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用于细胞内氧化还原状态可逆检测的近红外荧光探针的设计合成及生物应用

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用于细胞内氧化还原状态可逆检测的近红外荧光探针的设计合成及生...

作者：强明明山东师范大学

学位级别：硕士

细胞内氧化还原状态的平衡,对维持生物体细胞内的正常生理功能是极为重要的。细胞内的氧化还原状态平衡是通过控制细胞内还原性物质和活性氧的量，使这二者之间达到相对平衡来实现的。生物体内最重要的还原性物质是硫醇类物质。硫醇是... 详细信息

细胞内氧化还原状态的平衡,对维持生物体细胞内的正常生理功能是极为重要的。细胞内的氧化还原状态平衡是通过控制细胞内还原性物质和活性氧的量，使这二者之间达到相对平衡来实现的。生物体内最重要的还原性物质是硫醇类物质。硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞内的抗氧化系统中起着重要的作用。大量研究表明，生物体内的很多疾病的产生，严重依赖于这些硫醇类物质在生物体内的含量水平。对于活性氧（ROS）而言，一方面在细胞内信号转导等方面起着重要作用。另一方面活性氧若在体内过度产生，将会导致“氧化应激”,进而对细胞产生氧化损伤，与许多疾病也有着紧密的联系。因此，细胞氧化还原状态的动态变化可以为临床医学等领域提供丰富的生理、病理信息。荧光分析方法因其具有直观、简便、原位、信息丰富等特点，尤其与现代成像技术相结合已被广泛应用于生命分析领域，由此开发新的可以瞬时、动态可逆检测细胞内氧化还原状态变化的荧光探针，具有十分重要的意义。本文基于硫醇类化合物能特异性打断ebselen分子中的Se-N，导致ebselen分子中的五元环开环，之后通过H2O2的氧化作用五元环结构恢复，我们设计了一个能特异检测GSH/H2O2的近红外有机硒荧光探针。本文主要开展了以下两方面的研究工作：(一)我们以近红外花菁染料作为荧光母体，利用硒氮键与硫醇中巯基的特异性反应，以及ebselen五元环中的开关环反应的化学特性来设计了可逆荧光探针Cy-O-ebselen，该探针实现了化学体系和生理条件下对GSH和H2O2的可逆荧光应答，并且对GSH具有较高的选择性和灵敏度。并利用激光共聚焦荧光显微镜，成功实现了细胞内多个氧化还原循环的荧光成像，实验表明该探针可以很好地可逆检测活细胞内GSH的浓度变化，并且具有良好的膜透性和较低的生物毒性。此外，该探针的发射波长位于较长的近红外区域，可以有效地避免生物样品中自发背景荧光的干扰。因此，这种探针对细胞内氧化还原调控的生理功能、信号转导等领域的研究提供了新的研究途径和方法。（二）利用我们的近红外可逆荧光探针Cy-O-ebselen，检测HepG2细胞内氧化还原状态的变化对HepG2细胞凋亡过程的影响。并用Western-blot、细胞核染色、线粒体膜电位等方法监测了在这一凋亡过程中的信号指标。实验结果表明HepG2细胞内氧化还原状态的变化确实能够引起细胞的凋亡，并且我们的探针能够对这一过程进行可视化的监测。另外，我们用探针分别实时监测了肝癌细胞和肝细胞在由氧化还原环境的改变引起的凋亡的可逆性，实验发现在肝癌细胞中凋亡可以发生逆转，而正常的肝细胞则没有这种现象。总之，由GSH的含量水平引起的氧化还原状态的改变，在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，并且我们的探针可以为进一步研究氧化还原状态的改变在细胞凋亡、信号转导所起的作用提供新的工具。

关键词：含硒荧光探针谷胱甘肽氧化还原循环可逆检测共聚焦显微成像

细胞内自由基检测的新型荧光探针的设计合成及应用

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细胞内自由基检测的新型荧光探针的设计合成及应用

作者：夏雁青山东师范大学

学位级别：硕士

在生命有机体的新陈代谢活动中，各种活性物质如活性氧、活性氮、活性氯分子以及各种小分子代谢物等参与能量传递和信号转导，对细胞的生理病理过程起着重要调节作用。有机体通过调节硫醇类物质和活性氧自由基的含量，维持内部氧化还原... 详细信息

在生命有机体的新陈代谢活动中，各种活性物质如活性氧、活性氮、活性氯分子以及各种小分子代谢物等参与能量传递和信号转导，对细胞的生理病理过程起着重要调节作用。有机体通过调节硫醇类物质和活性氧自由基的含量，维持内部氧化还原状态的相对稳定，避免氧化损伤、氧化应激和还原应激的发生。因此，对细胞内各种氧化性物质(如活性氧)所介导的氧化还原循环的研究具有重要的生物学意义。次氯酸(HOCl)是生物体内一种重要的活性分子。通常在髓过氧化物酶(MPO)的催化作用下，H2O2与Cl-发生反应而产生HOCl。HOCl被认为是一种具有自然抗菌能力的亲核性非自由基氧化剂，对细胞的生理功能有着重要影响。虽然基于荧光探针的荧光分析法已经用于细胞内HOCl的检测研究，但是目前尚无可以对HOCl进行可逆响应的荧光探针，由此从一定程度上限制了对HOCl参与的细胞内氧化还原循环的深入研究。过氧亚硝基阴离子(ONOO)是生物有机体内一种极其重要的活性氧自由基。细胞内ONOO是由O·和NO反应产生。ONOO是一把双刃剑，它对有机体生物功能的影响既有有益的一面，也有不利的一面。利用荧光探针对ONOO进行检测和识别已取得了较大进展。现已报道的对ONOO有选择性响应的荧光探针中，能够实现专一可逆应答的还很少。所以设计一种对ONOO具有专一可逆荧光响应的有机小分子荧光探针，对于研究细胞内ONOO的生成、代谢及其相关的生理、病理机制具有重要意义。本论文基于可逆小分子荧光探针的设计合成及其细胞成像分析，开展了以下两部分研究： (一)用于可逆检测HOCl的新型荧光探针的设计合成及细胞成像研究氟硼二吡咯(BODIPY)是一种常见的荧光染料，在荧光探针研究中一般被作为探针母体，通过偶联识别基团构建探针。实验中我们发现其分子结构中的C=N双键可被NaS2O还原生成C-N单键，得到氢化产物。这种氢化产物能够选择性地被HOCl氧化，伴随荧光恢复，而此过程可以反复进行。在模拟生理条件下，我们以Br-BODIPY母体为荧光探针，实现了对NaS2O和HOCl的可逆荧光应答。探针选择性和光稳定性均令人满意。以小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)和HL-60细胞为生物模型，利用探针对HOCl的选择性可逆响应，实现了细胞内多个氧化还原循环的荧光成像。 (二)用于检测ONOO的新型近红外荧光探针的设计合成及细胞成像研究以近红外荧光染料***为母体，利用和硒同族的硫(S)的抗氧化性设计合成了一种新型近红外可逆有机小分子荧光探针。该探针对ONOO具有高效专一识别特性。在模拟生理条件下实现了探针对ONOO /GSH的可逆荧光应答。以小鼠巨噬细胞(Raw 264.7)为生物模型，实现了细胞内ONOO的可逆氧化还原循环荧光成像检测。

关键词：荧光探针次氯酸过氧亚硝基阴离子氧化还原循环可逆检测共聚焦显微成像

新型含硒荧光探针的合成及其在生物活性物质检测中的应用

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新型含硒荧光探针的合成及其在生物活性物质检测中的应用

作者：陈华超山东师范大学

学位级别：硕士

细胞内的氧化还原平衡状态对维持生物体的正常生理功能是极为重要的。细胞的氧化还原状态是通过控制活性氧和还原性物质的量使这二者之间达到平衡来实现的。一旦活性氧在体内过度产生,将会导致“氧化应激”的发生,进而对细胞产生危害。... 详细信息

细胞内的氧化还原平衡状态对维持生物体的正常生理功能是极为重要的。细胞的氧化还原状态是通过控制活性氧和还原性物质的量使这二者之间达到平衡来实现的。一旦活性氧在体内过度产生,将会导致“氧化应激”的发生,进而对细胞产生危害。由于氧化应激的爆发会引起氧化还原状态的失衡,许多疾病与活性氧有着紧密的联系。因此,研究细胞内氧化还原循环具有重要的生理学、病理学意义。过氧亚硝基阴离子(ONOO)是一种很强的氧化剂,在生物体中发挥着十分重要的作用。它是通过细胞内的一氧化氮和超氧阴离子发生反应生成的,对人体既有有利的一面,也有有害的一面。当ONOO的量处于细胞可控的范围内时,它有利于细胞发挥正常的生理功能。而当ONOO大量产生,超出了一定范围时则会引起DNA的损伤、脂质过氧化等对细胞有害的结果。在已报道的检测ONOO的方法中,荧光法与其他的方法相比具有显著的优势。此外,开发可逆的荧光探针用于监测细胞内ONOO浓度的变化对于研究ONOO的产生、代谢以及对细胞的动态损伤过程有着重要的意义。硒是一种公认的口服抗氧化剂,也是许多酶类的活性位点的重要组成部分。由于硒具有可发生氧化还原反应的化学性质,许多有机硒化合物可以模拟生物酶的催化功能。这些含硒化合物的重要的生理作用之一就是对ONOO的清除作用,进而保护细胞不被ONOO所损伤。2000年,Woznichak等人报道了含硒醚结构的化合物可以被ONOO氧化成相应的硒亚砜,并且可以被抗坏血酸还原回硒醚的结构,形成氧化还原循环过程。尽管有越来越多的证据表明,含硒化合物有抗ONOO氧化的作用,而且氧化后的产物还可以被体内的还原物质还原回初始状态,但是将硒元素融合到荧光探针里,用来可逆检测活细胞中的ONOO及氧化还原循环的成像到目前为止还未见报道。本论文基于含硒荧光探针与活性氧自由基或其它还原性物质特异性作用后荧光光谱发生可逆的改变从而实现对特定物质的可逆检测,并将所合成探针成功用于活细胞的荧光成像。主要开展了以下方面的研究工作: 基于硒的氧化还原特性以及它对ONOO的清除作用,我们选择近红外染料花菁作为荧光母体,设计合成了一种新型含硒近红外荧光探针(BzSe-Cy),用于选择性检测ONOO及细胞内氧化还原循环的成像。BzSe-Cy在生理条件下对ONOO和抗坏血酸有可逆的荧光响应,并且用于检测ONOO具有较好的选择性和灵敏度。共聚焦荧光成像实验显示,BzSe-Cy可以被成功地应用于小鼠巨噬细胞内ONOO的测定,并且可以对多个氧化还原循环进行荧光成像。该探针具有良好的膜透性和较低的细胞毒性。

关键词：含硒有机荧光探针过氧亚硝基阴离子氧化还原循环可逆检测共聚焦显微成像

几种新型传感器的设计合成及其对CN–的可视化检测研究

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几种新型传感器的设计合成及其对CN–的可视化检测研究

作者：何进军贵州师范大学

学位级别：硕士

氰化物(CN)在社会生产中有着广泛的应用,且在自然界广泛存在。CN又具有剧毒性,因而开发准确、高效的可视化(比色和荧光)传感器用于CN的检测具有重要的意义。结合前人的研究工作,本文设计合成了3种用于可视化检测CN的单分子传感器,具体... 详细信息

氰化物(CN)在社会生产中有着广泛的应用,且在自然界广泛存在。CN又具有剧毒性,因而开发准确、高效的可视化(比色和荧光)传感器用于CN的检测具有重要的意义。结合前人的研究工作,本文设计合成了3种用于可视化检测CN的单分子传感器,具体研究内容如下:1、设计合成并表征了一种同时含有咪唑-NH和偶氮酚-OH的视觉传感器S1。光谱实验数据表明,质子性水溶液有利于增强CN的选择性,在半水溶液中的检测限为纳摩尔级(nmol)。通过H NMR、HR-MS的滴定实验和计算HOMO-LUMO带隙间的能量变化,可以清楚地证明偶氮酚-OH的脱质子和分子内电荷转移增强所产生的视觉传感机制。此外,还研究了传感器在交替加入CN和H后的可逆性和重复使用性,通过可逆质子转移检测CN。2、设计合成并表征了一种基于Cu的双功能传感器体系(2S·Cu)。然后,通过在水溶液中2S·Cu传感体系的解聚和再生传感器S咪唑NH的脱质子,分别对CN和其它竞争物种(HPO和生物硫醇)进行连续判别传感。通过H NMR、HR-MS和HOMO-LUMO带隙之间的能量变化可以清楚地说明视觉传感机制。此外,研究了S和2S·Cu在CN/H和CN/Cu交替添加时的可逆性和可重复使用性。有趣的是,生物硫醇(Cys、GSH和Hcy)和CN的连续检测也通过光谱方法和测试纸条实现。该工作可能提供了一种可行的策略,通过基于Cu的传感体系来高选择性和灵敏度的区分CN、HPO和生物硫醇。3、通过磺酸基团的功能化,设计合成了以偶氮酚羟基为检测位点的全水溶性比色传感器S3(对磺酸基偶氮水杨醛吖嗪),其结构经由H NMR,HR-MS确证。S3在纯水以及自来水中对CN具有专一选择性的比色检测能力,最低检出限分别为0.16μM和0.64μM。可逆的质子转移机制赋予S3循环再利用的优势,借助于检测试纸,实现了纯水及自来水样中CN可逆的比色检测。该工作为纯水相中CN的检测提供了实验依据。

关键词：可视化传感器传感体系氰根离子纯水可逆检测

含硒有机荧光分子探针的设计、合成及生物应用

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含硒有机荧光分子探针的设计、合成及生物应用

作者：丁白瑜山东师范大学

学位级别：硕士

汞是环境学和生理学所研究的重要有毒重金属元素。即使是在很低浓度的条件下,也能产生一定的生理毒性。由于汞具有强生物透膜性,容易穿透人体的皮肤、呼吸道、肠胃组织,所以长时间暴露在含汞环境下会导致生物体的中枢神经系统和内分泌... 详细信息

汞是环境学和生理学所研究的重要有毒重金属元素。即使是在很低浓度的条件下,也能产生一定的生理毒性。由于汞具有强生物透膜性,容易穿透人体的皮肤、呼吸道、肠胃组织,所以长时间暴露在含汞环境下会导致生物体的中枢神经系统和内分泌系统产生永久性损伤。因此,研究汞离子的生物积累和生物毒性具有重要的生物医学意义。在生物体的新陈代谢过程中会不断产生各种自由基,如超氧阴离子自由基(O2-·)、羟基自由基(HO·)、脂自由基(ROO·)、一氧化氮(NO·)、过氧亚硝基阴离子(ONOO-)等都是生命活动过程中具有代表性的自由基,它们与生物体的衰老及许多疾病的发生都有重要的关系。生物体中适当水平的活性自由基是机体维持良好免疫应答的基础,但是一旦体内的氧化还原平衡遭到破坏,活性氧自由基大量存在时就会发生氧化应激并且损伤生物体内的各种蛋白、脂类、核酸等,从目前研究结果揭示的证据表明,活性自由基几乎和人类常见疾病如心脏病、癌症、恶性肿瘤等都有关。因此,可逆地监测生物内氧化还原循环具有重要的生理学和病理学意义。由于核酸、蛋白质、肽等生物活性分子在生命科学研究中的重要地位,近年来对检测细胞中生物活性分子的研究越来越多。其中,荧光法具有简单易行,便于操作,高灵敏度和选择性的显著特点,更加吸引人的是探针分子可以在不破坏生物活性的情况下进入细胞,与活细胞内的目标活性分子结合生成强荧光物质,并借助于激光共聚焦成像技术,实现细胞内待测活性分子的“可视化”,进而实现生命体内的“实时在线”检测。近年来,生物成像在活细胞的生物分子检测上取得了巨大进展,荧光探针由于其高灵敏度,实时监测等优点而成为生物成像最主要的工具。本论文基于荧光探针与活性氧自由基或其它生物活性分子特异性作用后,荧光光谱性质发生改变从而实现对特定物质的检测,并将所设计探针成功应用于生物活体细胞的共聚焦显微成像。本文主要开展了以下两方面研究工作:(一)根据硒对重金属离子的重要的抗毒性作用,我们设计合成了一种有机硒荧光探针(FSe-1)用于生物体系的汞离子检测。由于汞离子的强亲硒性质,探针FSe-1与汞离子发生不可逆的脱硒反应。探针FSe-1利用硒汞间的强亲合力将硒作为靶位点,对汞离子检测表现超高的选择性和灵敏度,其检测限达到1.0 nM。探针FSe-1的超高选择性表现为多种生物分析物和相关金属离子均不会对汞离子检测产生干扰。此外,运用激光共聚焦扫描显微镜,成功实现了该探针对小鼠巨噬细胞RAW 264.7内的汞离子荧光成像。(二)氧是好氧生物新陈代谢的关键性物质,它参与为生命活动提供必需能量的过程。然而在能量产生的同时,也会使生物体内活性氧(ROS)水平发生变化,继而产生一定的生理学和病理学影响,因此检测细胞内氧化还原循环具有重要意义。基于有机硒化合物的药用价值,近年来人们合成了大量的有机硒药物。研究发现含硒抗高血压药物HoMePASe具有良好的抗氧化作用,由此我们设计合成两种近红外有机硒荧光探针用于可逆地检测细胞内氧化还原循环,并运用激光共聚焦扫描显微镜,实现活细胞内的氧化还原循环的动态荧光成像。

关键词：含硒有机荧光探针汞离子氧化还原循环可逆检测共聚焦显微成像