检索结果-南通市图书馆

作者：傅豪重庆大学

学位级别：硕士

石墨烯作为固体润滑材料已获得广泛的研究,但实验制备的石墨烯表面存在大量的原子级台阶,且环境分子易于吸附在具有丰富悬键的台阶边缘,这两者都可能对石墨烯摩擦学特性产生重要影响。本文应用Reax FF反应力场分子动力学模拟方法,研究... 详细信息

石墨烯作为固体润滑材料已获得广泛的研究,但实验制备的石墨烯表面存在大量的原子级台阶,且环境分子易于吸附在具有丰富悬键的台阶边缘,这两者都可能对石墨烯摩擦学特性产生重要影响。本文应用Reax FF反应力场分子动力学模拟方法,研究了环境条件（真空,潮湿环境）、台阶边缘功能基团（氢钝化,羟基钝化）等对石墨烯台阶处摩擦行为、耐磨特性和承载能力的影响与作用机制。主要研究内容如下:（1）模拟了金刚石探针在石墨烯台阶/HOPG表面滑动、登上台阶的滑动摩擦过程,研究了环境条件（真空,潮湿环境）、台阶边缘功能基团（氢钝化,羟基钝化）等对系统台阶处摩擦行为的影响;计算了界面接触面积、水分子数量变化,解释了潮湿环境下两种功能化台阶边缘的不同粘着力行为;分析了两种台阶边缘功能基团与水分子形成不同的作用机制;比较不同环境条件模型,分析了登上台阶过程中液态水不同形态（液态水膜,弯液面）的存在形式对界面粘着作用具有不同的影响作用机理。（2）对前述金刚石探针-石墨烯台阶/HOPG模型进行了一系列载荷的测算,获得了不同环境条件（真空,潮湿环境）、台阶边缘功能基团（氢钝化,羟基钝化）模型磨损发生的起始临界载荷;通过观察耐磨性能测试过程的原子构型演变,发现了磨损失效形式与台阶边缘功能基团种类直接相关,解释了台阶边缘功能基团对磨损临界载荷的作用机理;通过对比不同环境模型磨损发生的起始临界载荷,分析了环境水分通过两种水分子作用机制（钝化、润滑作用）增强石墨烯台阶处耐磨性能的作用机理。（3）模拟了金刚石探针沿法向方向趋近石墨烯台阶/HOPG表面的压痕过程,研究了环境条件（真空,潮湿环境）、台阶边缘功能基团（氢钝化,羟基钝化）等对石墨烯片层承载能力的影响;计算了载荷-压痕深度曲线,结合界面C-C键的键序变化,获得了石墨烯各片层失效发生的极限应力;通过观察台阶处的纳米压痕过程,发现了环境水分既能以水层形式分散受力、提高台阶层承载能力,又能通过水解反应加速裂纹拓展、降低HOPG各片层承载能力的作用机理;通过观察压痕加载过程的原子构型演变,分析了台阶边缘羟基削弱成键位点强度、降低羟基化模型承载能力的作用机理。

关键词：石墨烯台阶环境水分功能基团粘着行为力学性能

芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究

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芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究

作者：李蕊伽西南大学

学位级别：硕士

β-葡萄糖苷酶(β-D-glucopyranoside glucohydrolases,E.C.3.***.1.21)存在于多种生物体中,能够水解糖苷结合物并释放出非还原末端葡萄糖残基,包括葡萄糖苷,1-O-葡萄糖酯和寡糖。在植物、动物和微生物中发挥着一系列功能,包括植物的木质... 详细信息

β-葡萄糖苷酶(β-D-glucopyranoside glucohydrolases,E.C.3.***.1.21)存在于多种生物体中,能够水解糖苷结合物并释放出非还原末端葡萄糖残基,包括葡萄糖苷,1-O-葡萄糖酯和寡糖。在植物、动物和微生物中发挥着一系列功能,包括植物的木质化,细胞壁寡糖的分解代谢、防御、植物激素共价激活、香气成分释放以及植物-微生物和植物-昆虫的相互作用,动物中糖脂和外源葡萄糖苷的分解、微生物中的生物质转化等。应用于食品、农业和能源等多种领域,特别在食品风味中,β-葡萄糖苷酶促进酒类、果汁与茶叶的增香作用,该酶通过生物精炼工艺将纤维素转化为可持续生产液体燃料和化学产品原料,此外还与糖苷类香料前体结合能够作为天然香料,为新品种天然香料提供新的领域。该酶在植物界中具有最广泛的生物学功能,芦荟分布广泛,且含有丰富的营养价值和保健价值,在食品、医疗以及化妆品领域的发展较为成熟,而大部分芦荟叶皮作为加工副产物被丢弃,本课题以芦荟叶皮为材料分离纯化β-葡萄糖苷酶,并对其酶学性质和功能基团进行研究,为获得β-葡萄糖苷酶提供新的途径,有效缓解资源浪费和环境污染,为进一步探索多种应用功能提供理论基础。1.芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的分离纯化将新鲜库拉索芦荟叶皮洗净后经柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液匀浆抽提、硫酸铵分级沉淀后透析、DEAE-Sepharosefastflow 层析和 Superdex-200prepgrade 层析,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶样品。实验结果得知:该酶的回收率为9.87%,纯化倍数为328.27,酶比活力为98.48 U/mg。2.芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的酶学性质芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的全酶分子质量约为69.7 kD,亚基分子质量约为69.3 kD,由此推测该酶由单亚基构成。最适反应pH值和温度分别是5.0和40 ℃,在4℃、pH 5.0～8.0及20～30 ℃稳定性较好,最适反应条件下对底物pNPG的米氏常数 Km值 2.21 mmol/L,Vmax为 1.381 μmol/min.L。3.不同金属离子、化合物和有机溶剂对芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的影响乙醇、抗坏血酸、Mn2+、K+表现较强的激活作用;SDS、Cu2+表现较强的抑制作用;Cd2+、Co2+、Ba2+、Ca2+表现较弱的抑制作用;甲醇、EDTA、Zn2+均表现双重作用;异丙醇、尿素、草酸、Mg2+、Li+无显著影响。4.芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶的功能基团通过不同浓度的化学修饰剂对芦荟叶皮β-葡萄糖苷酶侧链残基进行特定修饰的结果:甲硫氨酸巯醚基、色氨酸吲哚基可能是该酶的必需基团且参与活性中心的组成;精氨酸残基、赖氨酸氨基、组氨酸咪唑基、酪氨酸酚羟基、半胱氨酸巯基及二硫键可能不是该酶的必需基团且未参与活性中心的组成。

关键词：芦荟叶皮 β-葡萄糖苷酶分离纯化酶学性质功能基团

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铜蓝蛋白的分离纯化及其性质与功能基团研究

铜蓝蛋白的分离纯化及其性质与功能基团研究

作者：褚波西南大学

学位级别：硕士

铜蓝蛋白(EC 1．16．3．1)是一种存在于脊椎动物血清中并携带了95％以上血清铜的α糖蛋白唾液酸酶，主要在肝脏中合成。该蛋白是一种应急反应蛋白，当生物体发生感染、炎症或损伤时，诱发了肝脏内铜蓝蛋白基因的大量表达使血清铜蓝蛋白... 详细信息

铜蓝蛋白(EC 1．16．3．1)是一种存在于脊椎动物血清中并携带了95％以上血清铜的α糖蛋白唾液酸酶，主要在肝脏中合成。该蛋白是一种应急反应蛋白，当生物体发生感染、炎症或损伤时，诱发了肝脏内铜蓝蛋白基因的大量表达使血清铜蓝蛋白浓度升高。铜蓝蛋白在血浆中的含量大概为300μg／mL，拥有多种生理功能，比如铜离子运输，血液凝固，血管生成，铁平衡，铁转运以及抗氧化作用等。目前经研究证明与铜蓝蛋白有关的疾病有老年痴呆、糖尿病、视网膜变性、锥体外系症状、Wilson症、心血管疾病、神经退化、动脉粥样硬化等疾病。研究铜蓝蛋白与这些疾病之间的关系已经是医学和生物学界的热点之一。猪为哺乳纲，偶蹄目，猪科的动物，猪是人类重要的肉类来源，对人类的生活、经济作出了巨大的贡献。对猪血来源的铜蓝蛋白进行研究一方面可以弥补我国在铜蓝蛋白相关研究方面的空白，为研究铜蓝蛋白的生理功能研究提供一定的理论基础;另一方面，可以让广大农民朋友认识到猪血的价值，让猪血的利用价值得到更大程度的开发，提高其经济价值。此外，由于铜蓝蛋白参与了众多生理功能，因此它还是一种潜在的蛋白药物，也许可以提高动物的抗病能力，促进动物生长等。本文主要对铜蓝蛋白的分离纯化、理化性质、酶促动力学性质、抑制剂以及功能基团进行了研究，结果如下： 1．铜蓝蛋白的分离纯化以猪血清为原材料，经稀释、正丁醇脱脂、超滤、硫酸铵分级沉淀获得粗酶液，进一步经过DEAE-琼脂糖离子交换柱层析，羟基磷灰石层析，Superdex-200凝胶过滤纯化，以SDS-PAGE和等电聚焦电泳检测其纯度，获得了电泳纯的铜蓝蛋白，提纯倍数为216倍，比

关键词：铜蓝蛋白分离纯化性质功能基团

黑曲霉TH-2蔗糖酶的分离纯化及部分性质与功能基团研究

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黑曲霉TH-2蔗糖酶的分离纯化及部分性质与功能基团研究

作者：黄洁西南大学

学位级别：硕士

蔗糖酶(EC 3.***.1.26,Sucrase),又称转化酶或β-呋喃果糖苷酶,能够不可逆地催化蔗糖水解,生成葡萄糖和果糖。它广泛存在于自然界的动物、植物和微生物中,是生物体中一类重要的水解酶类。研究表明,微生物来源的蔗糖酶比动物、植物来源地... 详细信息

蔗糖酶(EC 3.***.1.26,Sucrase),又称转化酶或β-呋喃果糖苷酶,能够不可逆地催化蔗糖水解,生成葡萄糖和果糖。它广泛存在于自然界的动物、植物和微生物中,是生物体中一类重要的水解酶类。研究表明,微生物来源的蔗糖酶比动物、植物来源地蔗糖酶性质更加稳定,在工业生产中常以酵母、曲霉和细菌作为主要来源。本文从实验室保存的黑曲霉菌株中筛选出蔗糖酶高产菌,并以它作为出发菌株进行发酵培养,分离纯化出蔗糖酶,并对其部分酶学性质进行了研究,结果如下：从实验室保存的14株黑曲霉菌株中筛选出一株蔗糖酶高产菌株黑曲霉TH-2。黑曲霉TH-2发酵培养,发酵菌丝体经研磨、抽提、透析、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析得蔗糖酶纯品,并以SDS-PAGE检测其纯度。纯化后的蔗糖酶比活为135.2U/mg,回收率为37.7%,提纯倍数为20.3倍。测得该酶分子量为129kD,亚基分子量约为63.75kD,为双亚基酶。该酶最适温度为65℃,最适pH为4.4,在pH3-5范围内较稳定,米氏常数Km值为23.1mmol/L。在实验的几种化学试剂中,抗坏血酸的抑制作用最强,EDTA、双氧水和尿素对酶的活性影响不显著。在实验的金属离子中,Hg+、Ag+对蔗糖酶有很强的抑制作用;Ca2+、Mg2+、K+、Ba2+、Co2+对其活性仅有较弱的抑制作用;Zn2+、Cu2+、Mn2+对蔗糖酶有激活作用。采用修饰剂在一定条件下对该酶进行修饰,结果表明：甲硫氨酸、色氨酸、巯基、丝氨酸可能是蔗糖酶活性中心的必需基团,而组氨酸、酪氨酸、精氨酸、二硫键不是蔗糖酶活性中心的必需基团。

关键词：黑曲霉蔗糖酶分离纯化性质功能基团

面包酵母谷胱甘肽还原酶的分离纯化及酶学性质和功能基团的研究

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面包酵母谷胱甘肽还原酶的分离纯化及酶学性质和功能基团的研究

作者：甘慧西南大学

学位级别：硕士

谷胱甘肽还原酶(Gluathione reductase,GR)是一种抗氧化酶,属于黄素蛋白二硫氧化还原酶家族,广泛存在于真核生物和原核生物中。绝大多数来源的谷胱甘肽还原酶都是由两个亚基构成,是一个同源二聚体。GR作为谷胱甘肽代谢中关键一员,在氧... 详细信息

谷胱甘肽还原酶(Gluathione reductase,GR)是一种抗氧化酶,属于黄素蛋白二硫氧化还原酶家族,广泛存在于真核生物和原核生物中。绝大多数来源的谷胱甘肽还原酶都是由两个亚基构成,是一个同源二聚体。GR作为谷胱甘肽代谢中关键一员,在氧化还原代谢中有着重要的地位,其主要功能是以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为还原辅因子,将氧化型谷胱甘肽(GSSG)转化为还原型谷胱甘肽(GSH),维持细胞中GSH/GSSG比率动态平衡,负责细胞中还原型谷胱甘肽的供应,为活性氧(ROS)等的清除提供还原力,以维持细胞内氧化还原稳态。氧化还原稳态的维持对于细胞行使正常生理功能尤为重要,若体内氧化系统和还原系统失衡则会导致细胞出现损伤,使机体代谢异常。近几年对于动物体内谷胱甘肽还原酶方面的研究主要集中于GR在一些疾病的发生与防御中的作用等,并将其作为一些疾病(比如炎症、真菌感染、癌症和肿瘤等)的治疗靶点,来指导药物设计等,除此之外,GR还可作为一些疾病的预测指标;在植物方面,主要集中于研究其基因特性和在植物应对非生物胁迫等方面的作用,并用于改造抗逆性更强的植物和农作物等;在微生物方面,主要集中于研究谷胱甘肽还原酶在一些真菌、细菌、疟原虫长发育中的作用,用于一些抗疟等药物的研发。对于谷胱甘肽还原酶的具体结构信息以及分子水平上的构效机制等方面研究总的来说还比较少。目前谷胱甘肽还原酶已在医学、农学等方面有所应用,且具有广阔的应用前景。本研究以廉价易得且易于大规模培养的面包酵母为材料,通过响应面法优化设计最佳提取条件,纯化出高活性的电泳纯谷胱甘肽还原酶,在NCBI上选取不同来源的谷胱甘肽还原酶基因与面包酵母GR进行了生物信息学分析,并对其理化性质、酶学性质和功能基团做了研究,为GR酶的工业生产和应用研究提供参考。研究结果如下:1、面包酵母谷胱甘肽还原酶基因GLR1序列全长2743 bp,开放读码框(Open Reading Frame,ORF)全长1401 bp,编码467个氨基酸。谷胱甘肽还原酶氨基酸序列主要包含两个保守的结构域,活性位点1位于氨基酸序列20位到333位,活性位点2位于氨基酸序列356位到466位。系统进化分析表明,盘基网柄菌的谷胱甘肽还原酶基因与其他物种的谷胱甘肽还原酶基因的亲缘关系比较远,其余9种物种的谷胱甘肽还原酶基因聚类形成两个大的分支。豌豆、烟草、拟南芥和粳稻聚为一支,表明这几个物种的谷胱甘肽还原酶基因亲缘关系比较近;小巢状曲菌、面包酵母和裂殖酵母聚为一支,表明这3个物种的谷胱甘肽还原酶基因亲缘关系比较近。2、本实验以面包干酵母为实验材料通过响应面法优化后确定最佳提取条件为:提取缓冲液pH 7.14,液料比(V/m)为10.7:1,提取时间为2.05 h。经研磨抽提、乙醇分级沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯谷胱甘肽还原酶。纯化结果表示:谷胱甘肽还原酶比活力达2471.88U/mg,纯化倍数为63.76倍,回收率为2.14%。3、面包酵母谷胱甘肽还原酶是由两个亚基约为55.6 kD构成的同源二聚体,全酶分子量大小约为120.4 kD;该酶最适反应温度为45℃,最适pH为7.2;在20～45℃、pH 6.0～7.5具有良好的稳定性。在最适条件下以氧化型谷胱甘肽(GSSG)为底物,测得K值为0.41 mmol/L,V为0.176 mmol/L。Mn、Cu、Zn、Fe、Co对谷胱甘肽还原酶酶活力抑制作用比较强,低浓度表现出抑制作用;低浓度Ba、Ca、Na、Pb、Li对GR酶活力没有明显影响,高浓度表现出抑制作用;低浓度(1 mmoL/L以下)Mg和K对该酶有激活作用,而后随着浓度升高,对该酶的激活效果不断减弱。4种有机溶剂甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇对谷胱甘肽还原酶都存在抑制作用。4种化合物对GR酶活影响各不相同:叶酸对该酶酶活性有明显的激活作用;抗坏血酸对该酶没有明显作用;EDTA对该酶起双重作用,在较低浓度(1.0 mmol/L以下)可以激活GR酶的活性,浓度高于1.0 mmol/L时,对该酶表现出抑制作用;SDS对该酶有抑制作用,并随着浓度不断增大,抑制效果逐渐增强。4、用特异性化学修饰剂对谷胱甘肽还原酶侧链基团进行化学修饰结果表明:赖氨酸ε-NH、二硫键、精氨酸胍基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基、甲硫氨酸硫醚基、谷氨酸/天冬氨酸羧基、色氨酸吲哚基和酪氨酸酚羟基是该酶活性中心的必需基团。

关键词：谷胱甘肽还原酶生物信息学分离纯化酶学性质功能基团

芦荟过氧化氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究

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芦荟过氧化氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究

作者：朱鸿西南大学

学位级别：硕士

过氧化氢酶(Catalase, CAT)是一类广泛存在于植物、动物和微生物体内的末端氧化酶,专一分解过氧化氢。它是一类抗氧化剂,催化细胞内过氧化氢发生歧化反应,使之转化为氧气和水,防止细胞的过氧化。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来... 详细信息

过氧化氢酶(Catalase, CAT)是一类广泛存在于植物、动物和微生物体内的末端氧化酶,专一分解过氧化氢。它是一类抗氧化剂,催化细胞内过氧化氢发生歧化反应,使之转化为氧气和水,防止细胞的过氧化。过氧化氢酶是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一,迄今它被广泛应用造纸、纺织、食品、医药、环保等行业。库拉索芦荟(Aloe barbadensis Miller)是一种多年生多肉质百合科的草本植物,它是一种集观赏、保健、美容、药用于一身的纯天然绿色植物。芦荟的汁液中含有丰富的维生素、氨基酸、蛋白质、多糖、活性酶以及对人体十分有益的微量元素。我们发现芦荟中过氧化氢酶含量丰富。而作为植物材料,芦荟的蛋白种类和含量较动物原料要少,分离纯化更简单。目前对芦荟过氧化氢酶的分离纯化未见报道。因此本文以芦荟叶片为原料,对过氧化氢酶的分离纯化、理化性质、酶促动力学性质、抑制剂以及功能基团的化学修饰等方面进行了研究,为工业规模化生产过氧化氢酶制品提供了参考。结果如下： 1.芦荟过氧化氢酶的分离纯化采用硫酸铵分级沉淀,DEAE-Sepharose阴离子交换层析,CM-Sepharose阳离子交换层析和Sephacryl S-200凝胶层析对酶蛋白进行分离纯化,采用SDS-PAGE鉴定酶的纯度,获得电泳纯的过氧化氢酶,纯化倍数为228.05倍,酶活力回收率为14.10%,比活达17427.30U／mg。 2.芦荟过氧化氢酶的性质研究理化性质研究表明,该酶的相对分子量为239.90kD,亚基相对分子量为60.60kD。推测该酶由4个相同亚基构成。该酶最适温度为45℃,最适pH值为7.5,以过氧化氢为底物测定该酶的表观Km为34mmol／L。 3.金属离子及相关试剂的影响 Ba2+、K+对过氧化氢酶有轻微的激活作用,Cu2+、Zn2+对过氧化氢酶有明显的抑制作用,Fe2+有一定的抑制作用,Li+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+对该酶基本无影响。抗坏血酸、尿素对芦荟过氧化氢酶无明显作用,EDTA、KSCN对芦荟过氧化氢酶有抑制作用,SDS和草酸对芦荟过氧化氢酶抑制作用较明显。 4.芦荟过氧化氢酶的功能基团修饰功能基团修饰表明：二巯基苏糖醇(DTT)对该过氧化氢酶有极强的抑制作用,其次是氯胺-T (Chloramine-T),溴乙酸(BrAc)、乙酰丙酮(BD)、N-乙酰咪唑(NAI)以及顺丁烯二酸酐(Maleic anhydride)对芦荟过氧化氢酶的抑制作用不明显,氯汞苯甲酸(PCMB)、苯甲基磺酰氟(PMSF)对芦荟过氧化氢酶有一定的激活作用。

关键词：芦荟过氧化氢酶分离纯化性质功能基团

牛肝碱性磷酸酶的分离纯化、部分性质和功能基团及固定化研究

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牛肝碱性磷酸酶的分离纯化、部分性质和功能基团及固定化研究

作者：唐靓婷西南大学

学位级别：硕士

以新鲜的牛肝为材料,经匀浆、Tris-HCl缓冲液抽提、正丁醇除脂、热变性、超滤、DEAE-Sepharose离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,分离纯化出牛肝碱性磷酸酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该酶已达到电泳纯。纯化倍数... 详细信息

以新鲜的牛肝为材料,经匀浆、Tris-HCl缓冲液抽提、正丁醇除脂、热变性、超滤、DEAE-Sepharose离子交换柱层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,分离纯化出牛肝碱性磷酸酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该酶已达到电泳纯。纯化倍数达228.74倍,比活为19863.50U／mg.经SDS-PAGE和凝胶过滤测得该酶的亚基分子量为59 Kd,全分子量为118 Kd。以磷酸苯二钠为底物,测得该酶的最适pH为10.0,最适温度为45℃。Na+、K+、Li+等一价离子对该酶活性基本无影响,Mg2+对该酶活性有激活作用,Cu2+、Zn2+、Ca2+、Fe2+、Mn2+对该酶活性有抑制作用,Km为1.12mmo1／L。分别采用对氯汞苯甲酸(PCMB)、乙酰丙酮(BD)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二巯基苏糖醇(DTT)、琥珀酸酐(SUAN).N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、碘乙酸(IAc)这七种化学修饰剂,在一定条件下选择性的修饰牛肝碱性磷酸酶的氨基酸侧链,结果表明：***、NBS、IAc这四种化学修饰剂能显著的抑制牛肝碱性磷酸酶的活力,并且酶活力的降低与修饰剂浓度的成正相关。而DTT、SUAN、NBS、IAc能选择性的修饰蛋白质中的二硫键、ε-氨基、色氨酸残基、组氨酸残基。因此我们认为,ε-氨基、色氨酸残基、组氨酸残基是牛肝碱性磷酸酶活性中心所必需的功能基团,而二硫键对于维持酶活性中心的结构也是必需的。分别采用海藻酸钠、聚乙烯醇-海藻酸钠为载体固定牛肝碱性磷酸酶。对两种载体固定化方法的单因素实验条件进行优化,并进行了正交优化试验。再对两种方法下的固定化酶进行性质研究,通过实验分别测定出两种固定化酶的最适温度、最适酸碱度和储存稳定性。实验结果：通过海藻酸钠固定法的实验条件优化,确定海藻酸钠的最适浓度为1%,海藻酸钠与酶液的最适比例为3：1,氯化钙的最适浓度为0.5%,固定化酶在氯化钙中放置的最适时间为30min。通过海藻酸钠固定法的正交优化试验,确定CA:AKP的最佳水平为3：1,CA浓度最佳水平为2%,氯化钙浓度的最佳水平为0.2%。海藻酸钠固定法的酶回收率最高可以达到80%。海藻酸钠固定化酶的最适温度为45℃,最适pH值为pH9.5,在30天内,固定化酶的剩余酶活力达到了75%.说明海藻酸钠固定化酶在4℃下具有较好的储存稳定性。通过聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的实验条件优化,确定聚乙烯醇的最适浓度为1%,海藻酸钠的最适浓度为1%,聚乙烯醇-海藻酸钠与酶液的最适比例为4：1,氯化钙的最适浓度为0.5%,固定化酶在氯化钙中放置的最适时间为30min。通过聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的正交优化试验,确定PVA浓度的最佳水平为1.5%,氯化钙浓度的最佳水平为0.2%、CA浓度最佳水平为1.5%,PVA-CA:AKP的最佳水平为4：1,聚乙烯醇-海藻酸钠固定法的酶回收率最高可以达到95.1%。聚乙烯醇-海藻酸钠固定化酶的最适温度为40℃,最适pH值为10.5。在三十天内,固定化酶的剩余酶活力达到了94%.说明PVA-CA固定化酶在4℃下具有良好的储存稳定性。

关键词：牛肝碱性磷酸酶分离纯化性质功能基团固定化

蒜苗过氧化氢酶的分离纯化和性质及功能基团研究

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蒜苗过氧化氢酶的分离纯化和性质及功能基团研究

作者：胡瑞斌西南大学

学位级别：硕士

过氧化氢酶(Catalase, CAT)又称触酶,是一类普遍存在于动植物和绝大多数需氧微生物体内的末端氧化酶。其生理功能是催化细胞内过氧化氢分解,防止过氧化,清除生物体内的活性氧。与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)共同组成了生物体... 详细信息

过氧化氢酶(Catalase, CAT)又称触酶,是一类普遍存在于动植物和绝大多数需氧微生物体内的末端氧化酶。其生理功能是催化细胞内过氧化氢分解,防止过氧化,清除生物体内的活性氧。与超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)共同组成了生物体内活性氧防御系统。它在食品加工、临床医疗、纺织、印染、环保等行业具有十分重要的应用价值。同时来源于植物的CAT市场上很少,而且植物材料含有相对较少的杂蛋白,因此研究开发取材简便、价格低廉、活性较高而且性质稳定的植物CAT有着十分重要的意义。蒜苗,又叫蒜毫、青蒜,是大蒜幼苗发育到一定时期的青苗,是一种四季生长又廉价易得的绿色蔬菜。它含有丰富的VC、以及可溶性蛋白质、游离氨基酸、多糖、大蒜素等营养成分并能增进食欲,具杀菌作用。经研究发现,蒜苗中过氧化氢酶含量较一般植物中高,在实验过程中较稳定且从蒜苗中分离纯化过氧化氢酶未见报道,故本研究以新鲜的蒜苗为实验材料,从中分离纯化CAT并对其部分性质进行研究,以期为进一步的开发应用该酶提供参考依据。研究结果如下： 1.蒜苗过氧化氢酶的分离纯化新鲜蒜苗经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的过氧化氢酶。该酶比活力达到25975.36U/mg,回收率为40.05%,纯化倍数为125.97。 2.蒜苗过氧化氢酶的酶学性质研究结果表明,蒜苗过氧化物酶的全分子质量和亚基分子质量分别为234.93kD和59.16kD,推测该酶是由四个相同亚基构成。该酶最适反应温度为45℃,最适pH值为7.2。该酶在25～45℃及pH5-10的范围内有较好的稳定性;在最适条件下,以过氧化氢为底物测得其Km值为38.2mmol/L。 3.部分化学试剂对蒜苗过氧化氢酶的影响甲醇、乙醇、异丙醇及SDS、KSCN、Ag+、Cu2+、Mn2+、 Co2+、Cd2+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+(?)酶有抑制作用。Li+、Pb2+及低浓度K+对该酶具有一定的激活作用。尿素、EDTA、ASA对该酶活性基本无影响。 4.蒜苗过氧化氢酶的功能基团研究研究结果表明：色氨酸残基可能是蒜苗过氧化氢酶活性中心的必需基团,可能参与了该酶活性中心的构成。而二硫键、丝氨酸残基、赖氨酸残基巯基、精氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基、甲硫氨酸硫醚基不是该酶活性中心的必需基团,且碘乙酸对该酶有一定的激活作用。

关键词：蒜苗过氧化氢酶分离纯化性质功能基团

鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究

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鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化及性质和功能基团研究

作者：方玲西南大学

学位级别：硕士

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH, EC1.***.1.27)广泛存在于动植物及微生物体内,是生物体内进行糖代谢的重要酶之一,主要催化丙酮酸和乳酸之间的可逆转化。该酶在动物体内主要存在H、M、C三种亚基,H、M两个亚基组成了LDH1(H4)、LDH... 详细信息

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH, EC1.***.1.27)广泛存在于动植物及微生物体内,是生物体内进行糖代谢的重要酶之一,主要催化丙酮酸和乳酸之间的可逆转化。该酶在动物体内主要存在H、M、C三种亚基,H、M两个亚基组成了LDH1(H4)、LDH2(H3M)、LDH3(H2M2、LDH4(HM3)、LDH5(M4)五种同工酶,LDH-C4是由C亚基构成的四聚体。乳酸脱氢酶是常用的临床诊断用酶,主要用于心肌梗死、肝病、肺梗塞及白血病的诊断,丙酮酸盐的检定,盐渍品、发酵奶制品及饮料生产中的食品添加剂,是生产丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒的主要原料。目前已有较多关于乳酸脱氢酶的研究报道,但鸭肝中乳酸脱氢酶分离纯化的研究未见报道。因此,本文以.来源较广,价格便宜,取材方便的鸭肝为实验材料来分离纯化乳酸脱氢酶,并对其部分酶学性质进行研究,旨在为该酶的更深入研究及工业化生产提供参考。研究结果如下：1.鸭肝乳酸脱氢酶的分离纯化新鲜的鸭肝,经匀浆、PBS缓冲液抽提、乙醇和硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析后,获得电泳纯的LDH。经纯化后比活力达到668,82 U/mL,酶活性回收率为25.79%,纯化倍数为185.78倍。2.鸭肝乳酸脱氢酶的性质研究鸭肝乳酸脱氢酶全分子质量约为170.93 kD,亚基分子质量为44.72 kD;最适反应温度为45℃,最适pH值为7.4,在25～45℃及pH 5～10的范围内稳定性较好;在45℃,pH 7.4条件下,测得该酶对底物NADH的Km值为3.407μmol/L,对丙酮酸钠的Km值为8.431μmol/L。Cu2+、Ag+、氯仿、甲醇、异丙醇、乙醇、草酸、SDS、EDTA对鸭肝LDH都有较明显的抑制作用,Co2+、K+对鸭肝LDH有双重作用,低浓度激活而高浓度对酶活性有抑制作用。3.鸭肝乳酸脱氢酶功能基团的研究本实验通过用不同化学修饰剂对鸭肝乳酸脱氢酶的修饰结果表明：丝氨酸残基、半胱氨酸的巯基、色氨酸残基和甲硫氨酸的硫醚基是鸭肝乳酸脱氢酶活性中心的必须基团,参与了该酶活性中心的构成;组氨酸的咪唑基、精氨酸残基、酪氨酸的酚羟基、二硫键、赖氨酸残基与鸭肝乳酸脱氢酶活性中心没直接关系,因此,不是鸭肝LDH活性中心的必须基团。

关键词：鸭肝乳酸脱氢酶分离纯化性质功能基团

‘渝薯17’β-淀粉酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究

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‘渝薯17’β-淀粉酶的分离纯化及酶学性质和功能基团研究

作者：陶敏西南大学

学位级别：硕士

β-淀粉酶(beta-amylase,BAM,EC 3.***.1.2)是一种广泛存在于植物、微生物体内的淀粉水解酶。从水解方式来看是一种外切酶,从淀粉的非还原性末端作用于α-1,4糖苷键水解出麦芽糖,直至α-1,6糖苷键前2个葡萄糖残基停止反应,并使底物发生沃... 详细信息

β-淀粉酶(beta-amylase,BAM,EC 3.***.1.2)是一种广泛存在于植物、微生物体内的淀粉水解酶。从水解方式来看是一种外切酶,从淀粉的非还原性末端作用于α-1,4糖苷键水解出麦芽糖,直至α-1,6糖苷键前2个葡萄糖残基停止反应,并使底物发生沃尔登转化,终产物为β-麦芽糖和β-极限糊精。在生物体内,BAM多以单亚基形式存在,而甘薯来源的BAM是由四个相同亚基组成的四聚体。BAM多用于医药、酿造、纺织以及食品加工行业,在食品发酵方面可以作为饮料、啤酒等生产的糖化剂;因此,国内外研究者对不同来源的BAM进行了较为深入的研究。中国是全球的甘薯生产大国,由于甘薯品种多元化,推广面积有所增加。甘薯的消费以鲜食和加工为主,生产甘薯淀粉的工序中会产生大量废水,而废水中富含BAM,如果能够对其进行回收利用可变废为宝。研究和利用高淀粉甘薯品种的一个重要前提就是探究BAM的性质,已有的研究结果显示回收BAM的效率并不高,回收效率有待提高。本研究以重庆市甘薯工程技术研究中心推广的‘渝薯17’块根为实验材料,从中纯化出的BAM回收率高,对淀粉生产副产品能够进行高效回收,可产生巨大的经济效益。同时对其酶学性质和功能基团进行研究,并在NCBI上选取不同来源的BAM与甘薯BAM进行了生物信息学分析,为充分利用甘薯淀粉副产物中的BAM奠定了坚实的理论基础和试验依据。实验结果如下:1、甘薯beta-amylase基因由7个外显子组成,基因全长4772 bp,开放阅读框全长1500 bp,编码499个氨基酸,活性位点在保守结构域内,活性位点1为9503位氨基酸,活性位点2为18494位氨基酸。从微生物到植物分别选择代表性物种进行生物信息学分析,系统进化分析表明巨大芽孢杆菌基因单独聚为一支,其中木薯与马铃薯单独聚为一支、香蕉与拟南芥基因分别聚为一支,大麦和小麦、水稻和玉米聚为一支、甘薯、花生、大豆和三叶草聚为一支;表明甘薯和花生、大豆、三叶草基因的亲缘关系较近。2、新鲜‘渝薯17’块根去皮分装于-20℃保存,响应面法优化得出最佳提取条件为pH 6.7,料液比1:10(m/V)。经匀浆抽提、乙醇分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析后得电泳纯BAM。结果显示:该酶的比活力为333.15 U/mg,回收率为66.6%,纯化倍数9.93倍。3、‘渝薯17’BAM亚基分子量约55.12 kD,全酶分子量约223.54 kD,由此推测该酶是4个相同亚基构成的四聚体;其最适温度和pH分别是50℃、pH 6.2.4;在55℃以下、pH为6该酶具有较好的稳定性;在最适反应条件下测得该酶对可溶性淀粉的K值为1.36 g/mL。尿素对‘渝薯17’BAM具有双重作用,低浓度尿素对酶活性表现促进作用,高浓度时表现较弱的抑制作用;Fe和Co都对该酶起促进作用;Pb、Zn和Ag、草酸、SDS对该酶有较强的抑制作用;Cu、K、Ca对该酶也有一定的抑制作用,但相对酶活力随各自离子浓度变化不明显;有机物中甲醇对该酶的抑制作用最大。4、用特异性化学修饰剂对BAM侧链基团进行化学修饰结果表明:色氨酸吲哚基、半胱氨酸巯基是该酶活性中心的必需基团,直接参与了酶活性中心的构建。甲硫氨酸硫醚基、精氨酸胍基、谷氨酸/天冬氨酸羧基不是该酶的活性基团,但对维持酶的空间构象可能有一定作用。组氨酸吲哚基、丝氨酸羟基、赖氨酸ε-NH、酪氨酸酚羟基、二硫键不参与构建酶的活性中心,它们不是‘渝薯17’BAM活性中心的必需基团。

关键词： β-淀粉酶生物信息学分离纯化酶学性质功能基团