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一株枯草芽孢杆菌原噬菌体Bsu-yong1的基因组分析

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微生物学报 2023年第10期63卷 3905-3922页

作者：刘文才钱敏桦潘灵婷林威许丽华任晓清李登峰童贻刚宁波大学海洋学院海洋生物工程重点实验室浙江宁波315832 北京化工大学生命科学学院北京100029

【目的】枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是在自然界中广泛存在的革兰氏阳性菌,其抗逆性极强,能抑制大多数有害菌的繁殖,是常用的产酶菌,用其生产的蛋白酶、淀粉酶占全球工业酶产量的50%。原噬菌体(prophage)整合在宿主基因组中,可为... 详细信息

【目的】枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是在自然界中广泛存在的革兰氏阳性菌,其抗逆性极强,能抑制大多数有害菌的繁殖,是常用的产酶菌,用其生产的蛋白酶、淀粉酶占全球工业酶产量的50%。原噬菌体(prophage)整合在宿主基因组中,可为宿主提供基因和生物学功能,非常具有研究价值。以往,有关***原噬菌体的报道主要集中于缺陷型原噬菌体(defective prophage),本研究对一株非缺陷型活性原噬菌体(active prophage)的基因组进行解析,以扩充对非缺陷型原噬菌体的认知。【方法】使用丝裂霉素C从枯草芽孢杆菌中诱导一株噬菌体,命名为Bacillus phage Bsu-yong1(简称Bsu-yong1)。对Bsu-yong1进行负染、透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察,用Illumina MiSeq测定其基因组序列、综合运用生物信息学工具对其进行基因功能注释和系统进化分析。【结果】Bsu-yong1与PBSX类缺陷型原噬菌体在形态上相似,但Bsu-yong1具有完整的噬菌体基因组,这与缺陷型原噬菌体不同,后者在包装过程中不能正确包裹自身的基因组,而是随机包裹一段宿主染色体。Bsu-yong1基因组全长为43590 bp,G+C含量为41%,含有62个开放阅读框(open reading frame,ORF),呈模块化分布。Bsu-yong1拥有基因编码T7SS效应器LXG多态性毒素(T7SS effector LXG polymorphic toxin)、ImmA/IrrE蛋白和SMI1/KNR4蛋白。前二者为细菌毒素(toxin),后者为抗毒素(antitoxin),toxin-antitoxin是细菌免疫系统重要成员,参与菌间竞争与环境适应。此前,尚未有编码LXG polymorphic toxin的基因在噬菌体中被发现和报道。在基于全基因组比对构建的蛋白谱进化树(proteomic tree)中,Bsu-yong1与噬菌体sv105、rho14、vB_BteM-A9Y聚集形成一个独立的进化支(clade),基因组比对显示它们基因组的复制与调控模块具有高度保守性,它们共享29个核心基因(core gene),均具有PBSX样形态特征。Bsu-yong1与其他噬菌体的进化距离较远。将Bsu-yong1与所有噬菌体进行比对,得到的成对序列比较(pairwise sequence comparison,PASC)最大值为46.72%,小于属边界值(70%)。【结论】vB_Bsu-yong1在有尾纲中代表一个新的未知的属;建议构建一个新的科(family),该科由Bsu-yong1与噬菌体sv105、rho14、vB_BteM-A9Y组成。vB_Bsu-yong携带免疫相关基因,它可能有利于宿主在菌间竞争中获胜和适应环境。本研究丰富了噬菌体基因数据库,拓展了对芽孢杆菌活性原噬菌体的认知。

关键词：原噬菌体基因组枯草芽孢杆菌新属新科

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

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中国农业科学 2020年第8期53卷 1572-1582页

作者：崔一平彭埃天宋晓兵程保平凌金锋陈霞广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2... 详细信息

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。

关键词：柑橘黄龙病韧皮部杆菌亚洲种柑橘病毒病原噬菌体遗传多样性

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柑橘黄龙病菌原噬菌体的遗传多样性分析

园艺学报 2024年第4期51卷 727-736页

作者：游平杨进周俊黄爱军鲍敏丽易龙赣南师范大学生命科学学院江西赣州341000 国家脐橙工程技术研究中心江西赣州341000

以采自广东、广西、海南、云南、四川、贵州等6个地区共300份感染柑橘黄龙病菌的DNA样本作为试验材料,通过PCR技术对黄龙病菌携带的3种类型原噬菌体基因进行特异扩增、测序,利用相关生物信息学软件进行遗传多样性分析。结果共鉴定出8种... 详细信息

以采自广东、广西、海南、云南、四川、贵州等6个地区共300份感染柑橘黄龙病菌的DNA样本作为试验材料,通过PCR技术对黄龙病菌携带的3种类型原噬菌体基因进行特异扩增、测序,利用相关生物信息学软件进行遗传多样性分析。结果共鉴定出8种原噬菌体组合;携带单一原噬菌体类型的黄龙病菌株为6个地理种群的优势菌株,占比53.3%,其中以Type 2型为主;3类原噬菌体基因位点中A+T含量均高于G+C,表现出AT偏好特点;重组分析结果显示黄龙病菌间无重组信号,表明未发生重组事件;基因流N_(m)值均大于1,说明黄龙病菌在各种群中基因交流频繁;中性检验结果显示Tajima’s D、Fu and Li’s D、Fu and Li’s F值均小于0,表明黄龙病菌种群存在过历史扩张。

关键词：柑橘黄龙病原噬菌体遗传多样性

原噬菌体对ST71型德尔卑沙门菌群体分化的影响

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原噬菌体对ST71型德尔卑沙门菌群体分化的影响

作者：郁金燕扬州大学

学位级别：硕士

近期流行病学调查表明德尔卑沙门菌已成为严重威胁食品安全和人类健康的沙门菌血清型之一。根据多位点序列分型（MLST）方法可以将德尔卑沙门菌分为26种ST型,我国分离率最高的ST型是ST40和ST71。以往研究表明,ST40型德尔卑沙门菌是一种... 详细信息

近期流行病学调查表明德尔卑沙门菌已成为严重威胁食品安全和人类健康的沙门菌血清型之一。根据多位点序列分型（MLST）方法可以将德尔卑沙门菌分为26种ST型,我国分离率最高的ST型是ST40和ST71。以往研究表明,ST40型德尔卑沙门菌是一种广宿主沙门菌,而禽源样品是ST71型菌株的主要分离来源。对本实验室2009-2016年间收集的德尔卑沙门菌菌株群体进行分析后发现,ST40型德尔卑沙门菌菌株分离自多种宿主,但ST71型菌株均分离自猪源样品,却未在禽源样品中分离获得ST71型菌株,这说明ST71型德尔卑沙门菌群体可能存在宿主适应性差异。为了鉴定与ST71型德尔卑沙门菌宿主适应性相关的基因组序列区段,并揭示其进化基础,本研究在实验室收集的ST71型德尔卑沙门菌群体挑选了 15株代表菌株进行了全基因组测序,并与NCBI Refseq数据库中的65个ST71型德尔卑沙门菌菌株（1个猪源相关、64个禽源相关菌株）进行了比较基因组分析。结果显示,猪源相关（16）和禽源相关（64）菌株群体所含的沙门菌毒力岛（SPI）和毒力因子（VF）编码基因没有明显差异,而两个菌株群体间的基因组序列长度及其所含基因数量则均存在显著差异,猪源相关菌株群体的基因组序列长度更长,所含基因数量更多（p值均小于0.05）。比较基因组分析发现ST71型德尔卑沙门菌群体的泛基因组呈开放状态,并发现和禽源相关菌株群体相比,猪源相关菌株群体在进化过程中经历了更多的基因获得事件。本研究在受基因获得事件显著影响的基因集合中鉴定到多个原噬菌体相关基因,进一步鉴定了菌株中的原噬菌体序列,并发现猪源相关菌株携带的原噬菌体数量（平均5个）显著高于禽源相关菌株群体（平均2个）（p＜0.05）;而将原噬菌体序列去除后,两个菌株群体间的基因组序列长度、GC含量及基因数量间的差异均不再显著,说明原噬菌体是导致两个菌株群体基因组差异的一个重要原因。对猪源菌株群体中特有的原噬菌体序列集合进行分析,并从这些原噬菌体中鉴定到多个与细菌宿主适应相关基因;进一步从中挑选一个代表性基因dam,构建了该基因的缺失突变株,并发现原噬菌体携带的dam基因对ST71型德尔卑沙门菌黏附猪回肠上皮细胞有显著促进作用。这些结果说明原噬菌体是介导ST71型德尔卑沙门菌群体分化的一个重要驱动力。为了进一步揭示原噬菌体在沙门菌进化和群体分化中的作用,选取了 4,272个高质量的沙门菌基因组,并将这些基因组按血清型、分离时间、宿主来源和地理起源进行分类,结果显示不同血清型、地理起源和宿主来源的沙门菌群体中每个菌株所含的原噬菌体数量均呈现较大差异,而血清型和地理起源对沙门菌所含原噬菌体的序列内容有显著影响。另外,我们还在原噬菌体中预测到多个毒力因子编码基因和抗生素抗性基因,表明原噬菌体对沙门菌宿主适应有积极贡献。本研究通过生物信息学分析揭示了原噬菌体是沙门菌进化的一个重要驱动力,为深入了解沙门菌的进化规律及致病机理提供理论依据。

关键词： ST71型德尔沙门菌原噬菌体泛基因组沙门菌进化

基于原噬菌体类型的广西柑橘黄龙病菌种群分析

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植物保护 2023年第4期49卷 312-317,333页

作者：李战彪林林陈锦清谢慧婷崔丽贤莫翠萍刘丽辉秦碧霞蔡健和广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室广西作物病虫害生物学重点实验室南宁530007 广西壮族自治区农业科学院玉林分院玉林市农业科学院玉林537000

2016年-2021年,从广西各柑橘产区采集叶片斑驳、黄化等疑似黄龙病症状的柑橘样品,利用黄龙病特异引物和基于原噬菌体类型的特异引物对样品进行鉴定及分析,结果显示,所采集的3293份样品中有856份样品为黄龙病阳性样品,阳性样品的检出率为... 详细信息

2016年-2021年,从广西各柑橘产区采集叶片斑驳、黄化等疑似黄龙病症状的柑橘样品,利用黄龙病特异引物和基于原噬菌体类型的特异引物对样品进行鉴定及分析,结果显示,所采集的3293份样品中有856份样品为黄龙病阳性样品,阳性样品的检出率为25.99%,阳性样品在广西的14个地市均有分布。基于原噬菌体类型的黄龙病菌种群分析发现,广西存在7种类型的菌株,分别是type 1菌株、type 2菌株、type 3菌株、type 1+type 2菌株、type 2+type 3菌株、type 1+type 2+type 3菌株及未检出任何类型菌株(none type),其中,type 2类型原噬菌体菌株为优势种群。

关键词：广西柑橘柑橘黄龙病原噬菌体种群类型

基于原噬菌体类型的我国柑橘黄龙病菌种群遗传结构分析

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植物病理学报 2019年第3期49卷 334-342页

作者：李嘉慧郑正邓晓玲华南农业大学农学院柑橘黄龙病研究室广州510642

柑橘黄龙病是柑橘生产上最严重的病害之一,由难培养的候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)引起。目前,已报道的与CLas相关的原噬菌体有3种,并且不同的CLas样品中可以检测到不同类型的原噬菌体或不同类型的... 详细信息

柑橘黄龙病是柑橘生产上最严重的病害之一,由难培养的候选韧皮部杆菌亚洲种('Candidatus Liberibacter asiaticus',CLas)引起。目前,已报道的与CLas相关的原噬菌体有3种,并且不同的CLas样品中可以检测到不同类型的原噬菌体或不同类型的组合。本研究基于原噬菌体类型特异引物对从我国南方8省收集的548个黄龙病样品进行原噬菌体类型的鉴定和分析。结果表明,基于原噬菌体类型,在548个样品中共鉴定了7种类型的菌株,分别为Type 1(7.12%)、Type 2(60.22%)、Type 3(3.83%)、Type 1+Type 2(3.28%)、Type 1+Type 3(17.34%)、Type 1+Type 2+Type 3(3.47%)和None类型(不含上述3种类型原噬菌体)(4.74%),其中只携带Type 2类型原噬菌体菌株为华南地区优势种群。此外,基于遗传多样性和遗传距离对我国南方地区的CLas种群进行种群结构分析发现,我国南方地区的CLas种群可以分为3个组,即Ⅰ组(广东、江西、广西、福建)、Ⅱ组(浙江和湖南)以及Ⅲ组(云南和海南),其中Ⅰ组和Ⅱ组又可聚为一大组。该结果可为研究我国柑橘黄龙病流行规律提供一定的理论基础。

关键词：柑橘黄龙病原噬菌体种群遗传结构

基于3种原噬菌体基因的赣南地区黄龙病菌种群动态分析

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植物保护 2024年第2期50卷 144-152,162页

作者：王长宁易龙马家钰赣南师范大学生命科学学院赣州341000

柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)对全球柑橘产业造成了重大经济损失。为明确赣南地区柑橘黄龙病菌基因组上原噬菌体的分子特征和传播动态,本研究对采自赣南10个市县区的470份样品进行HLB检测,并对阳性样品中3种类型的原噬菌体(SC1... 详细信息

柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)对全球柑橘产业造成了重大经济损失。为明确赣南地区柑橘黄龙病菌基因组上原噬菌体的分子特征和传播动态,本研究对采自赣南10个市县区的470份样品进行HLB检测,并对阳性样品中3种类型的原噬菌体(SC1、SC2和P-JXGC-3)上的SC1_gp050、SC2_gp040和PJXGC_gp08基因序列进行遗传多样性分析和谱系地理学分析。结果显示,共检出74份HLB阳性样品,包括7种原噬菌体组合类型:SC1、SC2、P-JXGC-3、SC1+SC2、SC1+P-JXGC-3、SC2+P-JXGC-3和SC1+SC2+P-JXGC-3,含SC2类型的原噬菌体检出41份,检出率为55.41%,说明赣南地区含SC2类型的原噬菌体菌株最为普遍。遗传多样性分析结果表明,赣南地区的3种原噬菌体的基因交流频繁,遗传分化现象不明显。选择压力分析结果显示,SC1和P-JXGC-3类型的原噬菌体均处于负向选择,SC2类型的原噬菌体处于正向选择。基于3种原噬菌体上的基因构建的中介网络图和单倍型分布表结果显示,3种原噬菌体均存在1个祖先单倍型,其他独有单倍型均是由该祖先单倍型经多次突变而来,其中PJXGC_gp08基因产生的独有单倍型最多。时空动态分析结果显示,SC1类型原噬菌体存在2条传播路径,分别为安远和全南地区间的相互传播(3原噬菌体的主要扩散传播地。P-JXGC-3类型原噬菌体存在3条传播路径,瑞金可能是P-JXGC-3类型原噬菌体的扩散中心。上述成果为解析柑橘黄龙病菌亚洲种Candidatus Liberibacter asiaticus在赣南地区的遗传进化及扩散动态提供参考依据。

关键词：柑橘黄龙病原噬菌体分子特征传播动态

一株含有5个原噬菌体的单增李斯特菌比较基因组分析

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基因组学与应用生物学 2017年第2期36卷 670-685页

作者：王旭李骏张昭寰潘迎捷欧竑宇赵勇上海海洋大学食品学院上海201306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室上海201306 浙江工业大学生物与环境工程学院杭州310032 上海交通大学微生物代谢重点实验室与生命科学和生物技术学院上海200030

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病原菌,对食品安全和人类健康造成了严重威胁,但现阶段对其进化规律的研究仍相对较少。本研究运用Illumina测序技术对一株中国单增李斯特菌WaX12的基因组进行了测定,并通过比较基因组学分析了该菌的微... 详细信息

单增李斯特菌是一种重要的人畜共患病原菌,对食品安全和人类健康造成了严重威胁,但现阶段对其进化规律的研究仍相对较少。本研究运用Illumina测序技术对一株中国单增李斯特菌WaX12的基因组进行了测定,并通过比较基因组学分析了该菌的微进化规律。结果表明:WaX12的基因组与Finland 1998相似度最高,但两者基因组间存在135个基因的差异,主要集中在WaX12的原噬菌体上。进一步分析可知,WaX12的基因组携带5个原噬菌体,除原噬菌体1外,其余4个原噬菌体均未存在于Finland 1998中。原噬菌体3和原噬菌体5来源于其他单增李斯特菌的基因组,而原噬菌体2和原噬菌体4则分别来自于大肠杆菌和粪球菌。由此可见,原噬菌体是该单增李斯特菌微进化的主要原因,而这种微进化的发生不仅限于同一种属的细菌之间,还可能源于不同种属细菌间的基因转移。

关键词：单增李斯特菌比较基因组学微进化原噬菌体

中国柑橘黄龙病病原菌两个原噬菌体超变异基因遗传多样性

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中国农业科学 2013年第18期46卷 3784-3792页

作者：谭锦王雪峰苏华楠李中安周常勇西南大学植物保护学院中国农业科学院柑桔研究所

【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’)的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设... 详细信息

【目的】通过原噬菌体区域高度变异的基因位点研究柑橘黄龙病病原菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’)的种群分化,探讨病原菌种群遗传多样性水平和遗传结构。【方法】基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),对中国不同柑橘产区的224个‘***’株系进行PCR检测和序列分析。【结果】PCR扩增的条带类型呈多态性,具有4种条带类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),西南地区以SC1-1型为主,广东、广西地区以SC2-1型为主,福建、江西、浙江地区没有明显优势的扩增型。分析SC1-1和SC1-2对应序列表明,其差异系由于132 bp的卫星序列和24 bp的小卫星序列2种串联重复序列数不同引起,而SC2-1和SC2-2的差异系由原噬菌体内部基因重排引起。【结论】中国不同地理来源病原菌株系在原噬菌体区域具有较丰富的多态性,对该基因区域研究将有助于揭示中国‘***’种群的遗传多样性。

关键词：柑橘黄龙病原噬菌体重复序列遗传多样性