的影响.采用蛋白质印迹法检测LPS及吉非替尼处理后耐药株HCC827/GR-8-1细胞中凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2等蛋白的表达量,并检测NF-κB蛋白的表达量,探讨LPS作用后激活的NF-κB对细胞吉非替尼敏感性的调节.结果 LPS处理后,可以显著降低耐药细胞对吉非替尼的敏感性,细胞克隆形成实验及增殖曲线显示LPS并无明显促进细胞的增殖作用,但可以降低细胞对吉非替尼的敏感性.蛋白质免疫印迹结果显示,与对照组相比较,LPS可抑制Caspase-3等相关促凋亡蛋白的表达,而相应凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达上升.LPS处理48 h后NF-κB的表达量显著上调.LPS通过调节NF-κB表达量上升而参与细胞耐药机制的产生.结论经LPS作用后的非小细胞肺癌细胞对吉非替尼敏感性降低,LPS处理后细胞的NF-κB表达量显著增高,增高的NF-κB表达量与细胞对吉非替尼的药物敏感性下降相关.

关键词：非小细胞肺癌脂多糖吉非替尼耐药核转录因子-κB

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姜黄素干预耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮间质转化的影响及相关机制的研究

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中国现代医生 2016年第32期54卷 1-4,F0003页

作者：陈灏詹建伟王利民陈清勇叶健杭州市第一人民医院呼吸科浙江杭州310006

目的探讨姜黄素对耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞的生物学特性影响以及干预其上皮间质化过程(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的相关机制。方法采用体外姜黄素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞;分别通过形态学、MTT法、transw... 详细信息

目的探讨姜黄素对耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞的生物学特性影响以及干预其上皮间质化过程(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的相关机制。方法采用体外姜黄素作用于耐吉非替尼人肺腺癌PC9/ZD细胞;分别通过形态学、MTT法、transwell实验检测经姜黄素干预的耐药细胞株的形态特征、药物敏感性和侵袭转移能力的变化;通过Western blot实验检测波形蛋白、上皮钙粘附分子在药物作用后的表达差异以及PI3K/AKT/m TOR信号通路中相关蛋白AKT、m TOR的变化情况。结果与人肺腺癌PC9细胞比较,PC9/ZD耐药细胞株呈间质样细胞表型;与亲代PC9/ZD细胞比较,经姜黄素作用后的PC9/ZD细胞对吉非替尼敏感性明显增强,转移能力减弱(75.67±8.82 vs 103.67±13.67);侵袭能力减弱(17.22±3.63 vs 59.89±8.19);波形蛋白表达下调(1.07±0.23 vs 1.28±0.28),上皮钙粘附分子表达上调(0.82±0.27 vs 0.29±0.11);AKT、m TOR磷酸化减弱(0.20±0.05 vs 0.63±0.17,0.72±0.25 vs 1.10±0.19)。结论姜黄素可以通过阻断PI3K/AKT/m TOR信号通路而明显干预耐吉非替尼肺腺癌细胞上皮-间质转化过程。

关键词：肺腺癌吉非替尼耐药上皮间质转化生物学特性姜黄素

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