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发根农杆菌对绞股蓝的转化及毛状根中皂甙的产生

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Acta Botanica Sinica 1993年第8期35卷 626-631页

作者：费厚满梅康凤沈昕叶益民林忠平彭立红北京林业大学森林生物实验中心中国科学院植物研究所

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)R1600菌株感染绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)叶外植体10天后,在外植体切口处便出现毛状根,28天后,转化率高达94%。毛状根经Southern分析,证明确已被转化。毛状根生长速度很快,在无激素的MS培养基中悬浮培养20天,其生物量增加9倍,并无愈伤组织产生。毛状根中总皂甙含量约为自然根的2倍。在悬浮培养过程中,培养物向培养基中分泌一定量的皂甙。

关键词：绞股蓝发根农杆菌毛状根皂甙

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发根农杆菌Ri对北五味子的遗传转化研究

黑龙江畜牧兽医 2005年第7期 69-70页

作者：郑茂波哈尔滨学院生命科学与化学学院黑龙江哈尔滨150086

20年来,应用植物细胞大量培养技术生产植物有用次生代谢物的研究取得了许多突破性进展.据估计,已经从400多种植物建立了组织和细胞培养物,从中分离出600多种次生代谢物,其中40多种化合物在数量上超过或等于原植物,为通过细胞培养技术工... 详细信息

20年来,应用植物细胞大量培养技术生产植物有用次生代谢物的研究取得了许多突破性进展.据估计,已经从400多种植物建立了组织和细胞培养物,从中分离出600多种次生代谢物,其中40多种化合物在数量上超过或等于原植物,为通过细胞培养技术工业化生产植物有用次生代谢物奠定了基础[1].

关键词：发根农杆菌遗传转化北五味子 20世纪80年代植物次生代谢物细胞培养技术 Ri质粒转化突破性进展细胞培养物工业化生产植物细胞生长速度遗传操作生化特性毛状根 600 原植物化合物根结构

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发根农杆菌K599转化大豆绥农28的研究

内蒙古农业大学学报（自然科学版） 2014年第4期35卷 71-74页

作者：王光霞王瑞刚许建芳曲飞内蒙古农业大学生命科学学院呼和浩特010018 内蒙古阿拉善盟阿右旗农业技术推广站巴丹吉林镇737300

以大豆绥农28为材料,用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599浸染转化后诱导产生发根,通过β-葡聚糖苷酶（GUS）染色进行效率检测,确定毛状根转化的最佳条件。结果表明绥农28大豆品种发根诱导高效转化的条件如下：在1/2MSB5＋20... 详细信息

以大豆绥农28为材料,用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599浸染转化后诱导产生发根,通过β-葡聚糖苷酶（GUS）染色进行效率检测,确定毛状根转化的最佳条件。结果表明绥农28大豆品种发根诱导高效转化的条件如下：在1/2MSB5＋20g/L蔗糖＋琼脂7g/L,p H5.8萌发培养基上萌发5~6d的大豆子叶节为外植体,当菌液侵染时间为20min,共培养基p H5.4的条件时,发根转化率为58.57%。

关键词：大豆发根农杆菌转化

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发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立与应用

发根农杆菌诱导大豆毛状根体系的建立与应用

作者：宗晓秋中国农业科学院

学位级别：硕士

发根农杆菌通过伤口侵染植物，Ri质粒上T-DNA所携带的基因在宿主细胞中整合表达，诱导植物产生毛状根。诱导产生的毛状根保持了正常根组织的形态及功能，其具有激素自养、生长速度快、遗传稳定等特点。毛状根分之多、侧根丰富，为大豆... 详细信息

发根农杆菌通过伤口侵染植物，Ri质粒上T-DNA所携带的基因在宿主细胞中整合表达，诱导植物产生毛状根。诱导产生的毛状根保持了正常根组织的形态及功能，其具有激素自养、生长速度快、遗传稳定等特点。毛状根分之多、侧根丰富，为大豆孢囊线虫提供了大量的侵染位点，是研究大豆孢囊线虫与植物根部互作的良好材料。向大豆幼苗注射农杆菌的方法可成功诱导毛状根的产生。大豆幼苗栽种在土壤5-7d，向靠近子叶及初生根的幼苗胚轴注射农杆菌的单菌落，密闭、高湿环境下诱导产生毛状根，GUS染色检测转化的毛状根。实验结果表明：中黄13、自贡冬豆、黑豆51三个品种大豆经诱导均能产生无分支的毛状根，三者毛状根的数量没有显著差异（p＞0.05）。注射农杆菌的浓度及注射位点的位置都会影响幼苗产生毛状根的数量和毛状根转化率：注射农杆菌单菌落诱导产生毛状根的数量和转化率都显著高于注射菌液产生毛状根的数量和转化率（p＜0.05）;靠近初生根胚轴产生毛状根数量显著高于靠近子叶节产生毛状根的数量，但前者的转化率却显著低于子叶节胚轴毛状根的转化率。大豆幼苗栽种在培养基中，向靠近初生根的幼苗胚轴注射农杆菌的单菌落，经过诱导、除菌培养基的培养，最终将幼苗移至含卡那霉素100mg/L的1/2MS固体培养基筛选转化的毛状根。结果证实：土壤介质诱导产生的毛状根数量与培养基介质诱导产生的毛状根数量差异显著（p＜0.05）。外植体浸泡在农杆菌菌液中诱导产生毛状根：大豆种子萌发采用水琼脂培养基，留有子叶节的子叶作为外植体浸泡在A600OD为0.6的农杆菌菌液中15min，外植体转移至1/10MS固体培养基+0.02g/L乙酰丁香酮培养基黑暗培养3～5d，1/2MS液体培养基清洗外植体并置于1/2MS+羧苄青霉素钠（250mg/L）+头孢霉素（250mg/L）除菌培养基，除菌彻底后将外植体转移至1/2MS固体培养基，25℃、12h/d光照条件诱导产生毛状根。切取转化毛状根的根尖于1/2MS液体培养基继代培养，用于线虫接种。子叶节处长出的毛状根主根不明显，侧根丰富，呈负向地性。黑豆44经诱导产生的毛状根数量最多，显著多于中黄13和黑豆51;并且黑豆44毛状根转化率显著高于中黄13，但与黑豆51毛状根转化率没有显著差异。光照或黑暗培养对中黄13产生毛状根的效率没有显著影响，但黑豆44与黑豆51在黑暗培养条件下子叶产生的毛状根数明显高于光照培养条件下产生的毛状根数。转化毛状根及其继代培养根系在GUS染色检测中呈阳性，PCR反应也检测到转化毛状根及继代培养根系中的标记基因（GFP基因）。证明农杆菌Ri质粒上的T-DNA已经整合到大豆细胞的基因组。浸泡法和注射法均可高效地诱导大豆中黄13、黑豆44、黑豆51、自贡冬豆产生毛状根，不同大豆品种毛状根数量及转化率差异明显。大豆孢囊线虫（4号小种）接种毛状根条件的优化：0.1%氯化汞+0.5%的洗必肽溶液对线虫表面进行消毒，线虫的接种密度为500头/mL，接种培养基琼脂浓度为0.8%时，线虫的侵染效率最高。计算线虫侵染率结果表明：接种密度过大（2000头/mL），线虫个体间竞争激烈，降低了侵染效率。液体培养基中，线虫几乎不侵染毛状根;接种培养基琼脂浓度为1.0%、1.2%、1.4%、1.6%时，线虫的侵染效率没有显著差异。大豆孢囊线虫能够侵染三个品种大豆毛状根，2龄幼虫进入到植物根系后向维管束移动，最终聚集在维管束周围。毛状根中观察到成熟雌虫，说明大豆孢囊线虫在毛状根中能完成发育过程。孢囊线虫2龄幼虫对黑豆51的侵染效率显著高于黑豆44和中黄13。本研究建立的大豆发根体系为大豆孢囊线虫致病相关基因功能验证及致病机制研究的转化提供了重要技术基础，对探索大豆孢囊线虫致病机制及抗线虫大豆品种选育具有重要的意义。

关键词：大豆毛状根大豆孢囊线虫接种发根农杆菌

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发根农杆菌介导八宝景天遗传转化体系的建立

发根农杆菌介导八宝景天遗传转化体系的建立

作者：王艳河北农业大学

学位级别：硕士

经发根农杆菌(rhizogenes)转化的植株不仅表现出生根能力明显提高,而且通常还表现出叶片和花的形态、色素形成、节间长短、生活周期及向地性等性状的可遗传的变异,其中许多变异如植株矮化、节间缩短、花形和叶形改变等在园林植物品种改... 详细信息

经发根农杆菌(rhizogenes)转化的植株不仅表现出生根能力明显提高,而且通常还表现出叶片和花的形态、色素形成、节间长短、生活周期及向地性等性状的可遗传的变异,其中许多变异如植株矮化、节间缩短、花形和叶形改变等在园林植物品种改良中有很大的应用价值。本文拟通过发根农杆菌转化八宝景天(Sedum Spectabile Boreau)来获得转基因植株并且筛选优良新品种。采用八宝景天嫩茎作为外植体进行组织培养,在附加不同浓度激素的培养基上对其进行增殖、生根培养,诱导叶片愈伤组织的发生及叶片愈伤组织不定芽的分化,建立其叶片再生体系。在建立八宝景天叶片再生体系的基础上,研究影响八宝景天遗传转化的若干因素,通过遗传转化条件的优化,采用农杆菌介导法,建立了发根农杆菌遗传转化体系,获得了转基因植株。对转化再生植株进行了形态鉴定、PCR检测,并对转化植株形态及生长变异进行了初步研究,主要研究结果如下:1.叶片外殖体高效再生系统的建立:筛选出适宜八宝景天分化培养基是不附加任何激素的MS培养基,适宜生根培养基是不附加任何激素的1/2MS培养基,适宜诱导叶片愈伤组织发生的培养基是MS+6-BA 0.3mg. L-1+NAA 0.1mg. L-1,适宜诱导叶片愈伤组织不定芽分化的培养基是MS+6-BA 0.3mg. L-1+NAA 0.1mg. L-1。研究了暗培养对诱导叶片不定芽的影响,结果表明,暗培养5d有利于不定芽的诱导。2.头孢噻肟钠(CTX)对诱导八宝景天叶片不定芽的影响和对农杆菌的抑菌效果:确定适宜的CTX浓度为400 mg.L-1。3.影响农杆菌转化效率的几个主要因素:发根农杆菌活化次数、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定影响,在转化过程中菌株活化3次以上,菌液浓度OD600=0.4,侵染时间10min ,共培养2 d,有利于获得最高遗传转化效率。4.转基因植株的获得:利用介导法将发根农杆菌转入八宝景天叶片中,获得了转基因植株,对转基因植株进行了PCR检测,证明发根农杆菌Ri质粒已整合到八宝景天基因组中。5.转基因植株形态及生长变异的研究:发现与未经转化的八宝景天组培苗相比,大部分转基因植株矮化,茎分支能力增强,节间距缩短,生根系数增高,叶片颜色变黄。

关键词：八宝景天组织培养叶片再生发根农杆菌遗传转化生长变异

发根农杆菌介导苹果毛状根遗传转化体系的建立

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发根农杆菌介导苹果毛状根遗传转化体系的建立

作者：王玉珠西北农林科技大学

学位级别：硕士

苹果(Malus domestica)是世界上产量最高的水果之一,被誉为“温带水果之王”,我国每年生产和消费的苹果均占全世界总量的一半。目前,国内外苹果常用的遗传转化体系,主要为“叶盘法”,该方法是利用根癌农杆菌侵染苹果外植体的叶片,短期... 详细信息

苹果(Malus domestica)是世界上产量最高的水果之一,被誉为“温带水果之王”,我国每年生产和消费的苹果均占全世界总量的一半。目前,国内外苹果常用的遗传转化体系,主要为“叶盘法”,该方法是利用根癌农杆菌侵染苹果外植体的叶片,短期共培养,后期经过不同条件的诱导获得苹果转基因株系。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)在苹果遗传转化技术体系中的应用,主要是为了解决一些苹果珍稀品种使用现有组培体系难以生根的问题以及使用发根农杆菌诱导获得转基因毛状根间接分析基因功能等。迄今为止,接种发根农杆菌获得苹果毛状根并使其再分化进而获得苹果转基因再生植株的研究尚未报道。本研究从转基因角度出发,以野生型苹果‘GL-3’植株的茎干为实验材料,通过组织培养技术的优化,建立了一种新的苹果再生和遗传转化体系。主要试验结果如下:1、发根农杆菌诱导苹果‘GL-3’茎秆毛状根的形成。结果发现:4.43g/LMS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂粉或4.43g/L1/2MS+30 g/L蔗糖+7.5g/L琼脂粉,灭菌后添加500mg/L头孢霉素,两种培养基都可以培养分化获得毛状根,使用两种生根培养基中毛状根的生长状态无显著差异。2、毛状根再分化获得不定芽的再生体系的优化。该再生体系为将毛状根接种至芽诱导培养基中,暗培养14d后见光培养30d。实验通过摸索与优化毛状根再分化体系,结果发现,毛状根再分化获得不定芽的最适芽诱导培养基为:4.43g/LMS+0.5mg/LB5+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+2.5g/L植物凝胶。3、发根农杆菌介导的苹果遗传转化。将含有修饰载体p Cambia1301的发根农杆菌用于植物侵染转化,该载体结合了GFP报告基因和三叶苷合成关键基因Md PGT2。获得的转基因毛状根通过再生体系获得不定芽,然后利用荧光鉴定进行初步筛选,再通过分子检测确定为其转基因不定芽,最后通过高效液相色谱分析获得的转基因植株,确定其积累大量三叶苷。

关键词：苹果发根农杆菌毛状根组培转基因

发根农杆菌介导的油菜根肿病抗病相关基因功能验证体系的构建

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发根农杆菌介导的油菜根肿病抗病相关基因功能验证体系的构建

作者：袁磊华中农业大学

学位级别：硕士

根肿病是由原生生物芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)造成的一种具有专一寄生性的土传性病害,专性寄生十字花科作物。随着农耕技术的发展及各国间活动交流增多,根肿病在世界范围内不断蔓延。近年来,根肿病对我国的十字花科... 详细信息

根肿病是由原生生物芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron)造成的一种具有专一寄生性的土传性病害,专性寄生十字花科作物。随着农耕技术的发展及各国间活动交流增多,根肿病在世界范围内不断蔓延。近年来,根肿病对我国的十字花科作物生产造成了巨大影响,且呈现蔓延趋势。在对根肿病的防治过程中,培育抗病品种被认为是最有效、最经济也是最为安全的防治方式。抗病资源的筛选和抗病基因的挖掘显得尤为关键。而对于抗病基因的功能验证,目前的以农杆菌介导的传统稳定转化操作过于繁琐,工作量大且历时较长,不利于大批量的基因功能验证。因此,构建一套高效、快捷的根肿病抗病相关基因功能研究体系具有重大意义。本研究旨在构建一套更为简洁,效率更高的验证体系,作为后续基因功能验证的有效手段。主要研究结果如下:1、以发根农杆菌K599介导的油菜带柄子叶遗传转化体系的研究将带有GUS标签的载体转进发根农杆菌K599后,参照稳定转化流程,设计发根农杆菌侵染步骤,侵染后发现K599能诱导油菜甲9709品种带柄子叶产生再生根,对再生根进行GUS染色,可获得转入GUS标签的染色根系,侵染效率为44.5%,存在有单株根系非转化根和转化根共存的情况。表明发根农杆菌K599可诱导油菜带柄子叶产生再生根,初步探索了通过发根农杆菌介导的过表达基因的体系,但效率并不够高且存在有非转化根系干扰现象。2、发根农杆菌A4侵染油菜带柄子叶的研究:K599侵染产生的再生根存在非转化根、转化效率不高的情况,通过选用对十字花科作物转化率更高的A4发根农杆菌进行更深一步的实验。对发根农杆菌诱导自生根的生长及生根速率进行了实验,发现切除下胚轴的油菜409S品种带柄子叶不经过菌液侵染也能产生再生根。将带GUS标签菌液侵染带柄子叶后,着色比例为53.33%,即侵染效率要高于K599。同时GUS表达量也较对照显著增高,证明该载体35S启动子对基因超表达效果较好。由于存在自生根的影响,设计实验探索Basta作为筛选压的可能性,结果发现Basta浓度的提高会在一定程度上抑制自生根的生长,但即使提升到100ng/ml的浓度时,仍有部分自生根长出,且对地上部分也会造成负面影响,表明Basta不适合作为筛选压。此外,通过转入过表达CRa载体,菌液侵染长根后接菌调查,病情指数为0.48,远低于感病材料,证明CRa侵染后具有抗病表型起到了抗病作用。至此,通过A4发根农杆菌诱导再生根后进行接菌验证候选基因功能的体系基本构建成功,但仍需实验对体系进行完善。本研究还通过不同荧光蛋白标签的载体共表达探索抗病基因聚合表达的可能性,将GFP和Red荧光载体转入发根农杆菌,混合侵染获得再生根,利用荧光共聚焦显微镜观察到GFP和Red共表达,但得到的共表达根系仅有一颗,效率较低。3、通过注射法构建发根农杆菌介导的基因过表达体系由于菌液侵染存在的非转化根系干扰,本研究对一种区别于侵染诱导再生根的体系进行了初步验证,通过对生长20d～30d的油菜苗期材料进行注射,注射油菜茎节处获得了再生根,效率约为25%～40%。该方法更为简单、快捷,且已在其他植物中有报道,转化后的再生根皆为阳性转化根系。本实验对该方法在油菜中的应用进行了初步探索,后续可将抗病基因转入和根肿菌接菌验证结合,完善该体系。

关键词：根肿菌发根农杆菌抗病基因功能验证注射侵染

发根农杆菌介导的甜瓜CRISPR/Cas9系统靶位点的检测

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中国瓜菜 2024年第8期37卷 15-23页

作者：朱蕾黑龙江省农业科学院大庆分院黑龙江大庆163711

选取甜瓜栽培材料龙庆八号作为受体材料,构建CmCURT1A基因CRISPR/Cas9基因编辑载体,经发根农杆菌介导检测靶位点的编辑情况,为后续甜瓜遗传转化试验提供载体基础。以甜瓜CmCURT1A基因(ID:MELO3C006053.2)为靶基因构建双靶位点敲除载体,... 详细信息

选取甜瓜栽培材料龙庆八号作为受体材料,构建CmCURT1A基因CRISPR/Cas9基因编辑载体,经发根农杆菌介导检测靶位点的编辑情况,为后续甜瓜遗传转化试验提供载体基础。以甜瓜CmCURT1A基因(ID:MELO3C006053.2)为靶基因构建双靶位点敲除载体,经发根农杆菌K599介导的简单遗传转化技术使甜瓜组织长出不定根,经PCR测序发现在不定根中分别存在65 bp、72 bp不同碱基片段的缺失。该方法成功进行了甜瓜CRISPR/Cas9载体靶位点敲除情况的检测,简单高效,实现了在甜瓜中基因编辑靶点的快速鉴定,为研究甜瓜基因功能和遗传改良奠定基础。

关键词：甜瓜 CRISPR/Cas9 发根农杆菌基因敲除

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发根农杆菌转化茶树的研究

湖南农业大学学报（自然科学版） 2006年第2期32卷 190-194页

作者：彭正云刘德华肖海军蒋立文张丽霞向勤锃唐道方湖南农业大学园艺园林学院湖南长沙410128 山东农业大学园艺学院山东泰安271018

以3个品种茶树的不同部位、器官为材料,探讨发根农杆菌转化茶树及毛状根增殖的条件.感染1025菌种的大红品种茎段,在添加IBA 0.4mg/L的1/2MS培养基上诱导出了毛状根.茶树毛状根细如头发,着生稀疏长根毛,具有激素自主性、分枝多、生长快... 详细信息

以3个品种茶树的不同部位、器官为材料,探讨发根农杆菌转化茶树及毛状根增殖的条件.感染1025菌种的大红品种茎段,在添加IBA 0.4mg/L的1/2MS培养基上诱导出了毛状根.茶树毛状根细如头发,着生稀疏长根毛,具有激素自主性、分枝多、生长快等特点.经正交试验,将1/2MS培养基的KNO3,NH4NO3质量浓度降至MS培养基的1/8时的培养基,是毛状根伸长、分枝较好的基本培养基.添加IBA 0.2mg/L的培养基,毛状根的伸长、分枝优于添加IBA 0.1mg/L的培养基,但在毛状根上出现少量愈伤组织.

关键词：茶树发根农杆菌毛状根转化