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芸薹根肿菌在科、属上的寄生专化性及生理小种单孢系的建立

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芸薹根肿菌在科、属上的寄生专化性及生理小种单孢系的建立

作者：姜丽霞四川农业大学

学位级别：硕士

根肿病是由芸薹根肿菌侵染引起的严重危害十字花科植物的根部病害。芸薹根肿菌寄主范围非常广泛,不仅可寄生十字花科植物,人工接种时也可侵染非十字花科植物。芸薹根肿菌具有寄生专化性,其生理小种已有广泛而较为深入的研究,而芸薹根肿... 详细信息

根肿病是由芸薹根肿菌侵染引起的严重危害十字花科植物的根部病害。芸薹根肿菌寄主范围非常广泛,不仅可寄生十字花科植物,人工接种时也可侵染非十字花科植物。芸薹根肿菌具有寄生专化性,其生理小种已有广泛而较为深入的研究,而芸薹根肿菌是否存在变种和专化型,这是目前国内外尚未探明的科学问题。迄今为止,除本项目组前期的研究外,尚无文献报道芸薹根肿菌种内在寄主科、属层面存在寄生专化性。本实验在实验室前期的研究基础之上,继续探索国内不同地区来源的芸薹根肿菌在不同科以及十字花科不同属层面的寄生专化性;对用Williams鉴别系统鉴别出来的芸薹根肿菌的生理小种进行单孢分离,优化单孢接种方法和接种植株的培养方法,并获得单孢系。通过研究得到以下结果:1.芸薹根肿菌在不同科层面的寄生专化性搜集了国内外已有报道的能被芸薹根肿菌寄生的不同科寄主,共11科13属13种,又根据此11个科的近源种选了新的非十字花科植物8科9属9种,共计19科22属22种植物。采集国内10个不同地区的芸薹根肿菌菌株,通过室内接种实验探明芸薹根肿菌种内在不同科层面的寄生专化性。结果显示,不同地区来源的根肿病菌对不同科寄主存在致病性差异,表明芸薹根肿菌种内在不同科层面存在寄生专化性。显微镜下观察寄主植物的根毛侵染和皮层侵染,在第10 d时,所有科的植物都发生了根毛侵染,第20 d时,只有旱金莲科的旱金莲、茄科的辣椒、十字花科的榨菜、旋花科的空心菜发生了皮层侵染。在所有不同科的植物中,只有旱金莲科的旱金莲、茄科的辣椒、旋花科的空心菜、十字花科的榨菜发病,其它科的植物均未发病。根据芸薹根肿菌在不同科植物上的致病性分化,初步将芸薹根肿菌划分为4个变种,即芸薹根肿菌旱金莲科变种（Plasmodiophora brassicae Woronin var.capucine）、芸薹根肿菌茄科变种（P.brassicae Woronin var.eggplant）、芸薹根肿菌旋花科变种（P.brassicae Woronin var.convolvula）和芸薹根肿菌十字花科变种（P.brassicae Woronin var.cruciferous）。2.芸薹根肿菌在十字花科不同属层面的寄生专化性搜集了国内外已报道的能被芸薹根肿菌寄生的十字花科不同属植物共计28属30种的33个品种,采集国内10个不同地区的芸薹根肿菌菌株,通过室内接种实验探明芸薹根肿菌种内在十字花科不同属层面的寄生专化性。结果显示,不同的菌株致病性存在差异,表明芸薹根肿菌种内在十字花科不同属层面存在寄生专化性。白芥、芝麻菜、荠菜、板蓝根、拟南芥、涩荠、七里黄、山葵、紫辉甘蓝、糖芥10种植物接不同地理来源的菌源时均发病;而南庭芥、紫罗兰、播娘篙、羽衣甘蓝、豆瓣菜、桂竹香6种植物均未发病。香雪球、萝卜、家独行菜、中甘十一、辣根、蓝香芥、美华甘蓝、二月兰、屈曲花、七里香10种植物接不同地区的菌源时存在抗感差异。根据其在十字花科不同属植物上的致病性分化,可初步将芸薹根肿菌划分为4个专化型,即芸薹根肿菌二月兰专化型（Plasmodiophora brassicae Woronin f.***.orychophragmus）、芸薹根肿菌萝卜专化型（P.brassicae Woronin f.***.radicula）、芸薹根肿菌蓝香芥专化型（P.brassicae Woronin f.***.hesperis）、芸薹根肿菌甘蓝专化型（P.brassicae Woronin f.***.brassica）。3.芸薹根肿菌生理小种单孢系的建立采用本课题组用Williams鉴别系统鉴别出来的3个生理小种,利用琼脂块法挑取单孢,优化了单孢接种的方法和接种植株的培养方法,最终得到了3个生理小种的单孢根瘤36个,对3个生理小种的第一代单孢根瘤进行扩繁,3次扩繁最终得到了301个根瘤,成功建立了3个生理小种的单孢系。

关键词：芸薹根肿菌寄生专化性变种专化型单孢系

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十字花科根肿病菌单孢系的建立

十字花科根肿病菌单孢系的建立

作者：刘振林四川农业大学

学位级别：硕士

近百年来,十字花科根肿病一直是十字花科作物的主要土传病害,其发病危害严重,对十字花科作物的产量影响非常大。在我国,根肿病的蔓延非常迅速,全国大部分地区都有根肿病的分布,对根肿病的全面有效防治已刻不容缓。目前,十字花科防治方... 详细信息

近百年来,十字花科根肿病一直是十字花科作物的主要土传病害,其发病危害严重,对十字花科作物的产量影响非常大。在我国,根肿病的蔓延非常迅速,全国大部分地区都有根肿病的分布,对根肿病的全面有效防治已刻不容缓。目前,十字花科防治方法主要有化学防治,生物防治,田间防治和抗病育种等,其中最便捷有效的一种防治措施就是抗病品种的选育。但由于根肿病是一类具有明显生理小种的病菌,田间病根肿瘤中存在混合小种,故用田间根瘤作为接种源所鉴定出来的生理小种应为"致病型",而并非生理小种。不同地区,不同环境下生理小种有很大的不同,这样就对抗病育种和抗病品种的合理应用造成了很大困难。本研究以建立根肿病单孢系为目的,通过对根肿病菌进行单孢分离、寄主扩繁等方法获得单孢系。同时进行了一些相关研究,即对根肿病菌在实验室条件下发病情况进行了观察研究,进行了休眠孢子的最佳保存方式、最佳接种浓度的探究;通过对非寄主植物的研究,提高休眠孢子在接种过程中的萌发率。对单孢分离的操作过程进行优化,培养得到了单孢系,并对扩繁的根瘤进行了 PCR检测。1.实验室环境下十字花科根肿病病原菌保存和接种浓度观察在试验中发现,4℃保存的孢悬液依然会有孢子萌发的现象,-20℃下长时间保存孢悬液会有休眠孢子破损的情况。所以在实验室条件下,田间采集的根肿病材料最好是以根瘤的形式保存在-20℃的冰箱中,尽量不要以孢悬液的形式进行保存;季节适宜的情况下,实验室接种后培育的植株各侵染阶段同田间侵染基本一致,可完成其生活史;接种浓度过高会影响植物早期的生长导致无法供给根肿病菌足够的营养,并且接种浓度和根瘤的大小呈负相关,为了得到更充足的休眠孢子,接种浓度为1× 106左右最合理。2.非寄主植物对休眠孢子萌发作用探究使用黑麦草、韭葱、辣椒、萝卜和大白菜5种植物根渗液处理根肿病菌的休眠孢子,7 d后萌发率分别为93.00%、75.33%、50.67%、78.67%和69.00%。证明了某些非寄主植物根渗液对休眠孢子萌发有促进作用,其中以黑麦草最为显著。黑麦草根渗液可以替代寄主植物根渗液作为单孢挑取时的促萌发溶液。3.十字花科作物根肿菌单孢系的建立通过对单孢挑取方法、孢悬液的处理、接种植株的培育等方面的改进,最终得到了大邑县、罗江县、德阳市等地十字花科根肿病单孢根瘤22个;对罗江的第一代单孢瘤进行了扩繁,3次扩繁一共得到了 65个根瘤,成功建立了一个单孢系。4.根肿病菌单孢根瘤的分子检测通过对2次扩繁得到的单孢根瘤使用特异性引物进行PCR扩增,验证了其中含有根肿病休眠孢子存在;对其扩增产物进行测序后的序列,得到了两个600 bp左右的条带,进行比对后发现,2个序列基本相同,证明在单孢扩繁过程中没有受到其它根肿病菌的污染。

关键词：根肿病菌根渗液单孢分离单孢系

玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)单孢系和单斑系后代变异的初步研究(续)

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河北农业大学学报 1985年第4期 45-55页

作者：康绍兰黄梧芳

来源于小斑病菌同一菌株、同一菌落的不同单孢系和同一病斑的不同单斑系,无论在当代或后代,在菌落生长速度,拟菌核和菌落局变的出现产孢力及分生孢子和菌落的形态等各方面,都存在着一定差异、但是互相间没有明显的相关性。单孢系和单斑... 详细信息

来源于小斑病菌同一菌株、同一菌落的不同单孢系和同一病斑的不同单斑系,无论在当代或后代,在菌落生长速度,拟菌核和菌落局变的出现产孢力及分生孢子和菌落的形态等各方面,都存在着一定差异、但是互相间没有明显的相关性。单孢系和单斑系继代培养到10代以后,多数性状有显著变化,特别是产孢量明显减少,有的甚至失去产孢力,但两者后代所致病斑长度的变化不大。另外,能否产生菌核及每根孢子梗上产生孢子的数目,不是菌系的一个稳定性状。经50代继代培养结果,单斑系后代性状变化比单孢系稍小、而较稳定,因此在研究小斑病菌、包括研究小斑病菌的生理小种,采用单斑系来代替单孢系比较有利。应用人工培养基上的培养物以不超避10代为宜。

关键词：分生抱子初步研究着生病斑长度菌落玉米小斑病菌后代变异 Bipolaris maydis 菌核单孢系继代培养小斑病

根肿菌的SRAP遗传多样性分析及大白菜抗根肿菌转录组分析

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根肿菌的SRAP遗传多样性分析及大白菜抗根肿菌转录组分析

作者：许路阳四川农业大学

学位级别：硕士

十字花科根肿病是由芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae引起的,在世界范围内都有发生。根肿菌可以长时间在土壤中以休眠孢子的形式存活,并且具有很强的抗逆性。根肿病是一些重要十字花科经济作物,如油菜、甘蓝、白菜的严重病害,造成巨... 详细信息

十字花科根肿病是由芸薹根肿菌Plasmodiophora brassicae引起的,在世界范围内都有发生。根肿菌可以长时间在土壤中以休眠孢子的形式存活,并且具有很强的抗逆性。根肿病是一些重要十字花科经济作物,如油菜、甘蓝、白菜的严重病害,造成巨大的经济损失,近年来还发现板蓝根等感染根肿病的情况。目前,选育抗病品种是一项行之有效的根肿病防控技术,国内外普遍采用的一种方法。但由于根肿菌存在生理小种分化现象,因此明确不同地区生理小种及优势小种,就能够对十字花科作物的抗病育种和品种的合理布局提供理论依据。本研究针对上述问题,对采自四川省不同病区的根肿菌进行了分析研究,结果如下。1.探究了不同浓度的根肿菌孢子悬浮液侵染大白菜和拟南芥的发病情况,将两种寄主发病情况做了对比,在菌悬液为4号生理小种且接种浓度为2×10时,大白菜和拟南芥均有最高的发病率分别为84%和100%,21d便可以在拟南芥拟上观察到发病的情况,大白菜则需要60 d,因此拟南芥可能更适合作为单孢扩繁的感病寄主。在刘振林的琼脂块挑单孢方法的基础上,选择拟南芥作为接种根肿菌单孢和继代扩繁的寄主材料,提高了获取单孢系的时间和效果,这对单孢系的建立有较为重要的意义。2.从81对SRAP引物组合中筛选出了4对能够对根肿菌DNA扩增出多态性好,条带清晰的引物组合F5R6、F7R5、F9R2、F9R3。4个引物组合在72个根肿菌样本中一共扩增出了88条谱带,平均22条,其中81条为多态性条带。通过遗传多样性的分析,SRAP能够将大部分不同的根肿菌田间分离系分离开来,但是不同田间分离的遗传背景与根肿菌地理来源并无明显相关性。同时同一田间分离系的根肿菌也可能存在较为明显的遗传变异。第二章中得到的两个单孢材料2号和46号并未在遗传变异上表现出明显的差异性。SRAP得到的结果与Williams鉴定的结果并无明显的相关性,但是该分子标记技术能将9号生理小种分离开来。3.应用转录组测序技术,获得了大白菜根部组织转录组数据,共获得了13.82G的核苷酸序列数据量,过滤后的clean reads中分别为26617458(B4DN),30491432(B4DK),27569178(B10DN),25876754(B10DK)。差异表达分析中两个时间点的接种和不接种处理总共筛选出252个差异基因。其中76个为上调基因,77个为下调基因;接种后10d相对于不接种后10d有99个差异基因。其中37个为上调基因,62个为下调基因。两个时间点一共有25个共同的差异基因。对GO(Gene Ontology)富集中的过氧化物相关的基因进行了重点分析,在两个时间点上该相关基因均上调表达,可以通过测量该物质的含量来判断植物是否在进行抗逆反应。其中几丁质酶只在侵染4d的样品中出现了GO富集,这可能与几丁质酶的功能有关,几丁质酶可以有效的降低细胞壁中的大分子物质并释放二级激发子,可以作为看作是攻击病原物的一种手段。另外通过分析次级代谢产物以及苯丙氨酸的KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集得到结论,这两种物质的作用机制很可能是诱导植物产生抗性,即系统获得性抗性,能帮助大白菜抵御根肿菌的侵染,为抗病育种提供了新的思路。

关键词：根肿病单孢系 SRAP 遗传多样性转录组测序抗病机理

耕层土壤镰刀菌单胞系的建立和基因组DNA的快速抽提

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山西农业大学学报（自然科学版） 2002年第1期22卷 32-35页

作者：李志岗宋东辉王建明贺运春李志远山西农业大学农学院山西太谷030801 大同师范学院生物科学系山西大同039031

采用改进的镰刀菌选择性培养基和产孢培养基对采自大田、苗圃耕层土壤中的镰刀菌进行单孢分离 ,共分离出 5 0个镰刀菌菌株 ,而且改进的镰刀菌选择性培养基对目标菌选择性强 ,产孢量大。用改进的SDS -SEAVG分离法和快速抽提法提取镰刀菌... 详细信息

采用改进的镰刀菌选择性培养基和产孢培养基对采自大田、苗圃耕层土壤中的镰刀菌进行单孢分离 ,共分离出 5 0个镰刀菌菌株 ,而且改进的镰刀菌选择性培养基对目标菌选择性强 ,产孢量大。用改进的SDS -SEAVG分离法和快速抽提法提取镰刀菌基因组DNA ,结果显示 ,用改进的镰刀菌DNA抽提方法抽提的DNA分子量大于 5 0kb ;用快速抽提方法获得的镰刀菌单孢系DNA可用于PCR扩增。

关键词：耕层土壤镰刀菌抽提遗传多样性单孢系基因组DNA 病原菌