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细胞内单颗粒示踪技术的进展（英文）

中国光学 2018年第3期11卷 281-295页

作者：王德江狄香君王宝明王帆郭智勇金大勇悉尼科技大学生物医学材料及仪器研究所澳大利亚悉尼2007 西南石油大学机电工程学院四川成都610500

单颗粒示踪（Single particle tracking,SPT）技术是应用显微镜系统对细胞内单个特定荧光或散射颗粒的定位和追踪。由于SPT能够实时监控活细胞内复杂、高度动态的组织结构的变化并提供结构—功能间的动力学关系,因此在细胞生物学上有重... 详细信息

单颗粒示踪（Single particle tracking,SPT）技术是应用显微镜系统对细胞内单个特定荧光或散射颗粒的定位和追踪。由于SPT能够实时监控活细胞内复杂、高度动态的组织结构的变化并提供结构—功能间的动力学关系,因此在细胞生物学上有重要的应用。本文总结了SPT的机理以及在细胞上的应用,首先介绍了SPT的动力学原理,包括单颗粒定位,轨道重建以及轨道分析,然后总结了SPT技术现阶段重点发展的光学材料及仪器,最后阐述了SPT在细胞膜、细胞内信号通路、分子转运机制、遗传信息表达以及病毒感染机制的应用。此外,本文还对SPT技术未来的发展进行了展望。

关键词：单颗粒示踪技术细胞动力学原理光学材料及仪器

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单颗粒示踪技术及其在动物病毒入侵机制研究中的应用

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经济动物学报 2019年第1期23卷 57-62页

作者：余婉婷王乃东湖南农业大学动物医学院兽用蛋白质工程疫苗湖南省重点实验室

病毒入侵宿主细胞的分子机制十分复杂,是病毒学界的研究热点。单颗粒示踪技术能够直接观察单个病毒入侵细胞的动态行为,有助于解析病毒入侵宿主细胞的分子机制。综述单颗粒示踪技术用于病毒与宿主细胞相互作用的不同过程,有助于动物病... 详细信息

病毒入侵宿主细胞的分子机制十分复杂,是病毒学界的研究热点。单颗粒示踪技术能够直接观察单个病毒入侵细胞的动态行为,有助于解析病毒入侵宿主细胞的分子机制。综述单颗粒示踪技术用于病毒与宿主细胞相互作用的不同过程,有助于动物病毒入侵机制研究和新型抗病毒药物与疫苗的研发。文中主要论述单颗粒示踪技术的发展历程,介绍该技术用于病毒和细胞亚结构的标记方法和进展,以及单颗粒示踪技术在动物病毒入侵机制研究中的应用进展,并总结现阶段单颗粒示踪技术在病毒学发展中的优势和局限性。

关键词：单颗粒示踪技术病毒细胞亚结构内吞荧光标记

单颗粒示踪技术及其在猪病毒致病机制研究中的应用

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中国动物检疫 2023年第6期40卷 76-82页

作者：王建开妍任雪枫董永毅徐小艳江苏省动物疫病预防控制中心江苏南京210036

探索病毒致病机制有助于靶向药物和疫苗研发,对疫病防控具有重要意义。单颗粒示踪(single particle tracking,SPT)技术能够在活细胞中对单个病毒粒子进行实时成像,便于观察病毒与宿主细胞相互作用的动态过程,以揭示病毒的入侵机制,因而... 详细信息

探索病毒致病机制有助于靶向药物和疫苗研发,对疫病防控具有重要意义。单颗粒示踪(single particle tracking,SPT)技术能够在活细胞中对单个病毒粒子进行实时成像,便于观察病毒与宿主细胞相互作用的动态过程,以揭示病毒的入侵机制,因而成为病毒机制研究的重要工具。本文简要介绍了SPT技术的发展和技术原理,重点阐述了SPT技术在猪伪狂犬病病毒、日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的入胞、胞内转运机制研究中的应用,旨在为相关领域研究提供参考。

关键词：单颗粒示踪技术猪病致病机制

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基于单颗粒示踪技术的细胞膜受体与配体相互作用研究

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基于单颗粒示踪技术的细胞膜受体与配体相互作用研究

作者：吴嘉湖南大学

学位级别：硕士

长期以来,细胞膜受体蛋白与配体分子之间的相互作用是分子生物学、生物物理学与纳米生物学等众多领域中的研究热点。凭借着破除平均测量结果与获取中间态信息的独特优势,单分子成像技术在活细胞表面受体分子与配体分子作用过程与差异性... 详细信息

长期以来,细胞膜受体蛋白与配体分子之间的相互作用是分子生物学、生物物理学与纳米生物学等众多领域中的研究热点。凭借着破除平均测量结果与获取中间态信息的独特优势,单分子成像技术在活细胞表面受体分子与配体分子作用过程与差异性分析的研究中崭露头角,如荧光互相关光谱,荧光共振能量转移等。然而这些分析方法需要对反应达到平衡状态时受体与配体结合体的数量进行检测,以及对受体和配体同时进行荧光标记。相比之下,单粒子示踪技术能够研究单个膜受体在活细胞中长时间内的分子动力学和相互作用。然而,由于难以从复杂的运动中提取瞬时状态,利用现有的单颗粒示踪技术开展活细胞表面受体蛋白与配体分子动态相互作用的原位分析仍然面临诸多困难。基于此,本论文中:在第二章中,开发活细胞水平上配体受体相互作用的定量分析方法。采用具有高生物兼容性的聚乙二醇将RGD环肽(cRGD)与金纳米颗粒链接,构建具有生物活性的纳米探针。利用暗场显微镜对探针与膜上受体相互作用过程实时观察,对所得数据使用马尔卡夫模式识别算法进行自动识别,分别获得cRGD配体与整联蛋白受体结合和解离状态持续时间。根据受体与配体结合和解离反应动力学理论推导,得到受体与配体结合解离概率随时间变化的规律,将理论推导的概率时间公式对实验数据进行拟合,分别获得其结合与解离反应速率常数,从而求得非平衡状态下cRGD肽与整联蛋白受体的亲和常数为2.5μmol·dm3。在第三章中,考察激活因子Mn2+对整联蛋白受体与配体相互作用过程的影响。利用已建立的受体与配体相互作用过程的原位动态测量方法,同时从结合反应和解离反应两个方向分析,发现激活因子Mn2+促进了探针与整联蛋白的结合,同时降低了其解离。并通过流式细胞术证明了该方法可以用于检测细胞膜受体蛋白与配体分子相互作用。在第四章中,核酸适配体与靶细胞上蛋白分子相互作用过程的分析。利用已建立的单颗粒示踪技术,以靶向肝癌细胞的核酸适配体(TLS11a)为例,对核酸适配体功能化纳米探针与肝癌细胞的作用过程进行实时示踪,验证了该方法可以用于分析核酸适配体与靶细胞上蛋白分子的相互作用。

关键词：单颗粒示踪技术受体与配体相互作用动力学

基于暗场成像的单颗粒示踪技术研究金纳米棒与细胞的相互作用

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基于暗场成像的单颗粒示踪技术研究金纳米棒与细胞的相互作用

作者：葛凤青岛大学

学位级别：硕士

近年来,为满足疾病诊断及精准医学发展的需求,纳米颗粒与细胞相互作用引起了广泛的关注。纳米颗粒与细胞相互作用由于细胞的复杂性及纳米颗粒的多样性变得神秘而复杂,然而传统的平均的方法不再能满足人们更加全面的研究纳米颗粒与细胞... 详细信息

近年来,为满足疾病诊断及精准医学发展的需求,纳米颗粒与细胞相互作用引起了广泛的关注。纳米颗粒与细胞相互作用由于细胞的复杂性及纳米颗粒的多样性变得神秘而复杂,然而传统的平均的方法不再能满足人们更加全面的研究纳米颗粒与细胞复杂的相互作用的需求。因此,能够实时追踪单分子/单颗粒动力学信息的单分子/单颗粒示踪技术得到了广大研究者们的青睐。本文利用传统的暗场成像方法构建了一套以金纳米棒(AuNRs)为探针的单颗粒示踪技术,并进一步利用该暗场成像的单颗粒示踪技术分析了金纳米棒与细胞的相互作用。我们可以通过分析示踪粒子平动和转动动力学的各种方法和手段来窥探细胞物质运动,进而揭开复杂的细胞作用机制的神秘面纱。本论文主要从以下三个方面开展工作:一、基于金纳米棒探针构建平动&旋转单颗粒示踪技术基于AuNRs的散射偏振性,我们利用传统的暗场显微镜构建了一个简单有效的方法,该方法可以追踪单个AuNRs的平动和转动信息。该方法的原理是:暗场成像条件下,AuNR在彩色相机中呈现为一个散射像斑,像斑的散射强度受AuNR与光轴之间的夹角(极化角)影响,即AuNR的极化角可以通过其在彩色相机R、G和B三个成像通道的散射强度值计算,这里我们以G为内参,利用(R-G)计算极化角。与其它AuNRs为探针的方法相比,该颜色双通道差分方法的优点是简单、系统误差低、角度测量精准度高。接下来,我们通过偏振实验和数据模拟验证了该颜色双通道差分方法用于计算极化角是可行的、可靠的。最后,我们利用该方法分析了CTAB-AuNR与不同膜受体蛋白(PD-L1)表达量细胞相互过程中的旋转行为,证明PD-L1受体蛋白在AuNR与细胞相互作用过程中有重要的作用。二、单颗粒示踪技术研究细胞膜上扩散金纳米棒的动力学利用颜色双通道差分法,我们研究了功能化AuNRs在细胞膜上的扩散行为。首先,为满足实验要求,我们合理设计了AuNRs探针。研究结果表明,功能化AuNRs在细胞表面经历“随机地不等时长的受限”和“长程移动”的扩散运动,这是由细胞膜的动态栅栏结构导致的。AuNRs与细胞膜之间复杂的相互作用导致AuNRs在细胞膜上扩散的平动转动均是空间和时间异质性的。同时,该单颗粒示踪方法为复杂的细胞膜结构研究提供了新方向。三、单颗粒示踪技术研究不同修饰金纳米棒与细胞相互作用我们利用颜色双通道差分法追踪分析不同修饰AuNRs与MCF-7细胞的相互作用。我们发现由于配体-受体相互作用差异性、受体表达分布及工作机制差异性,不同修饰AuNRs在吸附阶段、膜上扩散阶段、跨膜阶段有不同的动力学特性。因此,详细分析纳米颗粒与细胞的相互作用,有助于我们理解和调控细胞作用机制,进而推进疾病诊断及精准医学的发展。

关键词：暗场显微镜单颗粒示踪技术纳米颗粒与细胞相互作用金纳米棒

基于单颗粒示踪技术研究猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵的分子事件

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基于单颗粒示踪技术研究猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵的分子事件

作者：王彩平河南农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)能够引起妊娠母猪流产、死胎等繁殖障碍和仔猪呼吸系统疾病,称为猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)。PRRSV具有噬单核/巨噬细胞特性,主要是通过受体介导的胞吞途径侵染宿主细胞。在PAM细胞中,HS介导PRRSV吸附、Sn介导PRRSV内吞、CD163介导PRRSV的脱衣壳和病毒基因组释放等。Marc-145细胞中不存在Sn和HS,已有研究发现非肌肉肌球蛋白II型重链A亚型(Non-muscle Myosin Heavy Chain II-A,NMHC II-A)和波形蛋白是PRRSV侵染Marc-145细胞的重要受体,在侵染过程中发挥重要功能。单颗粒示踪技术是一种能够实时原位地示踪生物事件动态过程的新兴技术,现已应用于多种病毒研究,通过对病毒粒子荧光标记并用显微镜实时原位监测病毒粒子侵染行为,推动病毒侵染机制研究进展。为了探索PRRSV在Marc-145细胞中的运动行为,解析波形蛋白和NMHC II-A在PRRSV侵染Marc-145细胞中的作用,深入研究PRRSV侵染机制,本文选用稳定性好、荧光信号强的量子点为荧光标记物,利用链霉亲和素和生物素的相互作用,量子点标记PRRSV,并通过电镜、TCID、生长曲线和免疫荧光共定位等实验验证;用共聚焦显微镜长期、实时、原位示踪了PRRSV单个及群体行为;分别转染GFP和微管、微丝的融合表达载体,成功标记细胞骨架,并研究了其在病毒转运过程中的作用。为了深入探索和研究NMHC II-A和波形蛋白等细胞受体在PRRSV侵染Marc-145过程中的作用,本文通过分别构建波形蛋白和NMHC II-A与GFP的融合表达载体,并通过瞬时转染,实现Marc-145细胞中波形蛋白和NMHC II-A标记,利用病毒单颗粒示踪技术研究他们在病毒侵染过程中的作用。结果表明:(ⅰ)用量子点成功标记PRRSV,经验证,该标记方法对病毒粒子生物活性影响小,标记效率高;(ⅱ)在Marc-145细胞中,PRRSV通过慢-快-慢的间歇运动从细胞外围向细胞核周围运动,多数汇聚至特定区域;(ⅲ)PRRSV依赖于微管、微丝等细胞骨架转运至核周围,并多数聚集至一定区域;(ⅳ)部分病毒沿波形蛋白从细胞外围运动至核周,波形蛋白可能参与PRRSV的胞内转运;(ⅴ)NMHC II-A与PRRSV具有明显的共定位,可能与病毒的胞内转运有关。本文将单颗粒示踪技术应用于PRRSV侵染机制研究中,为PRRSV研究提供新技术,有助于推动PRRSV侵染机制研究进展。波形蛋白和NMHC II-A等PRRSV细胞受体研究,有利于揭示PRRSV侵染机制,为研制更有效的病毒疫苗和高效的诊断试剂奠定基础。

关键词： PRRSV 单颗粒示踪技术量子点侵染机制研究进展