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湖南省HIV-1感染者原发性耐药现况调查

中国感染控制杂志 2023年第4期22卷 451-456页

作者：曹旭健曹静祁慧余维维曾紫微彭勇权王敏南华大学衡阳医学院、长沙市第一医院研究生协作培养基地湖南衡阳421001 长沙市艾滋病研究所、长沙市第一医院湖南长沙410000

目的了解湖南省1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染者其基因亚型分布和原发性耐药(PDR)情况,为艾滋病防控及抗病毒治疗(ART)提供参考依据。方法收集湖南省2021年1月—2022年8月某院HIV门诊新确诊并且未接受ART的HIV-1感染者的人口学及流行... 详细信息

目的了解湖南省1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染者其基因亚型分布和原发性耐药(PDR)情况,为艾滋病防控及抗病毒治疗(ART)提供参考依据。方法收集湖南省2021年1月—2022年8月某院HIV门诊新确诊并且未接受ART的HIV-1感染者的人口学及流行病学相关数据,采集患者血清,提取核糖核酸,利用In-house的方法采取2轮聚合酶链式反应进行基因扩增,Sanger法对产物进行测序,分析患者临床资料及HIV-1亚型及耐药情况。结果共纳入患者667例,基因型耐药检测失败20例,647例检测成功的新确诊HIV-1感染者纳入研究。53例患者感染的HIV-1株发生PDR,发生率为8.19%,主要集中于男性(88.68%)、未婚(71.70%)、男男性行为(MSM,60.38%)、21~40岁的群体(58.49%),且多为湖南省本地籍居民(98.11%)。共检测出15种HIV-1毒株亚型,主要亚型为CRF_01AE(35.70%)、CRF07_BC(25.19%)、B/C(18.86%)以及CRF55_01B(7.88%)。不同HIV-1亚型患者的PDR发生率比较,差异有统计学意义(χ^(2)=18.62,P=0.017)。蛋白酶抑制剂(PIs)耐药率为0.15%,核苷酸类逆转录酶抑制剂(NRTIs)耐药率为2.78%,非核苷酸类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)耐药率为6.65%,整合酶抑制剂(INSTIs)耐药率为0.31%。结论湖南省HIV-1毒株亚型分布复杂,PDR发生率已超过世界卫生组织制定的低水平耐药预警线(耐药毒株传播。

关键词：艾滋病 1型人类免疫缺陷病毒原发性耐药耐药突变抗病毒治疗

CD146介导非小细胞肺癌EGFR-TKI原发性耐药的机制研究

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CD146介导非小细胞肺癌EGFR-TKI原发性耐药的机制研究

作者：马梦雪大连医科大学

学位级别：硕士

目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中85%是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC);表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号在非小细胞肺癌中经常过度表达或异常激活,并已成为癌症治疗的一个关键的靶... 详细信息

目的:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中85%是非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC);表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)信号在非小细胞肺癌中经常过度表达或异常激活,并已成为癌症治疗的一个关键的靶点。目前大约20%的EGFR突变的患者对EGFR-TKI原发性耐药,但耐药机制尚未完全了解。CD146在细胞生物学功能方面起重要调节作用。有研究表明CD146的差异表达与肺癌细胞化疗药物的耐药性相关。但CD146与EGFR-TKI原发耐药之间的关系研究较少,本研究旨在探讨CD146在NSCLC中EGFR-TKI原发性耐药中的作用及机制。方法:(1)选取EGFR-TKI敏感型细胞系PC9(19外显子缺失突变)和EGFR-TKI原发耐药型细胞系H1650(19外显子缺失突变和PTEN缺失),用CCK-8法验证本实验所用的PC9、H1650细胞系对奥西替尼和吉非替尼的敏感性;通过western blot实验,探究在这两种细胞系中,CD146分别在两种药物不同时间作用下的蛋白表达变化。(2)在EGFR-TKI敏感型细胞系PC9中,建立过表达CD146的稳转细胞系,western blot验证稳转细胞系中CD146的表达情况;用CCK-8做细胞活力实验、细胞增殖实验,观察CD146过表达后,是否影响PC9细胞对奥西替尼和吉非替尼的敏感性。(3)在EGFR-TKI耐药型细胞系H1650中,建立敲降CD146的稳转细胞系,western blot验证稳转细胞系中CD146的表达情况;用CCK-8做细胞活力实验、细胞增殖实验,观察CD146敲降后,是否影响H1650细胞对奥西替尼和吉非替尼的耐药性。(4)通过流式细胞术对稳转细胞进行凋亡分析,观察CD146的表达情况是否影响奥西替尼和吉非替尼诱导的细胞凋亡。(5)通过裸鼠皮下瘤体内实验,分析CD146与体内EGFR-TKI原发耐药是否有关:用阴性对照组细胞(H1650-NC)及敲降CD146的细胞(SH-CD146)构建裸鼠皮下移植瘤,给予EGFR-TKI治疗后,分析敲降CD146组(SH-CD146)肿瘤与对照组肿瘤生长情况和肿瘤重量。(6)通过western blot分析CD146是否通过影响AKT信号通路介导NSCLC对EGFR-TKI的原发性耐药,分析其耐药机制。结果:1)CCK-8结果验证了本实验所用的PC9是对奥西替尼和吉非替尼敏感的细胞系,H1650是对奥希替尼和吉非替尼原发耐药的细胞系;与不加药组相比,细胞在奥西替尼或者吉非替尼刺激不同的时间(24h、48h、72h)后,CD146在PC9细胞中蛋白表达水平下降,但下降的水平在药物作用不同时间点间无统计学差异;而CD146在H1650细胞中的蛋白表达水平上升,上升水平在药物作用不同时间点间也无统计学差异。在药物刺激下,CD146在TKI耐药和敏感型肺癌细胞系之间显示出的不同的变化,意味着CD146在非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药中起作用。2)在TKI敏感型细胞系PC9中建立了过表达CD146的稳转细胞系;在奥西替尼或者吉非替尼作用下,与对照组相比,过表达CD146通过增加PC9细胞的细胞生存活力和增殖能力,降低了其对TKI的敏感性。3)在TKI耐药型细胞系H1650中建立敲降CD146的稳转细胞系;在奥西替尼或者吉非替尼作用下,与对照组相比,敲降CD146通过减少H1650细胞的细胞生存活力和增殖能力,降低了其对TKI的耐药性。4)流式细胞术证实:在奥西替尼或者吉非替尼作用下,过表达CD146的PC9细胞凋亡率比对照组低;敲降CD146的H1650细胞凋亡率比对照组高。CD146影响了EGFR-TKI作用下的细胞凋亡能力。5)体内裸鼠成瘤实验:不加药组,敲降CD146的实验组(SH-CD146)的肿瘤生长速度低于阴性对照组(NC);奥西替尼治疗下,敲降CD146的实验组(SH-CD146)的肿瘤体积小于对照组(NC)并且肿瘤重量也低于对照组(NC);在吉非替尼治疗下,敲降CD146的实验组(SH-CD146)的肿瘤体积小于对照组但两组肿瘤重量没有统计学差异。6)Western blot发现,在奥西替尼或者吉非替尼作用下,H1650细胞中,对照组(NC)和敲降CD146的实验组(SH-CD146)的细胞中P-EGFR和P-AKT的蛋白表达量下降,并且敲降CD146的实验组(SH-CD146)的表达量要比对照组更低,CD146是通过影响AKT信号通路导致NSCLC对EGFR-TKI原发耐药。结论:经过体内、体外相关实验的验证,本研究发现CD146可能是导致EGFR-TKI原发性耐药的新靶点。CD146可能是通过激活AKT信号通路促进细胞增殖和抑制细胞凋亡,导致NSCLC对EGFR-TKI产生原发性耐药。

关键词： CD146 非小细胞肺癌 EGFR-TKI 原发性耐药

RNA m6A甲基转移酶METTL3在非小细胞肺癌吉非替尼原发性耐药中的作用及机制研究

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RNA m6A甲基转移酶METTL3在非小细胞肺癌吉非替尼原发性耐药中的...

作者：冯璐瑶郑州大学

学位级别：硕士

背景及目的世界卫生组织最新数据显示,肺癌是2020年全球发病率第二、死亡率第一的癌症类型,非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理分型。EGFR(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变是驱动非小细胞肺癌... 详细信息

背景及目的世界卫生组织最新数据显示,肺癌是2020年全球发病率第二、死亡率第一的癌症类型,非小细胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理分型。EGFR(epidermal growth factor receptor,EGFR)突变是驱动非小细胞肺癌发生的最常见分子分型,EGFR抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)逐渐成为 EGFR 突变患者一线治疗策略,但是严峻的原发性耐药问题限制了 EGFR靶向抑制剂的临床应用,耐药机制主要包括靶点二次突变、旁路通路激活和组织分型转化等。近年来RNA甲基化成为肿瘤发生发展的研究热点,m6A是最常见的RNA甲基化类型,已有研究报道其在肿瘤发生发展中发挥重要作用。METTL3作为m6A甲基转移酶被发现在肝癌、乳腺癌、膀胱癌等多种癌症中表达上调并参与增殖、侵袭等恶性行为。有文献报道METTL3在非小细胞肺癌中高表达,但是目前尚未有报道深入探讨METTL3在非小细胞肺癌EGFR-TKIs原发耐药中的作用及分子机制。本文将针对METTL3在非小细胞肺癌吉非替尼原发耐药中的作用机制进行探究,为克服EGFR-TKIs耐药提供理论依据。方法1.利用GEO、TCGA数据库、Western blot和免疫组化考察METTL3在NSCLC癌组织中的表达。2.收集临床原发耐药患者组织样本进行免疫组化和免疫荧光检测,并结合非小细胞肺癌细胞系Western blot及qPCR分析METTL3在耐药患者及耐药细胞系中的表达。3.细胞水平上利用细胞增殖、克隆形成、Transwell和细胞划痕考察METTL3对原发性耐药细胞增殖与迁移的影响;动物水平上利用裸鼠皮下移植瘤模型与肺转移模型,验证METTL3对小鼠肺癌细胞增殖与迁移的影响。4.利用RNA-seq和RNA m6A-seq结果进行GO分析,富集METTL3介导非小细胞肺癌增殖与迁移相关的生物学过程。5.联合分析RNA m6A-seq与RNA-seq,筛选METTL3介导m6A修饰的非小细胞肺癌耐药相关靶基因。结果1.公共数据库与临床水平上,肺癌组织中METTL3mRNA和蛋白表达均高于正常组织。2.非小细胞肺癌吉非替尼原发耐药患者中METTL3表达显著高于敏感患者;与敏感细胞系相比,原发性耐药细胞系中METTL3高表达,且METTL3水平与吉非替尼IC50值正相关。吉非替尼不能降低耐药患者及耐药细胞METTL3水平。3.细胞水平上敲减METTL3能抑制原发性耐药细胞株H1650的增殖、克隆形成与细胞迁移;动物水平上敲减METTL3能抑制裸鼠皮下肿瘤的生长与肿瘤细胞肺部转移。4.分析RNA-seq结果发现敲减METTL3后差异下调基因在细胞分裂、细胞黏附等增殖与迁移相关过程中显著富集;分析RNA m6A-seq结果发现m6A修饰的耐药相关基因主要富集在细胞增殖与迁移功能。5.联合分析RNA-seq与RNA m6A-seq结果,筛选出细胞增殖与迁移相关的候选靶基因TUBA4A与MSH6。结论1.METTL3在非小细胞肺癌中高表达,并且参与吉非替尼原发性耐药。2.在细胞和动物水平上,高表达的METTL3促进吉非替尼原发性耐药细胞的增殖和迁移。3.METTL3通过影响细胞迁移与周期相关基因TUBA4A及MSH6调控NSCLC吉非替尼原发性耐药。

关键词：非小细胞肺癌 RNA甲基化 METTL3 吉非替尼原发性耐药

EGFR-TKI原发性耐药的分子机制及其进展——附2例病例分析

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中国肺癌杂志 2019年第1期22卷 52-56页

作者：刘美蓉孟凡路马晴顾立彦钟殿胜天津医科大学总医院肿瘤内科天津300052

酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine-kinase inhibitor, TKI)类药物已经被证实对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)敏感突变的晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者有很好的疗效,优于化疗。但仍有部分敏感突变的患者出现原发性耐药。耐药的原因尚不明确,可能与EGFR基因的敏感突变与耐药突变共存、EGFR通路下游基因突变、MET扩增、BIM缺失多态性等因素相关。本文分享了2例原发性耐药病历并进行了原因分析。

关键词：肺肿瘤 EGFR-TKI 原发性耐药

天津市2014－2017年男男性行为人群艾滋病病毒感染者原发性耐药分析

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中华流行病学杂志 2018年第5期39卷 619-624页

作者：郑敏娜宁铁林周宁赵璇李龙朱静瑾程绍辉天津市疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制所 300011

目的了解2014－2017年天津市MSM人群HIV感染者（MSM感染者）原发性耐药（transmitted drug resistance，TDR）的流行特点和相关因素。方法收集2014－2017年天津市未经抗病毒治疗的MSM人群中HIV感染者的血浆样本共225例，采用巢式PCR... 详细信息

目的了解2014－2017年天津市MSM人群HIV感染者（MSM感染者）原发性耐药（transmitted drug resistance，TDR）的流行特点和相关因素。方法收集2014－2017年天津市未经抗病毒治疗的MSM人群中HIV感染者的血浆样本共225例，采用巢式PCR法扩增pol区基因片段，进行基因型耐药检测和相关因素分析。结果 205例样本获得pol区基因序列，完成HIV亚型和耐药检测。基因型依次为CRF01_AE占53.2%（109/205），CRF07_BC占28.8%（59/205），B亚型占10.2%（21/205），CRF55_01B亚型占4.9%（10/205），其他独特型二代重组亚型占2.9%（6/205）。75例样本成簇分布在20个传播簇内，62.5%（10/16）的TDR样本分布在5个传播簇中。耐药株的TDR流行率为7.8%，2014－2017年每年的TDR流行率逐年上升，分别为3.9%（2/51）、5.7%（3/53）、9.6%（5/52）和12.2%（6/49），但差异无统计学意义（χ^2=2.504，P=0.127），CRF01_AE亚型和B亚型TDR流行率最高，分别为3.4%（7/205）和2.9%（6/205）。TDR突变以非核苷酸反转录酶抑制剂（NNRTIs）为主，TDR流行率为6.3%（13/205），核苷酸反转录酶抑制剂（NRTIs）和蛋白酶抑制剂（PIs）的TDR流行率分别为1.5%（3/205）和1.0%（2/205）。结论天津市MSM感染者的TDR毒株的TDR流行形势较严重，需采取有针对性的预防和控制措施。

关键词：艾滋病病毒男男性行为人群原发性耐药

2016年云南省德宏傣族景颇族自治州新报告HIV感染者原发性耐药研究

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中华预防医学杂志 2018年第12期52卷 1298-1300页

作者：杨锦陈晓晨段星王继宝王译葵杨涛叶润华杨跃诚姚仕堂段松何纳云南省德宏州疾病预防控制中心性病艾滋病防治科芒市678400 复旦大学公共卫生学院流行病学教研室//公共卫生安全教育部重点实验室

高效逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral treatment, HAART)自2003年推广以来,有效降低了HIV感染相关疾病的发病率和死亡率,延长了HIV感染者寿命,同时也促进了HIV耐药突变和耐药株的发生[1,2]。国内关于新报告HIV感染者原发... 详细信息

高效逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral treatment, HAART)自2003年推广以来,有效降低了HIV感染相关疾病的发病率和死亡率,延长了HIV感染者寿命,同时也促进了HIV耐药突变和耐药株的发生[1,2]。国内关于新报告HIV感染者原发性耐药的研究较少,所报道的耐药率为1.6%~12.2% [3,4,5,6,7]。云南德宏傣族景颇族自治州(德宏州)地处西南边疆,与缅甸接壤,是国家HIV防治重点地区[8]。了解德宏州新报告HIV感染者原发性耐药情况,可指导抗病毒治疗,有效预防继发性耐药发生。为此,本研究对德宏州2016年新报告HIV感染者进行了原发性耐药研究。

关键词： HIV 中国缅甸原发性耐药基因亚型

厦门市新发现HIV-1感染者分子流行病学及原发性耐药分析

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中国卫生检验杂志 2022年第22期32卷 2698-2701,2705页

作者：张荣秋温娟邱艺燕张建梅厦门市疾病预防控制中心福建厦门361000 厦门市集美区疾病预防控制中心

目的了解厦门市新发现HIV-1感染者的HIV-1亚型的型别,进而了解亚型变化以及传播途径,分析其原发性耐药情况。方法收集新发现HIV-1感染者的血浆样品,用罗氏公司的Tanman48进行实时荧光定量PCR测定HIV病毒载量,提取HIV病毒RNA,采用巢式PC... 详细信息

目的了解厦门市新发现HIV-1感染者的HIV-1亚型的型别,进而了解亚型变化以及传播途径,分析其原发性耐药情况。方法收集新发现HIV-1感染者的血浆样品,用罗氏公司的Tanman48进行实时荧光定量PCR测定HIV病毒载量,提取HIV病毒RNA,采用巢式PCR方法扩增gag-pol和env区基因片段、测序,进行分子流行病学分析和耐药基因型分析。结果85例Gag-pol与各亚型标准序列构建的系统进化树显示,CRF01_AE重组型为76例(89.41%),CRF07_BC重组型为5例(5.88%),CRF08_BC重组型为2例(2.35%),B’亚型为2例(2.35%)。共有4例耐药位点突变,原发性耐药率为4.68%。在4例原发性耐药标本中,PIs相关突变株1株,主要突变位点为M46I/L,表现为对NFV中度耐药和对LPV/r、FPV/r、ATV/r潜在耐药;NRTIs相关突变株1例,主要突变位点为D67N和L74V,表现为对ABC中度耐药和对AZT低度或者潜在耐药;NNRTIs相关突变株2例,主要突变位点为V179E和E138A,表现为对EFV、NVP、ETR潜在耐药和对RPV低度或者潜在耐药。结论厦门市新发现HIV感染者以CRF07_BC流行重组型为主,该人群中原发性耐药属于低流行区,但是原发性耐药已经开始传播,应参照原发性耐药检测为新发现HIV-1感染者制定首选治疗方案。

关键词：新发现HIV-1感染者 HIV-1亚型原发性耐药基因突变

超深度焦磷酸测序技术用于HIV-1RT基因区原发性耐药突变的研究

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中华流行病学杂志 2014年第10期35卷 1142-1145页

作者：贺健梅邹潇白陈曦郑军湖南省疾病预防控制中心长沙410005

目的：利用超深度焦磷酸测序技术（UDS）研究湖南省HIV感染者中原发性耐药流行趋势。方法90份未接受抗病毒治疗的HIV感染者同时采用UDS测序和Sanger测序进行HIV基因型耐药检测，测序结果采用斯坦福大学HIV耐药突变数据库进行分析比对，... 详细信息

目的：利用超深度焦磷酸测序技术（UDS）研究湖南省HIV感染者中原发性耐药流行趋势。方法90份未接受抗病毒治疗的HIV感染者同时采用UDS测序和Sanger测序进行HIV基因型耐药检测，测序结果采用斯坦福大学HIV耐药突变数据库进行分析比对，分析湖南省HIV-1反转录（RT）基因区原发性耐药突变情况。结果 UDS检测成功获取90份测序结果，84.4%为AE亚型（76/90），发现38例（42.2%，38/90）针对RT基因区的耐药突变位点，其中14例样本仅发生核苷类反转录酶（NRTI）耐药突变（15.6%），15例仅发生非核苷类反转录酶（NNRTI）耐药突变（16.7%），9例样本同时发生了NRTI和NNRTI类耐药突变。在16个位置上共发现54次耐药突变。17例（18.9%，17/90）样本有针对RT基因区的中度及以上的耐药突变。传统Sanger法仅检出7例；其中针对NRTI类药物耐药的6例；针对NNRTI类药物耐药的5例。结论 Sanger法测序能够鉴定出显著的耐药性突变（≥20%），但不能及时发现尚未达到显著突变量的突变位点或稀有型抗药型突变（＜20%）。而UDS则能更灵敏检测到低频突变毒株，这些耐药突变同样可在药物选择压力下快速的增长引起病毒学治疗失败，导致临床治疗失败。因此选择更高灵敏度和精确度的技术检测低水平耐药突变位点，对于HIV抗病毒临床治疗有着十分重大的意义。

关键词： HIV-1 原发性耐药超深度焦磷酸测序 Sanger法测序核苷类药物非核苷类药物

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HIV-1原发性耐药国内外研究进展

现代医药卫生 2022年第24期38卷 4226-4230页

作者：曹旭健(综述) 曹静祁慧余维维曾紫微彭勇权王敏(审校) 南华大学衡阳医学院/长沙市第一医院研究生协作培养基地湖南衡阳421001 长沙市第一医院艾滋病研究所湖南长沙410000

联合抗逆转录病毒治疗通过抑制患者体内人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制,显著降低了HIV感染者/获得性免疫缺陷综合征患者病死率,延长了患者预期寿命。然而在抗病毒药物选择压力及病毒自身因素作用下HIV-1耐药突变不断产生。原发性耐药(PDR... 详细信息

联合抗逆转录病毒治疗通过抑制患者体内人类免疫缺陷病毒(HIV)的复制,显著降低了HIV感染者/获得性免疫缺陷综合征患者病死率,延长了患者预期寿命。然而在抗病毒药物选择压力及病毒自身因素作用下HIV-1耐药突变不断产生。原发性耐药(PDR)对抗病毒治疗的疗效和患者远期预后具有负面影响。该文对近年来国内外PDR的研究进行了总结,旨在为后续相关研究提供思路,为PDR管理提供策略。

关键词：联合抗逆转录病毒治疗耐药突变原发性耐药综述