检索结果-南通市图书馆

作者：宫颢天津医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:肺癌是危害人类身体健康的常见恶性肿瘤之一。针对表皮生长因子的靶向治疗是目前肺部肿瘤治疗领域的主要热点之一,其具有疗效稳定、效果显著、副作用小等特点,在临床中得到了广泛的应用及好评,但与此同时,绝大多数的肺癌患... 详细信息

背景与目的:肺癌是危害人类身体健康的常见恶性肿瘤之一。针对表皮生长因子的靶向治疗是目前肺部肿瘤治疗领域的主要热点之一,其具有疗效稳定、效果显著、副作用小等特点,在临床中得到了广泛的应用及好评,但与此同时,绝大多数的肺癌患者会在用药后的1年时间里出现不同程度的病情复发或者肿瘤转移,导致这一结果最主要的原因是患者的肿瘤细胞对EGFR-TKIs药物产生了获得性耐药。因此,研究EGFR-TKIs获得性耐药的机制及逆转EGFR-TKIs耐药是目前研究的主要热点。随着分子生物学的发展,研究人员发现肿瘤组织中除会出现特定基因位点突变及异常信号通路激活外,还会出现一些特殊的表观遗传性状的改变。EZH2是一个重要的表观遗传调控基因,是PRC2复合物的核心成员,具有组蛋白甲基转移酶(Histone methyltransferase,HMT)活性,能够对组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基(H3K27me3)进行催化从而抑制靶基因的表达。研究者发现EZH2在肺癌中高表达且其表达量与预后相关,与此同时EZH2抑制剂也被发现能够提升肿瘤细胞对多种抗肿瘤药物的敏感性。本研究有三个主要目的:(1)探讨EZH2在非小细胞肺癌中的表达情况及表达差异与预后的关系。(2)EZH2抑制剂与吉非替尼联合应用,对耐吉非替尼的肺癌细胞生物学行为的影响。(3)在EGFR野生型非小细胞肺癌中,是否能够通过应用EZH2抑制剂从而逆转其对吉非替尼的耐药性。方法:借助TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库分析,对肺鳞癌和肺腺癌的癌组织及癌旁组织中EZH2表达量进行了对比,进一步研究EZH2表达与患者预后的相关性。随后应用qRT-PCR技术对40例非小细胞肺癌患者的癌组织及癌旁正常组织的EZH2的表达情况进行了检测,应用Western blot检测不同非小细胞肺癌系(H460,A549,HCC827,H1299,H1650,H1792,H1975,H2030)及正常肺泡上皮细胞系(B2B)EZH2的表达情况。为了进一步研究EZH2抑制剂与吉非替尼的联合作用效果,我们以PC-9/AB2细胞为耐药细胞模型,应用CCK-8、EdU实验检测联合用药对于细胞活性及增殖的影响;通过划痕及transwell小室实验观察联合用药对于细胞迁移能力的影响;并应用流式细胞学技术检测联合用药对于细胞凋亡的影响;并通过Western blot观察联合用药对EGFR信号通路的作用。以A549、H1299细胞为EGFR野生型细胞模型,应用EZH2siRNA进一步敲低细胞中EZH2的表达,检测敲低EZH2后细胞对吉非替尼的敏感性变化,同时应用CCK-8及EdU实验检测联合用药对于细胞活性及增殖的影响;通过划痕及transwell小室检测联合用药对于细胞迁移能力的影响;并应用流式细胞学技术检测联合用药对于细胞凋亡的影响;并通过Western blot观察联合用药对EGFR信号通路及其下游信号通路的影响情况。结果:TCGA分析结果显示EZH2在非小细胞肺癌组织(肺鳞癌及肺腺癌)中的表达水平显著高于癌旁正常组织,同时其表达水平的与肺腺癌的患者的预后呈现负相关性;qRT-PCR结果显示:在40例临床的非小细胞肺癌患者的肿瘤样本中EZH2的表达水平显著高于癌旁正常组织,细胞实验结果显示在非小细胞肺癌株(A549,H460,HCC827,H1299,H1650,H1792,H1975,H2030)中EZH2的表达量明显高于正常的肺泡上皮细胞株B2B细胞。在吉非替尼获得性耐药的PC9/AB2细胞中,联合应用EZH2抑制剂(GSK343)与吉非替尼,能够显著的抑制细胞的活性,并且抑制细胞的迁移,诱发细胞的凋亡,Western blot的结果也显示,联合用药也能够显著抑制EZH2表达及EGFR蛋白的磷酸化。而在EGFR野生型细胞中,我们发现应用siRNA敲低A549、H1299的EZH2基因后,其对吉非替尼更加敏感;联合应用EZH2抑制剂(GSK343/DZNep)+吉非替尼也能够显著抑制A549及H1299细胞的增殖能力和迁移能力,同时诱导细胞凋亡;Western blot的结果也显示:敲低EZH2后再应用吉非替尼,细胞的EGFR及P-EGFR表达水平明显较未敲低组明显降低,与此同时联合应用EZH2抑制剂与吉非替尼能够显著的抑制EGFR蛋白及P-EGFR蛋白的表达。

关键词： EZH2 EZH2抑制剂非小细胞肺癌吉非替尼耐药

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Cx26与PI3K/Akt信号通路相互激活促进EMT介导的NSCLC吉非替尼获得性耐药的研究

Cx26与PI3K/Akt信号通路相互激活促进EMT介导的NSCLC吉非替尼获得...

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作者：骆敏广西医科大学

学位级别：硕士

目的:研究Connexin26(Cx26)对非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)上皮间质化(epithelial–mesenchymal transition,EMT)和吉非替尼获得性耐药的影响及其分子机制。方法:1.用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、RT-PCR(reverse transcription PCR)法检测4种缝隙连接蛋白(Connexins,Cxs)Cx26、Cx32、Cx31.1及Cx43在4株人NSCLC细胞系HCC827、PC9、A549、NCI-H1299中的表达水平。2.用诱导耐药的方法,在人NSCLC细胞系HCC827、PC9的培养基中,按浓度梯度逐步增加吉非替尼浓度,以1.0μM的吉非替尼终浓度维持细胞耐药性,构建吉非替尼诱导耐药株HCC827 GR和PC9 GR细胞。使用噻唑蓝(Tetrazolium-based colorimetric assay,MTT)法检测以上细胞的半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)值。3.用荧光示踪法(parachute assay)检测人NSCLC细胞株HCC827、PC9及其诱导耐药株HCC827 GR、PC9 GR细胞间的缝隙连接功能(gap junctional intercellular communication,GJIC);使用免疫荧光技术(Immunofluorescence staining,IF)检测NSCLC细胞株HCC827、PC9及其诱导耐药株HCC827 GR、PC9 GR细胞中Cx26的蛋白定位。4.用慢病毒(lentivirus)载体技术对人NSCLC细胞中Cx26蛋白表达进行干扰和过表达;用pcDNA3.1-Akt质粒转染对人NSCLC细胞中Akt蛋白进行过表达,用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002对Akt蛋白表达进行抑制;用wb检测人nsclc细胞中cx26、e-cadherin、vimentin、slug、akt及p-akt的表达水平。使用transwell小室法检测人nsclc细胞的迁移、侵袭能力。***/c裸鼠分别皮下接种200μl1×107个hcc827、hcc827gr、hcc827gr-shcx26细胞。当肿瘤体积((长×宽2)/2)达到100mm3时,分别给予吉非替尼(100mg/kg/d,灌胃)或ly294002(25mg/kg,腹腔注射,一周2次)或联合给药。给药作用15天后处死裸鼠,每3天测量一次肿瘤体积,绘制肿瘤增殖曲线。结果:***和rt-pcr结果显示,在4株人nsclc细胞系hcc827、pc9、a549、nci-h1299中,cx26、cx32、cx31.1和cx43的表达具有差异性,其中cx26是主要表达的cxs亚型,并且cx26在吉非替尼耐药细胞株a549、nci-h1299中表达均高于吉非替尼敏感细胞株hcc827、pc9。***结果显示,hcc827、hcc827gr和pc9、pc9gr细胞对吉非替尼的ic50值分别为0.06±0.11μm、12.17±0.18μm及0.25±0.07μm、16.51±0.17μm。形态学显示,hcc827gr、pc9-gr细胞表现分散、细长、间质样细胞形态;上皮标志物e-cadherin表达减少,间质标志物vimentin、slug的表达增多;transwell实验结果显示,hcc827gr、pc9-gr细胞的迁移、侵袭能力显著增强;wb结果显示,hcc827gr、pc9gr细胞中cx26的表达量显著增多。3.荧光示踪法结果显示,以人包皮成纤维细胞(hffs)作为阳性对照,hffs细胞用ra(gjic增强剂)处理后能够显著增强细胞间的gjic功能。但是hcc827、hcc827gr和pc9、pc9gr细胞间缝隙连接功能缺失,用ra处理后并未能增强细胞间的gjic功能。免疫荧光结果显示,cx26表达在hcc827、pc9及hcc827gr、pc9gr细胞胞浆。4.在吉非替尼敏感株hcc827、pc9细胞上过表达cx26后,hcc827-cx26、pc9-cx26细胞表现分散、细长、间质样细胞形态;上皮标志物e-cadherin表达减少,间质标志物vimentin、slug的表达增多;transwell实验结果显示,hcc827-cx26、pc9-cx26细胞的迁移、侵袭能力显著增强。mtt结果表明,hcc827-cx26、pc9-cx26细胞对吉非替尼的耐药性显著增高。体内成瘤实验显示,与hcc827-mock、pc9-mock组相比,过表达cx26使hcc827、pc9组肿瘤体积显著增大。5.在对吉非替尼耐药的h

关键词：缝隙连接蛋白26 吉非替尼耐药非小细胞肺癌 PI3K/Akt 上皮间质化

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基于ZIF-8金属有机框架材料的多功能纳米给药系统的设计及抗肿瘤活性研究

基于ZIF-8金属有机框架材料的多功能纳米给药系统的设计及抗肿瘤...

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作者：刘梦江西科技师范大学

学位级别：硕士

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最普遍的肺癌种类,患者的平均五年生存率不到百分之二十。表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼已经在临床上被广泛用于治疗NSCLC,但吉非替尼的疗效因耐药性... 详细信息

肺癌是全球死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)是最普遍的肺癌种类,患者的平均五年生存率不到百分之二十。表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼已经在临床上被广泛用于治疗NSCLC,但吉非替尼的疗效因耐药性的产生而受到影响。在各种新兴的癌症治疗方法中,小干扰RNA(siRNA)已成为基因治疗中抑制基因表达的有力工具,可以特异性抑制或沉默棘手的治疗靶点。尽管siRNA在各种疑难病症的治疗中显示出巨大潜力,但缺乏高效特异性的递送方法是siRNA临床治疗的主要障碍。金属有机框架材料(MOF)孔径体积较大,比表面积较高,因此能够实现较高的载药量。同时沸石咪唑框架-8(ZIF-8)是一种生物相容性高,在正常生理条件下稳定,但可以在肿瘤微酸环境下降解的MOF材料。因此可以被用作纳米载体实现抗肿瘤药物的递送和响应性释放。本课题构建了一种基于ZIF-8有机金属框架纳米材料的多功能纳米载药体系。通过原位装封的方式负载了EGFR抑制剂吉非替尼和siRNA核酸药物,并通过静电吸附作用在纳米颗粒的外表面修饰了具有靶向作用的EGFR aptamer,构建了具有肿瘤细胞主动靶向作用的Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒。对合成的Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒进行了一系列的表征工作。透射电镜(TEM)的结果显示纳米颗粒呈现规则的正八面体形态,颗粒大小均匀,粒径在75 nm左右,满足EPR作用的要求。同时X射线衍射实验和热稳定性实验证明了纳米颗粒具有良好的晶型结构和热稳定性。通过紫外分光光度法和荧光分光光度法测得Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒中吉非替尼的负载率大约为(40±3.72)%,EGFR siRNA的包封率约为(73±2.23)%。体外释药实验表明Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒具有优异的p H响应性释放能力。此外,琼脂糖凝胶电泳实验验证了纳米颗粒能够有效保护EGFR siRNA免受核酸酶的降解。体外细胞摄取实验证明了Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒能够被A549细胞有效摄取。MTT的实验结果表明Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒对A549和PC-9两株细胞的肿瘤抑制效率高于等浓度的吉非替尼。活性氧ROS的生成实验证明了纳米颗粒对肿瘤细胞的高毒性可能是由于细胞内活性氧含量的增加。对于纳米颗粒的细胞毒性进行了进一步的研究。JC-1染色,AO染色,活死染色的实验结果证明了相对于等浓度的吉非替尼,Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒具有更强的诱导A549细胞凋亡的能力。细胞周期凋亡实验表明Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒给药组中早凋细胞和晚凋细胞比例达到21.58%。并且处于G0/G1期细胞增加到81.89%。荧光定量PCR实验和蛋白印迹的实验结果表明,Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒能够有效的抑制A549和PC-9细胞内EGFR基因的表达,以及EGFR蛋白及其下游信号通路ERK蛋白的表达,从而导致肿瘤细胞的凋亡。通过溶血实验和体内小鼠毒性实验证明了Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒具有较高的生物相容性和低毒性,可以进行进一步的裸鼠实验。小动物活体成像实验验证了纳米颗粒能够有效保护EGFR siRNA免受核酸酶的降解,同时显著延长制剂在体内的循环时间,增加药物在肿瘤部位的累积。通过建立A549荷瘤裸鼠模型考察Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒的体内抗肿瘤能力。实验结果表明Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒能够最大限度的抑制肿瘤生长,具有最强的促进肿瘤细胞凋亡的能力。而肿瘤组织的PCR分析结果也验证了Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒能够抑制肿瘤组织中EGFR基因的表达,从而抑制肿瘤的生长。综上所述,本课题通过构建了一种基于ZIF-8的纳米递送体系,实现了吉非替尼和EGFR siRNA的体内靶向共递送,对合成的纳米颗粒进行了一系列的表征工作,对其生物安全性,体内靶向性和体内外抗肿瘤活性也进行初步的分析及探讨。实验结果表明Apt/(siRNA+GEF)@ZIF-8纳米颗粒是一种有潜力的多功能纳米制剂,有希望克服吉非替尼的耐药难题,实现安全高效的抗肿瘤治疗。

关键词：有机金属框架材料非小细胞肺癌吉非替尼耐药基因治疗联合治疗抗肿瘤活性

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自噬在EGFR野生型肺腺癌耐药细胞株A549/GR靶向耐药中的作用研究

自噬在EGFR野生型肺腺癌耐药细胞株A549/GR靶向耐药中的作用研究

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作者：陈雨遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:探索EGFR野生型肺腺癌耐药细胞株A549/GR对吉非替尼的耐药性,并通过正负调控自噬关键基因Beclin-1影响自噬,探索自噬对肺腺癌耐药细胞株A549/GR耐药性及干性的影响,初步明确肺腺癌细胞吉非替尼耐药性与自噬、肿瘤细胞干性之间的关... 详细信息

目的:探索EGFR野生型肺腺癌耐药细胞株A549/GR对吉非替尼的耐药性,并通过正负调控自噬关键基因Beclin-1影响自噬,探索自噬对肺腺癌耐药细胞株A549/GR耐药性及干性的影响,初步明确肺腺癌细胞吉非替尼耐药性与自噬、肿瘤细胞干性之间的关系。方法:1.通过CCK8药物敏感性实验检测稳定耐药细胞株A549/GR及普通细胞株A549对吉非替尼的敏感性差异,并通过CCK8细胞增殖实验检测A549/GR和A549细胞的增殖活性。2.通过WB实验检测经5μg/m L吉非替尼处理后的稳定耐药细胞株A549/GR及普通细胞株A549中Beclin-l、LC3-II/LC3-I、p62等自噬相关蛋白的表达,并通过TEM检测A549及A549/GR的自噬体数量变化。3.通过克隆形成、Transwell迁移实验检测经5μg/m L吉非替尼处理后A549/GR及A549细胞的克隆形成能力、迁移能力;WB实验检测经5μg/m L吉非替尼处理后两株细胞的干性相关蛋白(Nanog、Bmi-l、CD44)及耐药相关蛋白ABCG2的表达。4.通过慢病毒转染耐药细胞株A549/GR及普通细胞株A549,构建敲低Beclin-1的细胞株(A549/GR+sh-Beclin-1)及对照组细胞株(A549/GR+sh-NC),并构建过表达Beclin-1的细胞株(A549+oe-Beclin-1)及对照组细胞株(A549+oe-NC),采用TEM、CCK8药物敏感性实验、克隆形成、Transwell迁移实验、WB实验等检测上述构建细胞株在5μg/m L吉非替尼存在下的自噬水平变化、耐药性变化、增殖迁移能力改变、干性相关蛋白表达的情况。结果:***8药物敏感性实验结果显示:稳定耐药细胞株A549/GR对吉非替尼耐药性高于普通细胞株A549(P吉非替尼处理后A549/GR细胞较A549增殖能力更强(P吉非替尼处理的稳定耐药细胞株A549/GR及普通细胞株A549自噬相关蛋白的表达,结果显示在A549/GR细胞中Beclin-l、LC3-II/LC3-I蛋白的表达均较A549细胞增高,而p62的蛋白表达量较A549细胞降低;在TEM下观察到A549/GR细胞中自噬体数量较A549细胞增多,差异具有显著性(P吉非替尼处理后的稳定耐药细胞株A549/GR及普通细胞株A549细胞的克隆形成能力及迁移能力,结果显示A549/GR的克隆形成数、迁移细胞数较A549明显增多;WB结果显示A549/GR细胞中干性相关蛋白Nanog、Bmi-l、CD44和耐药相关蛋白ABCG2的表达量均较A549高,具有显著性差异(P吉非替尼耐药性下降,克隆形成数、迁移细胞数均降低,同时干性及耐药相关蛋白Nanog、Bmi-l、CD44、ABCG2的表达均显著降低;与A549+oe-NC组相比,A549+oeBeclin-l组自噬相关蛋白Beclin-l、LC3-II/LC3-I表达量升高,p62表达降低,自噬体数量增多,吉非替尼耐药性上升,克隆形成数、迁移细胞数增多,同时干性及耐药相关蛋白Nanog、Bmi-l、CD44、ABCG2的表达上升(P耐药细胞株A549/GR具有高水平自噬及肿瘤细胞干性,调控自噬关键基因Beclin-1可调控自噬进而影响肺腺癌耐药细胞株A549/GR的肿瘤干性及吉非替尼的耐药性;2.细胞自噬、肿瘤细胞干性可能与EGFR野生型肺腺癌耐药细胞株A549/GR的吉非替尼的耐药性有关。

关键词： A549/GR EGFR-TKI 吉非替尼耐药自噬肿瘤细胞干性

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吉非替尼在非小细胞肺癌治疗中耐药机制的研究进展

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中国肿瘤临床与康复 2013年第2期20卷 189-190页

作者：张婷许海柱陆俊彦孙建立上海中医药大学附属龙华医院上海200032

吉非替尼（gefitinib）是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物,与传统化疗药物相比,从细胞受体、增值调控的分子水平对肿瘤发病机制进行调控的靶向药物吉非替尼可使EGFR突变阳性患者... 详细信息

吉非替尼（gefitinib）是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物,与传统化疗药物相比,从细胞受体、增值调控的分子水平对肿瘤发病机制进行调控的靶向药物吉非替尼可使EGFR突变阳性患者的无疾病进展生存期显著延长。

关键词：吉非替尼耐药癌,非小细胞肺

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Efatutazone逆转非小细胞肺癌EGFR-TKI继发耐药及其机制研究

Efatutazone逆转非小细胞肺癌EGFR-TKI继发耐药及其机制研究

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作者：倪杰南京医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)基因在吉非替尼敏感细胞与耐药细胞中的表达,并研究PPARγ激动剂efatutazone对吉非替尼继发耐药的逆转及其分子机制,为PPARγ及吉非... 详细信息

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)基因在吉非替尼敏感细胞与耐药细胞中的表达,并研究PPARγ激动剂efatutazone对吉非替尼继发耐药的逆转及其分子机制,为PPARγ及吉非替尼耐药研究提供新的思路。方法:通过Oncomine、GEO和Kaplan–Meier Plotter在线数据库分析PPARγ基因在肺腺癌组织与正常组织,及吉非替尼继发耐药细胞与敏感细胞的表达,分析PPARγ基因与肺腺癌患者总生存期的影响;通过qRT-PCR及western blot进一步检测PPARγ、MET和PTEN在吉非替尼继发耐药细胞与敏感细胞的表达;通过CCK8增殖实验和平板克隆形成检测PPARγ激动剂efatutazone对吉非替尼继发耐药细胞HCC827-GR和PC-9-GR的影响,并在耐药细胞中通过qRT-PCR及western blot检测PPARγ和PDK4的表达变化;通过细胞周期实验检测efatutazone与吉非替尼单独或联合使用对吉非替尼继发耐药细胞HCC827-GR和PC-9-GR的影响,并在运用qRT-PCR及western blot检测p21、p-p21 Thr145和Cyclin D1的表达变化;运用siRNA敲低PPARγ,对efatutazone与吉非替尼单独或联合使用的影响;通过western blot检测efatutazone与吉非替尼单独或联合使用对吉非替尼继发耐药细胞中PPARγ,EGFR,PTEN,Akt,p-Akt Ser473,p21和p-p21Thr145蛋白的表达影响。结果:相对于正常肺上皮组织,PPARγ基因在肺腺癌患者组织中表达下降。在肺腺癌中,PPARG基因表达高的患者总生存期(OS)更长。相对于吉非替尼敏感细胞,PPARγ在耐药细胞细胞中低表达。PPARγ激动剂efatutazone增加吉非替尼对HCC827-GR和PC-9-GR细胞的细胞毒性并抑制其细胞周期,上调PPARγ,PTEN和p21蛋白表达。敲低PPARG可逆转efatutazone和吉非替尼对HCC827-GR和PC-9-GR细胞的抑制作用。efatutazone联合吉非替尼以浓度和时间依赖性方式使吉非替尼耐药细胞的生长受到抑制。机制研究表明,efatutazone通过上调PPARγ、PTEN的蛋白质表达,抑制Akt通路来抑制肺腺癌继发耐药细胞细胞的生长。结论:PPARγ激动剂efatutazone通过PPARγ/PTEN/Akt/p21信号通路使吉非替尼耐药细胞重新对吉非替尼敏感。

关键词： NSCLC 吉非替尼耐药 PPARγ efatutazone

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EGFR突变体在肺癌中的降解调控与靶向耐药机制研究

EGFR突变体在肺癌中的降解调控与靶向耐药机制研究

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作者：王太术大连医科大学

学位级别：硕士

肺癌是全世界癌症相关死亡最主要的原因,EGFR(The epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体)属于RTK(receptor tyrosine kinases,受体酪氨酸激酶)Erb B家族,与肺癌的发生发展密切相关。测序分析显示EGFR在NSCLC(Non-small cell lung cancer,非小细胞肺癌)中存在高的突变频率,而突变的EGFR具有持续性激活的激酶活性从而导致肿瘤的生长。虽然对野生型EGFR的内吞降解机制研究的比较清楚,但对突变体EGFR的内吞降解仍有争议。19号外显子缺失突变的EGFR因其在在NSCLC高的突变频率而被广泛研究,我们发现在NSCLC细胞中,19号外显子缺失突变的EGFR通过不依赖于Dynamin(发动蛋白)的活性进行持续性的内吞作用经溶酶体降解。EGF刺激和抑制HSP90的活性能够进一步加快19号外显子缺失突变EGFR的降解,但分别以Dynamin活性依赖和非依赖的形式进行。虽然19号外显子缺失突变EGFR以不同的方式进行内吞,但都是通过泛素化介导的内体-溶酶体途径进行降解,而且这种降解必须依赖其激酶活性。酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼能够有效治疗19号外显子缺失突变EGFR的NSCLC患者,但大多数患者在接受治疗后会出现药物耐受,而EGFR的二次突变及c-MET的扩增是获得性耐药最主要的原因,仍有大约30%吉非替尼获得性耐药的机制并不明确。因此,对新型吉非替尼耐药机制的研究显得十分重要。在本研究中,以对吉非替尼敏感的细胞系HCC827为亲本,建立筛选新型的吉非替尼耐药细胞RE-1和RE-2,并对其耐药机制进行研究,发现HCC827对吉非替尼的耐受是通过多方面的改变引起的,涉及到FGFFGFR信号通路和NF-κB信号通路的活化、EMT(epithelial–mesenchymal transition,表皮-间质转化)、细胞干性的增强、ROS(reactive oxygen species,活性氧)的显著下调等。去泛素化酶(Deubiquitinases,DUBs)在参与调节许多细胞进程中扮演着重要的作用。泛素化(ubiquitylation)和去泛素化(deubiquitylation)作为一个动态平衡的过程参与各种重要的生命活动。UCHL1(Ubiquitin C-terminal hydrolase L1,泛素羧基末端水解酶L1)在吉非替尼耐药细胞中的高表达,可能预示着其可以作为一个新的肿瘤细胞耐药标志物或治疗靶标。同时,吉非替尼耐药细胞对传统化疗药物顺铂更为敏感,这也为获得性耐药患者的治疗提供了新的思路。因此我们关于19号外显子缺失突变EGFR的内吞降解调控及吉非替尼耐药机制研究可能对NSCLC患者的临床治疗提供新的理论依据和治疗策略。

关键词： NSCLC 19号外显子缺失突变EGFR 内吞吉非替尼耐药 UCHL1

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海带提取物岩藻黄质、鹅掌菜酚提高NSCLC细胞吉非替尼敏感性的作用及机制

海带提取物岩藻黄质、鹅掌菜酚提高NSCLC细胞吉非替尼敏感性的作...

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作者：王肇聪华中科技大学

学位级别：硕士

目的:在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)吉非替尼(Gefitinib,Gef)敏感细胞PC9及耐药细胞PC9/G中,研究海带提取物岩藻黄质(Fucoxanthin,FX)、鹅掌菜酚(Eckol,EC)对吉非替尼敏感性的影响及其分子机制。方法:体外培养NSCLC细胞PC9、PC9/G,将细胞分为对照组、Gef组、FX 组、EC 组、FX 联用 Gef(FX+Gef)组以及 EC 联用 Gef(EC+Gef)组。CCK8法检测药物对PC9、PC9/G细胞存活率的影响。构建人非小细胞肺癌PC9细胞裸鼠移植瘤模型,体内水平考察FX、EC单用及与Gef联用后对肿瘤生长的影响。免疫组化法检测肿瘤组织中Ki67的表达。Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测药物对PC9、PC9/G细胞凋亡率的影响。单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverine,MDC)染色法检测药物处理后PC9、PC9/G细胞自噬水平的变化。Western blotting法检测药物处理后,PC9、PC9/G细胞中自噬相关蛋白p62、BECN、LC3B以及耐药相关信号通路蛋白的表达。结果:Gef对PC9、PC9/G细胞的半数抑制浓度(Halfmaximal inhibitory concentration,IC50)分别为 0.028±0.011μM、6.440±1.532μM,与 PC9 细胞相比,PC9/G细胞的吉非替尼耐药倍数达322。本研究选用的细胞符合Gef敏感细胞、耐药细胞株的特征。在PC9、PC9/G细胞中,Gef、FX、EC单用以及联用对PC9、PC9/G细胞均有增殖抑制作用(P耐药相关的MEK/ERK信号通路。结论:海带提取物FX、EC可在体内外水平提高NSCLC细胞对Gef的敏感性,其作用机制可能是通过诱导凋亡、抑制细胞自噬、调控EGFR/AXL-MEK-ERK信号通路而实现。

关键词：岩藻黄质鹅掌菜酚非小细胞肺癌酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼耐药凋亡自噬

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吉非替尼联合CIK细胞对A549/GR细胞的体外实验研究

吉非替尼联合CIK细胞对A549/GR细胞的体外实验研究

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作者：侯燕军山西医科大学

学位级别：硕士

目的：国内外的临床研究充分肯定了吉非替尼为主要力量对于改善晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)生活质量及生存周期。吉非替尼为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)。吉非替尼对NSCLC患者... 详细信息

目的：国内外的临床研究充分肯定了吉非替尼为主要力量对于改善晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)生活质量及生存周期。吉非替尼为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)。吉非替尼对NSCLC患者特别是有EGFR激酶区域特征性的突变(外显子19缺失及外显子21L858R突变)的具有显著疗效。但随着患者治疗时间的延长,最终均产生耐药而导致疾病进展得不到控制。而且,并非所有负载具有EGFR激酶区域特征性突变的(外显子19缺失及外显子21L858R突变)NSCLC者都有很强的疗效,极易发生耐药的有一部分是初始有效的病人。因此,研究如何提高吉非替尼的药效及如何防止吉非替尼的耐药;并且探索可以具有协同作用的新治疗手段,开创新的联合治疗模式,对于更大程度发挥吉非替尼的作用及提高非小细胞肺癌患者临床治疗手段,具有临床意义及治疗价值。本研究旨在阐明吉非替尼与细胞因子诱导杀伤细胞(cytokine induced killer cells, CIK细胞)联合应用于人肺腺癌细胞体内外的意义,探讨其在克服吉非替尼耐药及增强其疗效作用及意义。方法：采取健康志愿者外周血中单个核细胞,添加IFN-y和IL-2,抗CD3单抗联合诱导至CIK细胞。应用MTT比色法检测吉非替尼组,CIK细胞组及CIK联合吉非替尼组对吉非替尼耐药细胞的增殖的抑制;采用流式细胞术检测吉非替尼组,CIK组,CIK联合吉非替尼组对靶细胞凋亡的影响;采用免疫印迹法检测磷酸化测和总EGFR,Akt,Erk1/2,β-actin的表达;结果：1.体外实验说明CIK对A549/GR细胞杀伤力高于于A549细胞(P吉非替尼即能使CIK:A549/GR效靶比为5：1组中的联合杀伤率比单纯使用CIK细胞组(相同效靶比)细胞杀伤率增加至2.4倍,比单纯使用吉非替尼组(同剂量)增加7.2倍。且联合杀伤率与效靶细胞比值增高成正比。 2.效靶比CIK:A549/GR为5：1联合吉非替尼组与单纯使用吉非替尼组相比凋亡效应非常明显。 3.免疫印迹法检测结果表明：经过CIK联合吉非替尼组作用后的A549/GR细胞总EGFR, Akt,Erk1/2,β-actin均比对照组下降明显。结论：***可明显加强吉非替尼对A549/GR细胞的增殖抑制作用及凋亡效应。 ***具有部分逆转A549/GR细胞株耐吉非替尼的作用。 ***逆转吉非替尼耐药的原理可能是下调EGFR,Akt,Erk1/2,β-actin等的表达。

关键词： A549/GR CIK细胞吉非替尼耐药

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脂多糖对核转录因子-κB的激活在人肺非小细胞肺癌获得性耐药细胞中的作用

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国际免疫学杂志 2017年第3期40卷 238-242页

作者：臧家兰胡勇秦晓冰严大理吴建中马蓉冯继锋哈尔滨市第一医院肿瘤科 150010 南京医科大学附属肿瘤医院 210009 徐州市第一人民医院肿瘤内科 221000

目的本研究旨在通过检测脂多糖（lipopolysaccharide ,LPS）作用后人非小细胞肺癌耐药株细胞内核转录因子（nuclear factor-κB,NF）-κB p65表达量的变化,探讨LPS作用下NF-κB表达量的增高与吉非替尼获得性耐药产生的相关性.方法成... 详细信息

目的本研究旨在通过检测脂多糖（lipopolysaccharide ,LPS）作用后人非小细胞肺癌耐药株细胞内核转录因子（nuclear factor-κB,NF）-κB p65表达量的变化,探讨LPS作用下NF-κB表达量的增高与吉非替尼获得性耐药产生的相关性.方法成功诱导非小细胞肺癌细胞株HCC827对吉非替尼产生稳定的获得性耐药后,按设置的分组用LPS及吉非替尼处理细胞,采用CCK-8法检测处理后吉非替尼对细胞的半数抑制浓度（IC50值）,并与各自对照组相比较.细胞增殖曲线显示LPS作用对细胞增殖的影响.采用克隆形成实验显示LPS作用后对细胞增殖的影响.采用蛋白质印迹法检测LPS及吉非替尼处理后耐药株HCC827/GR-8-1细胞中凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2等蛋白的表达量,并检测NF-κB蛋白的表达量,探讨LPS作用后激活的NF-κB对细胞吉非替尼敏感性的调节.结果 LPS处理后,可以显著降低耐药细胞对吉非替尼的敏感性,细胞克隆形成实验及增殖曲线显示LPS并无明显促进细胞的增殖作用,但可以降低细胞对吉非替尼的敏感性.蛋白质免疫印迹结果显示,与对照组相比较,LPS可抑制Caspase-3等相关促凋亡蛋白的表达,而相应凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达上升.LPS处理48 h后NF-κB的表达量显著上调.LPS通过调节NF-κB表达量上升而参与细胞耐药机制的产生.结论经LPS作用后的非小细胞肺癌细胞对吉非替尼敏感性降低,LPS处理后细胞的NF-κB表达量显著增高,增高的NF-κB表达量与细胞对吉非替尼的药物敏感性下降相关.

关键词：非小细胞肺癌脂多糖吉非替尼耐药核转录因子-κB

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