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反向斑点杂交法快速检测HBV基因型反应条件的优化和建立

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中国生物工程杂志 2009年第12期29卷 85-89页

作者：赵丽张文露胡源刘彦辰赖国旗杨凤黄爱龙重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室重庆400016

利用反向斑点杂交技术,设计出特异性基因分型探针,并将探针固定在带正电荷的尼龙膜上,与PCR扩增带有地高辛标记的临床血清样本进行杂交。通过优化杂交反应条件,建立起简单、快速、特异地检测HBV基因型的方法。利用该方法对重庆地区临床... 详细信息

利用反向斑点杂交技术,设计出特异性基因分型探针,并将探针固定在带正电荷的尼龙膜上,与PCR扩增带有地高辛标记的临床血清样本进行杂交。通过优化杂交反应条件,建立起简单、快速、特异地检测HBV基因型的方法。利用该方法对重庆地区临床样本进行分型检测,并与直接测序结果比较。结果表明新建的HBV基因分型方法可对拷贝数在103以上的血清样本准确分型,特异性达到96.67%。重庆地区感染HBV主要以B型为主。

关键词：反向斑点杂交 HBV 基因型临床样本

反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异的应用和评价

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中山大学学报（医学科学版） 2009年第4期30卷 428-432页

作者：张太松董瑞华李建芳林炳生雍万军胡守旺李明周新宇中山大学达安基因诊断中心∥卫生部医药生物工程技术研究中心广东广州510665

【目的】采用反向斑点杂交技术对拉米夫定治疗后的慢性乙型肝炎患者血清中HBV YMDD基序变异进行检测,并对其临床应用进行方法学评价。【方法】提取242例慢性乙型肝炎患者血清中HBV DNA,经聚合酶链反应后进行膜条杂交并同测序比较分析检... 详细信息

【目的】采用反向斑点杂交技术对拉米夫定治疗后的慢性乙型肝炎患者血清中HBV YMDD基序变异进行检测,并对其临床应用进行方法学评价。【方法】提取242例慢性乙型肝炎患者血清中HBV DNA,经聚合酶链反应后进行膜条杂交并同测序比较分析检测结果的一致性,随后对该方法进行灵敏度和混合感染检测能力的评价。【结果】242例样本检测结果有236例与测序结果相符,反向斑点杂交检测结果同测序结果的符合率达97.5%;混合型感染58例,占样品总数的24%。反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异的灵敏度达103IU/mL,在病毒混合感染群体中能检测出约占10%的突变型病毒株。【结论】反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异具有简单、准确、经济实用的特点,具有很好的临床应用前景。

关键词：乙型肝炎病毒(HBV) 突变耐药反向斑点杂交

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反向斑点杂交快速检测肺炎链球菌

新医学 2004年第3期35卷 145-146,156页

作者：樊慧珍黄文杰梁昆于化鹏广州军区广州总医院呼吸科 510010 第一军医大学附属珠江医院呼吸科 510282

目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法。方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的... 详细信息

目的:建立一种利用DNA探针快速检测肺炎链球菌的反向斑点杂交方法。方法:在肺炎链球菌特异的自溶素基因序列内设计引物,聚合酶链反应合成1段263bp的DNA探针,然后用生物素标记的细菌DNA与该探针行反向斑点杂交,并将该方法应用于痰样本的检测。结果:所合成的探针具有高度特异性,与其他细菌间无交叉反应,该方法能检测出10ng细菌DNA。50份痰标本肺炎链球菌培养阳性者8份,杂交阳性者12份,PCR阳性者18份。结论:反向斑点杂交具有快速、敏感、特异的优点,对肺炎链球菌的快速诊断有重要意义。

关键词：反向斑点杂交检测肺炎链球菌 DNA探针脱氧核糖核酸探针聚合酶链反应

反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价

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检验医学 2010年第12期25卷 947-951页

作者：张韧王敏符瑞佳李娟陈建平何蕴韶广州中医药大学微生物与寄生虫教研室广东广州510006 广州市荔湾区疾病预防控制中心广东广州510176 中山大学达安基因诊断中心广东广州510080

目的评价用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型的反向斑点杂交(RDB)方法。方法应用RDB检测723例HBV阳性标本的HBV基因型。其中对423例HBV序列测序结果清晰可读的样本进一步使用NCBI在线数据库分析、系统进化法分析其HBV基因型,并与RDB法结... 详细信息

目的评价用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型的反向斑点杂交(RDB)方法。方法应用RDB检测723例HBV阳性标本的HBV基因型。其中对423例HBV序列测序结果清晰可读的样本进一步使用NCBI在线数据库分析、系统进化法分析其HBV基因型,并与RDB法结果进行比较。将样本HBV序列与所用的探针序列进行比对,以评价单个碱基突变对该方法的影响。结果 RDB法检测的检出率为97.6%。RDB检测结果与NCBI在线数据库分析法的一致性为98.8%;与系统进化分析法一致性为100%。与对应探针有1个碱基差异的HBV A型1例、B型12例、C型46例和D型1例均被成功检出。结论 RDB是一种灵敏、准确、有效,且具有很高临床应用价值的HBV基因型检测方法。单碱基的突变不会影响其对HBV的分型结果。

关键词：乙型肝炎病毒基因型反向斑点杂交

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反向斑点杂交检测泰泽病原体

中国实验动物学报 2014年第3期22卷 72-77页

作者：赵婷婷严磊魏立雯韦莉王会娟赖国旗谭毅重庆医科大学实验动物中心重庆400016 泸州医学院科技处实验动物中心四川500016 重庆市中药研究院重庆400065

目的建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体(Tyzzer’s organism)的反向斑点杂交方法(reverse dot blot,RDB)。方法根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针,上游引物用生物素标记,进行PCR扩增,建立反向斑点杂... 详细信息

目的建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体(Tyzzer’s organism)的反向斑点杂交方法(reverse dot blot,RDB)。方法根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针,上游引物用生物素标记,进行PCR扩增,建立反向斑点杂交方法,用此法进行了特异性和灵敏度实验,同时,用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测。结果 RDB特异性强,最低检测限为4.5 ng/μL。对79例实验动物的检测中,与ELISA检测结果一致性为100%,阳性率是7.59%(6/79);与IFA一致性为92.4%(73/79),IFA阳性率是0%。结论建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法。

关键词：泰泽病原体反向斑点杂交实验动物

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反向斑点杂交方法检测猪常见致病菌的研究

反向斑点杂交方法检测猪常见致病菌的研究

作者：曹峰子河北农业大学

学位级别：硕士

当前传染病的发病特点是多病原混合感染增多,使病情复杂化,增加了临床诊断的难度。快速﹑灵敏﹑准确﹑特异性检测猪的致病菌是有效预防感染性疾病发生和控制其迅速传播的前提和关键。本文的研究目的是建立针对猪的多种致病菌的基因芯片... 详细信息

当前传染病的发病特点是多病原混合感染增多,使病情复杂化,增加了临床诊断的难度。快速﹑灵敏﹑准确﹑特异性检测猪的致病菌是有效预防感染性疾病发生和控制其迅速传播的前提和关键。本文的研究目的是建立针对猪的多种致病菌的基因芯片检测技术平台,为临床诊断提供快速﹑有效的诊断手段。从美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库中下载了大肠杆菌K88基因序列并设计了一条大肠杆菌K88基因探针、一段带K88探针的报告基因和一对报告基因的反向PCR引物。并将23S rRNA基因芯片用的针对12种细菌的25-30 bp探针加长到30-38 bp,两对通用引物序列不变,用地高辛取代荧光标记下游引物,用尼龙膜取代玻片为载体制备膜芯片,检验了探针/膜杂交的特异性和敏感性。在PCR体系中增加封口的K88报告基因和反向PCR引物对,被检样品扩增后做膜杂交。修改的13条探针与参考目标菌株在膜上成特异性杂交;膜杂交的最小检出量为100 fg DNA,均与玻片芯片接近。对5个参考菌株和34个野外分离株的检测准确率为35/39 (89.7%) ,也与玻片芯片接近。在尼龙膜上增加K88探针,与3重PCR产物杂交,可以检测到大肠杆菌K88毒力基因。建立的反向斑点杂交方法简便快速,可用于仪器设备不足的实验室和低成本检测,同时可以加入检测如大肠杆菌K88等致病基因,提高基于保守基因的芯片之诊断能力。本研究可能为临床诊断提供一个有用的平台。

关键词：反向斑点杂交 23S rRNA基因致病基因寡核苷酸反向PCR

H5和H9亚型禽流感病毒反向斑点杂交同步检测法的建立

同方学位论文库评论

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同方学位论文库

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2010年第4期38卷 7-13页

作者：王伟薛强邹明强柴同杰田甜山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 中国检验检疫科学研究院北京100123

【目的】建立H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交鉴别诊断方法。【方法】在H5和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内,选择设计2对引物,RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pGEM-T-H5与pGEM-T-H9。以重组质粒为... 详细信息

【目的】建立H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交鉴别诊断方法。【方法】在H5和H9亚型禽流感病毒血凝素基因的保守区段内,选择设计2对引物,RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中,得到重组质粒pGEM-T-H5与pGEM-T-H9。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针与生物素标记引物。将探针通过紫外交联方法固定在带正电荷的尼龙膜上,用生物素标记引物扩增特异性片段,扩增产物经热变性后与探针进行杂交,杂交后显色,出现明显蓝紫色斑点的判定为阳性,无斑点判定为阴性。【结果】利用建立的反向斑点杂交方法检测,H5、H9亚型禽流感病毒的血凝效价分别可达到2-9.6和2-11.9,杂交特异性好,且2亚型间无交叉反应。【结论】建立了H5和H9亚型禽流感病毒的反向斑点杂交检测方法,该方法灵敏度高、特异性好,可以实现H5与H9亚型禽流感病毒的鉴别诊断。

关键词：反向斑点杂交 H5 H9亚型禽流感病毒血凝素灵敏性稳定性

运用反向斑点杂交技术检测四川地区结核分枝杆菌katG基因315位点的突变(英文)

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四川大学学报（自然科学版） 2009年第5期46卷 1569-1574页

作者：郭建华向文良朱佳伟罗涛杨志荣孙群四川大学生命科学学院成都610064 成都市结核病防治院检验科成都610016

运用反向杂交技术检测四川地区65株耐异烟肼和10株异烟肼敏感结核分枝杆菌katG基因315位点的突变,并用DNA直接测序法验证杂交结果.结果显示在65株耐异烟肼结核分枝杆菌中,发现41株在忌katG基因315位点发生突变,突变率最大的是AGC-ACC,占... 详细信息

运用反向杂交技术检测四川地区65株耐异烟肼和10株异烟肼敏感结核分枝杆菌katG基因315位点的突变,并用DNA直接测序法验证杂交结果.结果显示在65株耐异烟肼结核分枝杆菌中,发现41株在忌katG基因315位点发生突变,突变率最大的是AGC-ACC,占90%,其次是AGC→AAC和AGC→ATC突变.DNA序列测定结果进一步验证了反向杂交的结果.运用反向杂交技术检测四川地区结核分枝杆菌katG基因315位点的突变的检出率和特异性分别是63%和100%.

关键词：结核分枝杆茵异烟肼 KatG 基因反向斑点杂交四川地区

应用反向斑点杂交技术从转录序列的选择性捕获中筛选副猪嗜血杆菌表达差异基因

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农业生物技术学报 2009年第2期17卷 189-194页

作者：胡军勇金卉谢启运万云楚杰刘翠云陈焕春周锐华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室

通过对靶DNA的种类和浓度、探针浓度、紫外交联时间等反向斑点杂交条件优化,建立了一种从选择性捕获的转录序列(selective capture of transcribed sequences,SCOTS)库中筛选副猪嗜血杆菌在体内、外差异表达的基因的方法。通过反向斑点... 详细信息

通过对靶DNA的种类和浓度、探针浓度、紫外交联时间等反向斑点杂交条件优化,建立了一种从选择性捕获的转录序列(selective capture of transcribed sequences,SCOTS)库中筛选副猪嗜血杆菌在体内、外差异表达的基因的方法。通过反向斑点杂交技术从10个样品中筛选出的6个样品被证明是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)在体内上调表达或者是特异表达的基因。结果表明:SCOTS技术能够有效地获得一个可能存在差异表达基因的cDNA文库,而反向斑点杂交技术可以有效地从中筛选到差异表达基因。

关键词：副猪嗜血杆菌差异表达基因转录序列的选择性捕获反向斑点杂交