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化学通报 2016年第4期79卷 292-298页

作者：于婵婵姚立中国科学院化学研究所北京100190

近年来,单分子力谱技术获得了快速发展和广泛应用。通过单分子力谱技术研究生物分子结构、力学及动力学,在单分子水平上揭示生物分子间相互作用机制,对于深入了解生物分子的特异识别、生化过程以及生物分子结构与功能的关系具有重要意... 详细信息

近年来,单分子力谱技术获得了快速发展和广泛应用。通过单分子力谱技术研究生物分子结构、力学及动力学,在单分子水平上揭示生物分子间相互作用机制,对于深入了解生物分子的特异识别、生化过程以及生物分子结构与功能的关系具有重要意义。本文主要介绍了3种最常见的单分子力谱技术:原子力显微镜(AFM),光镊(OT)和磁镊(MT)。另外,还侧重从不同力谱技术的原理、发展及应用三个方面简要介绍了3种大规模并行测量的单分子力谱技术:声力谱(AFS)、离心力显微镜(CFM)以及力诱导剩磁谱技术(FIRMS)。

关键词：单分子力谱技术生物分子相互作用

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穿孔素蛋白单分子力谱样品的制备与研究

穿孔素蛋白单分子力谱样品的制备与研究

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作者：刘华星南京大学

学位级别：硕士

原子力显微镜凭借高的空间分辨率和高灵敏度是目前在生理条件下研究生物样品的重要工具之一。除了作为经典的微纳米级成像工具,原子力显微镜也可被采用为一种单分子力谱技术,广泛的应用到生物样品的力学操作研究中。通过原子力显微镜针... 详细信息

原子力显微镜凭借高的空间分辨率和高灵敏度是目前在生理条件下研究生物样品的重要工具之一。除了作为经典的微纳米级成像工具,原子力显微镜也可被采用为一种单分子力谱技术,广泛的应用到生物样品的力学操作研究中。通过原子力显微镜针尖对单个分子的吸附和拉伸,研究分子本身的力学性质和分子与分子之间的作用力。单分子力谱具有生物相容性好、检测力范围广等优点,可以检测到皮牛(pico Newton,p N)级别的力变化,因此不仅被广泛应用于生物样品,也被应用到研究聚合物和化学键等研究中。采用原子力显微镜研究蛋白样品,利用分子生物学和蛋白质工程制备适用于单分子力谱研究的蛋白样品是其必不可少的第一步。蛋白样品制备的方法和效率直接影响了研究进度和实验结果的准确性。在单分子层面研究蛋白对样品的纯度要求较高,杂蛋白不仅会增加后续工作量,也直接影响了实验效果。因此对蛋白制备方法的优化,是提高单分子研究成功率的的重要步骤。本论文中,我们主要制备了适用于单分子力谱研究的穿孔素(Pore-forming toxins,PFTs)蛋白。穿孔素是细菌攻击宿主细胞的主要武器之一,通过在宿主细胞表面聚集成孔,使宿主细胞内容物外泄,达到杀死宿主细胞的目的。近年来,研究人员在哺乳细胞体内也发现了类似的成孔蛋白,这些成孔蛋白作为免疫系统的一部分,可以杀死入侵细菌或者杀死被侵染的哺乳细胞,激发更强烈的免疫反应,因此研究穿孔素蛋白具有重要的意义。以往通常是在宏观层次观察其溶血活性进行研究。本论文中我们利用原子力显微镜及其单分子力谱技术在单个分子层次直接观察其形态并对其力学稳定性等方面进行研究。论文第一章,我们介绍了原子力显微镜在生物成像、单分子力谱以及与其他设备结合研究蛋白质的应用。介绍了通过分子生物学方法得到目的基因;根据质粒和菌株的不同特性与目的蛋白特性结合,组合成最优的蛋白表达体系;通过大肠杆菌的不同培养方法得到更多目的蛋白;通过基于FPLC的各种手段得到目标蛋白。最终,通过实验条件优化,高效地获取到理想的蛋白样品,为接下来的原子力显微镜成像和单分子力谱实验的奠定基础。第二章中我们利用原子力显微镜成像和单分子力谱技术,对溶血素蛋白(α-Hemolysin)单体、多聚体在水溶液中的形态以及溶血素蛋白多聚体在Dph PC膜中的形态进行了研究,证实了溶血素蛋白多聚体为七聚体。之后对野生型(Wild type)溶血素蛋白七聚体在水溶液和在膜上的解折叠方式进行研究,证明了脂质体膜在溶血素蛋白七聚体稳定性中起到了重要作用。通过在溶血素蛋白七聚体C端连接loop的形式找出了针尖吸附蛋白的位置,并且根据峰与峰之间的ΔLc以及结合膜蛋白顺序性解折叠的特点分析出了蛋白解折叠的方式。我们又通过对溶血素蛋白stem domain的截断,通过研究截断突变体的解折叠方式证明了其在维持溶血素蛋白七聚体稳定性中的重要作用。通过对α-Hemolysin系统性的研究,我们积累了制备适用于单分子力谱研究的穿孔素蛋白的经验。利用这些研究思路,在第三章中我们对另一种穿孔素蛋白,小鼠体内的细胞焦亡素(Gasdermin A3),进行了样品制备的优化和初步的单分子力谱的研究。在使用大肠杆菌表达系统表达哺乳细胞蛋白时,我们通过不同助溶标签、质粒和蛋白纯化方法的不断优化,解决了蛋白产量低、难纯化和易沉淀等难题,实现了单独N端(Gasdermin A3(N))表达和插膜。之后通过单分子力谱修饰的方法,通过Coh-XDoc的相互作用使蛋白得到特异性拉伸,然后对收集的力谱曲线进行叠加,分析解折叠峰之间的ΔLc最终判断出Gasdermin A3(N)单体的蛋白解折叠方式,为后续研究奠定基础。总体来说,本论文主要从分子生物学的构建、表达载体的选择、表达条件和蛋白纯化方法等几个方面进行优化,制备了单分子力谱实验蛋白样品。同时选取了金黄色葡萄球菌分泌的毒性穿孔蛋白α溶血素和小鼠体内免疫反应中的分泌的穿孔蛋白Gasdermin A3作为研究对象。由细菌到哺乳细胞,由浅入深地利用原子力显微镜和单分子力谱技术对穿孔素蛋白的稳定性进行研究,为研究穿孔素这一类蛋白提供帮助。

关键词：穿孔蛋白原子力显微镜成像单分子力谱技术蛋白表达与纯化

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用单分子力谱研究多巴的黏附特性

用单分子力谱研究多巴的黏附特性

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作者：韩晓天南京大学

学位级别：硕士

多巴是贻贝足丝黏附蛋白中的一类特殊氨基酸。是由络氨酸经络氨酸羟化酶修饰后产生的一种具有儿茶酚羟基的氨基酸。实验证明在组成贻贝足丝的Mefp蛋白家族内,所有的蛋白质都含有多巴。其中位于足丝盘与基质交界面上,与足丝黏附性能直接... 详细信息

多巴是贻贝足丝黏附蛋白中的一类特殊氨基酸。是由络氨酸经络氨酸羟化酶修饰后产生的一种具有儿茶酚羟基的氨基酸。实验证明在组成贻贝足丝的Mefp蛋白家族内,所有的蛋白质都含有多巴。其中位于足丝盘与基质交界面上,与足丝黏附性能直接相关的Mefp-3、-5以及构成贻贝足丝鞘,起保护足丝功能的Mefp-1三种蛋白多巴含量最高,可达到15%-30%。人们发现多巴是贻贝足丝黏附蛋白粘附能力的主要贡献者之一。之前人们对多巴的研究大都停留在宏观和介观水平,以整个蛋白或者较大氨基酸片段为研究对象,以很少有针对多巴单分子特性的研究。随着仪器检测手段的革命性进步,近年来单分子力谱技术得以空前发展。基于原子力显微镜技术的单分子力谱方法已被广泛的应用于分子间及分子内相互作用的研究。并产生了很多有重要意义的研究成果。第二章中,我们通过传统的将多巴修饰于原子力显微镜针尖上的方法来研究多巴与基板间的相互作用。我们先用有机化学的方法合成了Boc-dopa,然后将Boc-dopa连接到了修饰有PEG的针尖上。之后用原子力显微镜测量了多巴与Ti、SiO2以及云母表面的相互作用。实验结果显示,多巴与上述三种基底的相互作用均在200-300pN之间,相当于力学性能较好的蛋白的解折叠力。另外我们利用相似的方法对NH2与Ti、SiO2以及云母表面的相互作用也做了相应测量,得到相互作用约在100-200pN范围内,产生相互作用的原因之一是静电相互作用。我们对于单分子多巴与基底相互作用的研究有助于基于多巴的新型材料的设计。第三章中,我们认识到第二章中所用的将分子修饰到针尖上以测量分子间相互作用的传统方法的局限性,所以我们在本章提出了一种新的测量分子间相互作用的单分子力谱实验方法。新方法用透明质酸作为骨架,利用化学合成的方法将目标配体分子修饰到透明质酸链上。通过将对应受体分子固定于基板上,使带有配体的透明质酸通过受体-配体相互作用黏附与基板上。然后进行单分子力谱实验,所得结果类似于多聚蛋白解折叠的力谱曲线。我们用生物素-链霉亲和素这对研究比较透彻的分子验证了方法的可靠性。新方法对于数据质量的提高也得到了证实。在本章最后,我们利用新方法测量了多巴与基底的相互作用,所得相互作用大小约200pN。通过本章我们开发了一种新的测量分子间相互作用的方法,有效的弥补了传统方法的不足。第四章中主要研究了多巴与铁离子的相互作用。由于多巴与铁离子在贻贝足丝鞘结构中非常重要。多巴与铁离子交联形成的网络是贻贝足丝鞘具有高硬度的同时又有着良好弹性的结构基础。经过实验测量在1000nm/s的拉伸速率下多巴与铁离子的结合力在250-400pN范围内。如此强大的结合力是足丝鞘发挥其保护功能的基础。通过上述的研究,我们对单分子多巴的黏附特性有了进一步的了解,对于其分子间的作用力进行了定量的测量。对以后的贻贝足丝粘附机理的阐明和功能性材料的设计做出了有益的贡献。

关键词：多巴黏附特性单分子力谱技术分子间相互作用

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单分子技术研究细胞膜结构和功能

单分子技术研究细胞膜结构和功能

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中国化学会-生物物理化学专业委员会第四届全国生物物理化学会议

作者：王宏达中国科学院长春应用化学研究所

细胞膜是高等生命体基本结构单元"细胞"的天然屏障,它把细胞与外界环境分离开来。细胞膜有许多重要的生物功能,如物质隔离、物质交换和细胞通讯等。在分子水平研究细胞膜的结构对解释细胞膜的功能和治疗细胞膜相关疾病有重要的指导意义... 详细信息

细胞膜是高等生命体基本结构单元"细胞"的天然屏障,它把细胞与外界环境分离开来。细胞膜有许多重要的生物功能,如物质隔离、物质交换和细胞通讯等。在分子水平研究细胞膜的结构对解释细胞膜的功能和治疗细胞膜相关疾病有重要的指导意义。细胞膜结构研究已经有近百年的历史;然而由于结构复杂、研究条件有限,细胞膜这一超分子结构尚处在模型假说阶段。我们利用多种单分子技术(原子力显微镜、超分辨荧光显微镜和单分子力谱技术)在接近生理条件下对多种细胞膜(包括血红细胞膜、细胞器膜和哺乳动物有核体细胞膜等)进行了深入系统的研究,从整体角度揭示了细胞膜的非对称性和种类差异性,并提出了红细胞的"半镶嵌"模型(Semi-mosaic Model)和哺乳动物组织细胞的"蛋白层-磷脂-蛋白岛"模型(Protein Layer-Lipid-Protein Island model);同时,利用单分子力谱和力示踪技术记录了单分子/单颗粒跨膜转运的动态过程。

关键词：细胞膜原子力显微镜超分辨荧光显微镜单分子力谱技术

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基于DOPA的超分子多肽材料的制备与研究

基于DOPA的超分子多肽材料的制备与研究

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作者：王天阔南京大学

学位级别：硕士

海洋生物贻贝可以在海水中自由的黏附于各种礁石,船舶等物体表面而不会脱落,这主要是依靠它的足丝的强大的黏附能力。研究表明,贻贝足丝之所以能有如此强大的黏附能力,与其足丝蛋白中所含有的一个重要的氨基酸有关,即L-Dopa(左旋多巴)... 详细信息

海洋生物贻贝可以在海水中自由的黏附于各种礁石,船舶等物体表面而不会脱落,这主要是依靠它的足丝的强大的黏附能力。研究表明,贻贝足丝之所以能有如此强大的黏附能力,与其足丝蛋白中所含有的一个重要的氨基酸有关,即L-Dopa(左旋多巴)。基于这一结论,关于多巴黏附机制的探究以及多巴相关的高分子材料和黏附剂的发展与应用便迅速成为了生物仿生材料领域一个非常热门的研究方向。人们希望通过对于多巴的探索,揭示贻贝足丝蛋白黏附能力的具体作用机制,并能够帮助设计生产出新型的仿生材料和具有高度环境适应性的生物黏附剂。论文主要分为了四章,在第一章中,我们主要介绍了本文所论述的问题的背景知识,包括多肽自组装机制和多肽自组装水凝胶的发展,贻贝足丝蛋白以及L-Dopa的相关知识,并将二者结合,介绍了目前多巴在多肽自组装材料体系中的一些应用与发展现状,以及未来的研究前景。最后简要介绍了一下整个实验中所用到的基于原子力显微镜的单分子力谱技术。在第二章中,我们具体研究了多巴与正电荷协同性吸附的作用机理。在贻贝足丝蛋白中,除了多巴之外,还含有很多带有正电荷的赖氨酸,多巴与赖氨酸的正电荷之间存在着协同性吸附的效果,但是这种效果的具体作用原理仍需进一步研究和探索。我们首先是合成了两种二肽,分别是赖氨酸氨基侧链受保护的赖氨酸-多巴和多巴-赖氨酸,对照组则是通过化学手段脱去保护基的赖氨酸-多巴和多巴-赖氨酸。然后将它们修饰到针尖上,利用单分子力谱技术测试这些二肽分子和云母以及二氧化钛基板之间相互作用强度的大小。实验结果表明,赖氨酸侧链氨基所带的正电荷确实可以和多巴产生协同性吸附的效果,并且这种协同性吸附效果和分子内的受力分布有关。我们的研究结果解释了贻贝足丝蛋白中的多巴和赖氨酸所带正电荷的协同性吸附,为制作新型人工超分子材料提供了一些新的启示。第三章则介绍了含多巴的超分子多肽水凝胶黏附能力的研究与应用。我们知道多巴是贻贝足丝蛋白能够行使黏附功能的一个重要组成部分。现今的科学研究中也有越来越多的科学工作者开始利用多巴来制备新型人工黏附剂,本章所讨论的内容就是基于此设计了一种含多巴的超分子多肽水凝胶,并利用单分子力谱技术测试了其黏附性能以及和细胞之间的相互作用强度,实验结果表明,含多巴的超分子水凝胶具有非常优异的黏附性能并且对细胞也有很好的黏附效果。随后我们就此结果进行了细胞黏附与释放的应用实验,结果表明含多巴的超分子水凝胶可以很好的吸附细胞,甚至优于一些生物黏附剂,并且只需改变环境pH即可释放细胞,整个过程也不会对细胞的活性产生影响。本章的研究结果展示了含多巴的超分子水凝胶优异的黏附能力以及它在细胞运载方面的巨大应用前景,同时为研制新型细胞运载材料提供了启示。最后,我们对以上所有工作做了一个总结并探讨了这个领域的未来发展前景。

关键词：贻贝足丝蛋白多巴原子力显微镜单分子力谱技术协同性吸附水凝胶细胞黏附

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基于原子力显微镜研究生物分子间的识别作用

基于原子力显微镜研究生物分子间的识别作用

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第十三届全国电分析化学学术会议

作者：唐纪琳王楠张喆中国科学院长春应用化学研究所电分析国家重点实验室

原子力显微镜(AFM)由于具有原子级的成像分辨率、皮牛级的测力灵敏度以及可以在生理条件下工作等优点,使其广泛应用于生物学领域。基于AFM的单分子力谱技术(SMFS)可以提供关于配体-受体相互作用,弹性和刚度,以及蛋白质折叠和去折叠机制... 详细信息

原子力显微镜(AFM)由于具有原子级的成像分辨率、皮牛级的测力灵敏度以及可以在生理条件下工作等优点,使其广泛应用于生物学领域。基于AFM的单分子力谱技术(SMFS)可以提供关于配体-受体相互作用,弹性和刚度,以及蛋白质折叠和去折叠机制的信息。AFM技术的另一个应用是分子识别成像,通过同时生成形貌图和识别图像不仅能反映出样品的形貌特征,而且能反应出两个分子之间的特异性相互作用和相应功能在样品表面的分

关键词：原子力显微镜单分子力谱技术生物分子肿瘤细胞

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