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反义寡核苷酸对转化生长因子β2刺激的人眼球筋膜囊成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响

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中华眼科杂志 2008年第2期44卷 157-162页

作者：胡义珍王育红曹阳张明昌华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科武汉430022 武汉爱尔眼科医院

目的研究结缔组织生长因子（CTGF）在滤过泡瘢痕化形成中的作用。方法对照实验研究。应用二甲基四氮唑盐（MTT）法检测脂质体对人眼球筋膜囊成纤维细胞（HTF）活性的影响；用脂质体包裹CTGF的反义寡核苷酸（ASODN）处理经转化生长因子β... 详细信息

目的研究结缔组织生长因子（CTGF）在滤过泡瘢痕化形成中的作用。方法对照实验研究。应用二甲基四氮唑盐（MTT）法检测脂质体对人眼球筋膜囊成纤维细胞（HTF）活性的影响；用脂质体包裹CTGF的反义寡核苷酸（ASODN）处理经转化生长因子β2（TGF-β2）刺激的HTF，然后用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术和免疫细胞化学法检测纤维连接蛋白（Fn）的合成，用RT-PCR和免疫印迹法检测CTGF的表达。结果3个不同浓度组的脂质体作用HTF后，其吸光度（A）值分别为0．178±0．069、0．196±0．071、0．141±0．036，与正常对照组（0．202±0．073）比较，差异无统计学意义（F=1．65，P〉0．05）；单纯的TGF-β2刺激组（T组）与加入了脂质体的TGF-β2刺激组（D组）分别从基因和蛋白水平比较CTGF和Fn的表达，差异无统计学意义（t=0．90，2．32,0．75，2．11；P〉0．05）；转染12h后CTGF与Fn的mRNA水平比较，脂质体介导的CTGF反义寡核苷酸治疗组（A组）的相对灰度RI值明显高于脂质体介导的CTGF正义寡核苷酸对照组（S组）和D组（F=15．25,19．73；P〈0．05）；CTGF与FN的蛋白表达水平与mRNA表达水平相一致。结论CTGF的ASODN能够抑制TGF-β2对HTF表达CTGF和Fn的刺激作用。

关键词：即早蛋白质类胞间信号肽类和蛋白质类寡核苷酸类反义转化生长因子β 纤连蛋白类成纤维细胞

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反义寡核苷酸药动学研究进展

中国新药杂志 2018年第21期27卷 2534-2543页

作者：付洁王海学宋海峰中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所蛋白质药物国家工程研究中心北京102206 军科正源(北京)药物研究有限责任公司北京102206 国家药品监督管理局药品审评中心药理毒理学部北京100022

世纪之交的十余年,反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,AS-ONs)作为治疗性药物,因受限于稳定性、药物递送、作用机制等核心技术问题,经历了发展低谷期。2016年一年间,先后有2个AS-ONs药物获批上市,标志着此类药物在关键技术上取... 详细信息

世纪之交的十余年,反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,AS-ONs)作为治疗性药物,因受限于稳定性、药物递送、作用机制等核心技术问题,经历了发展低谷期。2016年一年间,先后有2个AS-ONs药物获批上市,标志着此类药物在关键技术上取得了突破性进展,重新回到生物技术药物研发的主舞台。大批新一代针对感染、恶性肿瘤、杜氏肌营养不良等适应证的AS-ONs进入临床试验,再次显示了其在基因治疗领域令人期待的广阔前景。本文就AS-ONs药物的发展代次更迭进行了扼要梳理,并对新代次AS-ONs药物的定量分析与药动学研究进展予以综述。

关键词：基因治疗反义寡核苷酸药动学

反义Bmi-1 RNA转染对人肺癌细胞株A549体外增殖的影响

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中华病理学杂志 2009年第12期38卷 829-832页

作者：于琦孟秀香刘奔刘丹丹张伟刘卫红杨光大连医科大学检验医学院 116044 大连医科大学诊断学实验中心大连市中心医院检验科

目的研究转染反义Bmi-1RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响。方法将表达反义Bmi-1RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株，G418筛选挑取阳性克隆。应用即时荧光定量RT-PCR及Westernblot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水... 详细信息

目的研究转染反义Bmi-1RNA对人肺腺癌细胞A549的体外增殖及细胞周期和凋亡的影响。方法将表达反义Bmi-1RNA的真核表达载体稳定转染A549细胞株，G418筛选挑取阳性克隆。应用即时荧光定量RT-PCR及Westernblot检测转染后Bmi-1基因在mRNA水平及蛋白水平的表达；应用M1Tr比色法及平板克隆形成实验检测A549细胞体外生长能力；用PI单染及Annexin-VPI双染技术在流式细胞仪上检测细胞周期及凋亡情况。结果Westernblot结果显示转染反义Bmi-1RNA使A549细胞中Bmi-1蛋白表达量减少了95％；MTT检测细胞生长曲线表明反义Bmi．1RNA使A549细胞生长速度明显减慢；平板克隆形成实验结果显示转染反义Bmi．1RNA的A549细胞在平板中形成集落的数目（0．67±0．50）明显低于未转染组（73．04±4．1）及转染空质粒组（67．04±4．0，P〈0．01）；流式细胞仪结果显示反义Bmi-1使A549细胞阻滞在G0／G1期，但对细胞凋亡没有影响。结论反义Bmi-1RNA在体外对A549细胞增殖有明显的抑制作用，其抑制作用是通过使A549细胞阻滞在G0／G1期实现的。

关键词：肺肿瘤转染 RNA 反义基因 Bmi-1

反义肝素酶基因对胰腺癌细胞体外增殖和侵袭的抑制作用

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世界华人消化杂志 2006年第25期14卷 2493-2498页

作者：杨彦崔明陈陵段体德成都军区昆明总医院普通外科云南省昆明市650032 第三军医大学西南医院消化专科中心重庆市400038 昆明医学院第一附属医院普通外科云南省昆明市650032

目的:研究反义肝素酶基因对人胰腺癌SW1990细胞体外增殖和侵袭能力的抑制作用．方法:反义肝素酶基因转染胰腺癌sW1990细胞,并设空载体对照组和空白对照组,以流式细胞仪检测细胞周期;免疫组化、Western blot及RT-PCR检测肝素酶蛋白和mRN... 详细信息

目的:研究反义肝素酶基因对人胰腺癌SW1990细胞体外增殖和侵袭能力的抑制作用．方法:反义肝素酶基因转染胰腺癌sW1990细胞,并设空载体对照组和空白对照组,以流式细胞仪检测细胞周期;免疫组化、Western blot及RT-PCR检测肝素酶蛋白和mRNA表达;平板克隆形成实验检测细胞增殖活性,Transwell侵袭小室模型检测细胞体外侵袭能力．结果:与空白组和空载组比较,反义组细胞周期中S期比例明显减少(18.8％±2．5％vs 36．3％±2．2％,33．2％±2．1％,P反义肝素酶基因抑制人胰腺癌SW1990细胞体外增殖及侵袭能力．

关键词：肝素酶反义胰腺癌转染增殖侵袭

反义VEGF_(165)基因转染对人神经母细胞瘤生物学行为的影响

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解剖学报 2006年第1期37卷 69-73页

作者：温铭杰祁雅慧邴国英首都医科大学实验中心北京100069

目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用。方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆。应用RT-PCR证实外源性反义VEGFmRNA的表达,免疫细胞化... 详细信息

目的探讨反义VEGF165基因转染在抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长中的作用。方法构建正义和反义VEGF165真核表达载体,用脂质体转染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,G418筛选稳定表达细胞克隆。应用RT-PCR证实外源性反义VEGFmRNA的表达,免疫细胞化学和ELISA检测VEGF蛋白的表达水平,MTT法检测肿瘤细胞体外生长情况,并接种于裸鼠皮下,观察体内肿瘤增殖能力。结果RT-PCR证实转染反义VEGF的细胞中有外源性反义VEGFmRNA的表达,免疫细胞化学和ELISA显示VEGF蛋白表达明显降低,MTT实验显示转染前后细胞体外生长速度基本一致,而转染反义VEGF的肿瘤细胞裸鼠体内生长速度明显减慢。结论反义VEGF基因转染能够有效抑制SH-SY5Y细胞内源性VEGF蛋白的表达,抑制裸鼠体内肿瘤的生长。

关键词：血管内皮细胞生长因子神经母细胞瘤反义基因治疗人

反义DcR3 RNA转染诱导肝癌细胞凋亡的作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2005年第10期25卷 799-802页

作者：吴泰璜段伟宏苏忠学吴亚光山东省立医院济南250012

目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建pVAXⅠ-as-DcR3反义表达载体,转染肝癌细胞,Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低,流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化。结果Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达... 详细信息

目的研究DcR3反义mRNA在肝癌细胞凋亡中的作用。方法构建pVAXⅠ-as-DcR3反义表达载体,转染肝癌细胞,Western blot法观察DcR3蛋白合成有无降低,流式细胞术、TUNEL等方法观察凋亡变化。结果Western blot证实反义重组体可有效阻滞DcR3表达,同时转染了pVAXⅠ-as-DcR3的肝癌细胞凋亡较对照组增多。结论DcR3反义RNA可使肝癌细胞凋亡增多。

关键词：反义转染表达载体凋亡肝癌细胞

反义寡核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞FAK和胶原合成的作用

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中华整形外科杂志 2008年第6期24卷 475-477页

作者：陈蕊傅敏刚陆毅王琳平萍范志宏上海交通大学医学院附属仁济医院整形外科 200127

目的研究黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）在人增生性瘢痕发病机制中的作用。方法体外分离、培养人增生性瘢痕成纤维细胞（hyperthrophic sear fibroblasts，HSFB）。在脂质体介导下将FAK反义寡核苷酸转染至HSFB中设为FAK反义... 详细信息

目的研究黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）在人增生性瘢痕发病机制中的作用。方法体外分离、培养人增生性瘢痕成纤维细胞（hyperthrophic sear fibroblasts，HSFB）。在脂质体介导下将FAK反义寡核苷酸转染至HSFB中设为FAK反义寡核苷酸治疗组（AT组），仅加入脂质体为脂质体对照组（LPC组），不加脂质体和反义寡核苷酸为空白对照组（M组）。通过荧光定量PCR方法检测HSFB细胞中FAKmRNA指数，采用^3H-脯氨酸掺入法测定HSFB细胞的胶原合成量。结果转染48h后，AT组FAKmRNA值为0．043±0．030，明显低于LC组（0．124±0．070）及LPC组（0．127±0．0195，P〈0．05）。AT组的^3H-脯氨酸掺入率为257．0±15．14，低于LC组（962．2±300．5）及LPC组（930．8±28．97，P〈0．01）。结论FAK反义寡核苷酸能抑制体外培养的HSFB中FAK基因的表达和胶原合成，FAK在人增生性瘢痕的发病中发挥了一定作用。

关键词：瘢痕成纤维细胞黏着斑激酶寡核苷酸反义胶原

反义寡脱氧核苷酸抑制丁型肝炎病毒基因链核酶活性的作用

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中华医学杂志 1996年第1期76卷 30-33页

作者：毛青王升启李奇芬王玉芝朱宝珍第三军医大学西南医院传染科重庆630038 军事医学科学院放射医学研究所

目的探讨反义寡脱氧核苷酸（ａｓＯＤＮ）抑制丁型肝炎病毒（ＨＤV）核酶活性以阻断ＨＤＶ复制的作用，方法在构建含ＨＤＶ基因链和抗基因链核酶ｃＤＮＡ片段的重组质粒ｐＨＤＶｒｚ２７７的基础上，体外转录出１１２聚核苷酸（ｎｔ）... 详细信息

目的探讨反义寡脱氧核苷酸（ａｓＯＤＮ）抑制丁型肝炎病毒（ＨＤV）核酶活性以阻断ＨＤＶ复制的作用，方法在构建含ＨＤＶ基因链和抗基因链核酶ｃＤＮＡ片段的重组质粒ｐＨＤＶｒｚ２７７的基础上，体外转录出１１２聚核苷酸（ｎｔ）的基因链核酶，观察５条ａｓＯＤＮ抑制核酶活性的作用，并对作用最好的一条进行序列优化。结果互补于６８３－７０３ｎｔ的自裂位点和茎样结构（ｓｔｅｍ）１区的ａｓＯＤＮ可完全抑制该１１２ｎｔ核酶的活性，互补于７５６－７７０ｎｔ（ＳＳｒＢ区）和７２１－７３５ｎｔ（ＳＳｒＡ区）的ａｓＯＤＮ亦有较高活性，抑制率分别为６９．３６％和４８．６４％，而对应于７３６－７５０ｎｔ（ｓｔｅｍｗ区）和７０４－７２０ｎｔ＜ＳＳｒＣ区）者几乎无抑制作用。对互补于６８３－７０３ｎｔ的ａｓＯＤＮ进行序列优化发现，封闭自裂位点在内的１３ｎｔ（６８３－６９５ｎｔ）的ａｓＯＤＮ仍保留很高抑制作用，抑制率大于９０％。结论ｓｔｅｘｎｌ和ＳＳｒＢ在基因链核酶中起重要作用，ａｓＯＤＮ可有效抑制ＨＤＶ基因链核酶活性。

关键词：丁型肝炎病毒核酶基因抑制反义脱氧核糖核酸

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反义寡核苷酸体外抑制丙型肝炎病毒的研究

中华医学杂志 1997年第8期77卷 567-570页

作者：刘勇陈智何南祥刘克洲章明太王信子浙江医科大学传染病研究所

研究反义寡核苷酸体外抑制丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的方法。方法以重组丙型肝炎病毒（ｐＣＤ－ＨＣＶ）转染的Ｈ９细胞为对象，通过半定量逆转录聚合酶链反应和ｄｏｔＥＬＩＳＡ检测ＨＣＶｍＲＮＡ和抗原表达的变化，观察与ＨＣＶ结构区... 详细信息

研究反义寡核苷酸体外抑制丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的方法。方法以重组丙型肝炎病毒（ｐＣＤ－ＨＣＶ）转染的Ｈ９细胞为对象，通过半定量逆转录聚合酶链反应和ｄｏｔＥＬＩＳＡ检测ＨＣＶｍＲＮＡ和抗原表达的变化，观察与ＨＣＶ结构区（包括ＡＵＧ）互补和同源以及随机的硫代磷酸化寡核苷酸（ＰＳ－ＡＳＯＮ、ＰＳ－ＯＤＮ、ｒＰＳ－ＯＤＮ）对ＨＣＶ的抑制作用。结果ＰＳ－ＡＳＯＮ和ＰＳ－ＯＤＮ可有效地进入靶细胞并在体外与靶基因杂交结合，终浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ的ＰＳ－ＯＤＮ、ｒＰＳ－ＯＤＮ对ＨＣＶ均无抑制作用，但ＰＳ－ＡＳＯＮ可明显降低ＨＣＶｍＲＮＡ和抗原表达水平，具有药物浓度和时间依赖效应，脂质体修饰可增强ＰＳ－ＡＳＯＮ的反义抑制作用，磷酸钙修饰却无此作用。结论与ＨＣＶ互补的ＰＳ－ＡＳＯＮ是ＨＣＶ的反义寡核苷酸，在翻译水平上具有反义抑制作用。

关键词：寡核苷酸类反义丙型肝炎病毒体外抑制