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程序化冷冻对人始基卵泡与初级卵泡保存效果的影响

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生殖与避孕 2008年第9期28卷 563-567页

作者：王利红陈子江李媛赵立新山东中医药大学附属医院生殖与遗传中心济南250011 山东大学山东省立医院生殖医学中心济南250021

目的:探讨程序化冷冻对人卵巢组织内的始基卵泡与初级卵泡形态与凋亡的影响。方法:采用慢速程序化冷冻保存人的卵巢皮质,采用组织形态学、电镜及原位凋亡检测观察冷冻前后的始基与初级卵泡的形态学变化及凋亡情况。结果:冷冻前后人正常... 详细信息

目的:探讨程序化冷冻对人卵巢组织内的始基卵泡与初级卵泡形态与凋亡的影响。方法:采用慢速程序化冷冻保存人的卵巢皮质,采用组织形态学、电镜及原位凋亡检测观察冷冻前后的始基与初级卵泡的形态学变化及凋亡情况。结果:冷冻前后人正常形态的始基卵泡比例无显著变化,而冷冻后形态正常的初级卵泡的比例较新鲜组显著下降(P初级卵泡内线粒体肿胀,胞浆及线粒体出现空泡化,而始基卵泡的超微结构保持良好。冷冻前后2种卵泡的凋亡率比较无差异。结论:程序化冷冻对人初级卵泡的形态损伤严重,对始基卵泡保存较好。

关键词：冷冻卵巢组织始基卵泡初级卵泡

小鼠生殖细胞特异性转录因子NOBOX调控初级卵泡发育机制的研究

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中国比较医学杂志 2021年第4期31卷 107-114页

作者：张雪金美玉于洋郑志红中国医科大学实验动物部沈阳110000 辽宁省转基因动物研究重点实验室沈阳110000

目的NOBOX是在原始卵泡激活过程中起关键作用的转录因子,可直接调控Gdf9转录,并参与GDF9/SMAD通路影响颗粒细胞增殖分化,但其在初级卵泡及之后的具体调控机制并不清楚。Kit作为影响卵泡发育的重要基因,其启动子存在多个NOBOX结合位点。... 详细信息

目的NOBOX是在原始卵泡激活过程中起关键作用的转录因子,可直接调控Gdf9转录,并参与GDF9/SMAD通路影响颗粒细胞增殖分化,但其在初级卵泡及之后的具体调控机制并不清楚。Kit作为影响卵泡发育的重要基因,其启动子存在多个NOBOX结合位点。本研究拟探索在初级卵泡发育阶段,转录因子NOBOX对Kit的转录调控作用,以及通过GDF9/SMAD通路对卵泡发育的影响。方法体外培养初级卵泡统计发育时间;qRTPCR检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9的mRNA表达变化;Western blot检测显微注射Nobox-siRNA的初级卵泡中NOBOX、KIT、P-SMAD的蛋白表达变化;ChIP实验验证转录因子NOBOX在Kit基因启动子上的结合位点。结果初级卵泡在体外培养第5天可发育为次级卵泡,注射Nobox-siRNA的初级卵泡延缓2 d发育至次级;初级卵泡中注射Nobox-siRNA后,卵泡中Nobox、Kit、Kitl、Gdf9 mRNA表达显著下调,NOBOX、KIT、PSMAD2/3蛋白表达量降低;转录因子NOBOX可以结合于Kit基因启动子。结论NOBOX是小鼠初级卵泡发育至次级卵泡的关键基因,NOBOX可直接结合Kit基因启动子,且影响初级卵泡中KITL/KIT和GDF9/SMAD通路。

关键词：初级卵泡 NOBOX ChIP Kit

小鼠和人初级卵泡及未成熟卵母细胞体外成熟培养的研究

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小鼠和人初级卵泡及未成熟卵母细胞体外成熟培养的研究

作者：张文红暨南大学

学位级别：硕士

目的通过建立卵泡和卵母细胞体外成熟培养模型，对卵母细胞的成熟机制进行研究，探讨卵母细胞成熟发育中颗粒细胞和激素的调节作用，增进对卵母细胞体外发育的认识。通过分析培养液中不同激素成分和浓度对小鼠初级卵泡体外生长... 详细信息

目的通过建立卵泡和卵母细胞体外成熟培养模型，对卵母细胞的成熟机制进行研究，探讨卵母细胞成熟发育中颗粒细胞和激素的调节作用，增进对卵母细胞体外发育的认识。通过分析培养液中不同激素成分和浓度对小鼠初级卵泡体外生长成熟的作用，为人初级卵泡的体外成熟培养提供参考性实验依据。探讨小鼠未成熟卵母细胞在体外的成熟培养、受精以及受精后的胚胎发育，建立对成熟后卵母细胞活性及胚卵的检测方法;同时对人卵丘细胞-卵母细胞复合体 (COCs)的体外成熟培养进行探讨性研究。方法本实验以性成熟前昆明系小白鼠卵巢和患卵巢囊肿病人的卵巢组织为实验材料，在37℃，5％CO培养箱中培养初级卵泡和未成熟卵母细胞，并利用双醋酸荧光素(FDA)进行荧光染色，验证形态学观察结果。具体内容如下： 1、小鼠卵巢小组织块在不同组成的酶液中消化处理，所获初级卵泡与机械法所获初级卵泡在无胎牛血清(FBS)和促性腺激素的Waymouth medium MB752/1 培养液中比较培养。 2、机械法所获小鼠初级卵泡在添加FBS以及卵泡刺激素(FSH)或人绝经期尿促性腺激素(hMG)的Waymouth medium MB752/1培养液中比较培养。 3、机械法所获小鼠未成熟卵母细胞的体外成熟、体外受精及胚胎培养。 4、机械法及酶解法获取人初级卵泡和COCs的体外培养和成熟。结果 1、在处理相同数量小鼠卵巢的情况下，含3mg/mL胶原蛋白酶IA和100IU/mL DNase的混合酶液组所获游离卵泡数多于其它组酶解结果;酶解所获卵泡的体外培养存活时间却较机械法所获卵泡短。 2、八鼠初级卵泡在添加 100mIU／mL hMG的培养液中有 15．940(n＝69)发育成小囊腔卵泡，在添加300mIU／mL hMG的培养液中有28．57％(n。56)发育成大囊腔卵泡。 3、小鼠生发泡期卵田细胞体外培养24h，含300mIU／mLhm的AZ组卵日细胞体外受精率为 33．33％…－84X 与含 300mIU／mL FSI的 BZ组间存在极显著差异(P＜0＊1);含300mIU／mLhMG的AZ组培养48h，囚出细胞受精率为0(n＝32)，极显著低于含 150mIU／。L或 300mIU／mL FSH的 BI、BZ组(P＜0．01)。各组受精卵的卵裂率比较，培养24h组普遍高于培养48h组。 4、双醋酸荧光素ODA＊活胚卵及培养的正常卵母细胞发亮绿光。 5、人初级卵泡在添加300m1U／mL hMG的培养液中能正常存活达20天以上，并由IV级卵泡生长成VI级卵泡。人COC。在添加150mIU／mL FSH的培养液中培养72h，释放Pbl而成熟。结论 1、酶解法可获得较多游离卵泡，但刘卵泡的继续培养有不利影响。乙倍养液中添加适当浓度的伽G比陀［对卵泡的生长有利。 3、小鼠GV期裸露卵日细胞能在体外培养成熟且受精分裂;培养液中促性腺激素的种类和剂量以及培养时间对卵田细胞的成熟和受精有明显影响。 4、FDA使形态学观察正常的培养后卵母细胞及受精后胚卵发亮绿光，两者结果具有一致性。 5、人卵泡和 COCS在己建立的小鼠卵泡和卵母细胞培养系统中能生长和成熟。

关键词：初级卵泡末成熟卵母细胞体外培养小鼠人

转录因子LHX8对初级卵泡发育的影响以及对Zp3基因表达调控的初步探究

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转录因子LHX8对初级卵泡发育的影响以及对Zp3基因表达调控的初步...

作者：金美玉中国医科大学

学位级别：硕士

目的:卵巢早衰(POF)是指女性40岁前,由于卵巢内卵泡耗竭而发生的卵巢功能衰竭,临床表现为原发性或继发性闭经,同时伴有围绝经期症状。卵巢作为雌性哺乳动物的生殖器官,具有产生成熟卵泡、分泌雌激素等功能,卵泡是其基本的结构与功能单位... 详细信息

目的:卵巢早衰(POF)是指女性40岁前,由于卵巢内卵泡耗竭而发生的卵巢功能衰竭,临床表现为原发性或继发性闭经,同时伴有围绝经期症状。卵巢作为雌性哺乳动物的生殖器官,具有产生成熟卵泡、分泌雌激素等功能,卵泡是其基本的结构与功能单位,由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞组成。卵泡发育主要由原始卵泡开始,经历初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡最终发育成熟并排卵。卵泡由原始卵泡发育至次级卵泡的阶段称为腔前或非促性腺激素依赖阶段,该阶段主要依靠生殖细胞相关转录因子发挥重要的调控作用,例如FIGLA、SOHLH1、LHX8等均参与调控腔前卵泡的发育过程。LHX8作为生殖细胞发育相关转录因子,是LIM同源框转录因子家族的一员,LIM结构域由两个特殊的锌指构成,位于同源结构域的N端,使LIM-HD蛋白能够以同分或异分的方式与其他转录因子相互作用。文献报道Lhx8雌鼠卵巢内无原始卵泡,原始卵泡组装发生异常,卵母细胞无法生长,出生后生殖细胞缺失,成年后卵巢萎缩,大量生殖细胞特异性基因表达紊乱,出现生殖功能障碍。生殖细胞的发育是一个连续的过程,在卵泡的不同发育阶段,相同的转录因子能够发挥不同的调控作用,广泛性敲除实验只能探究转录因子LHX8在原始卵泡组装过程中作用,LHX8表达贯穿于卵泡发育的各个阶段,在后续卵泡发育过程中作用机制尚未有文献报道。Zp1、Zp2、Zp3是小鼠透明带基因家族成员,Zp1、Zp2、Zp3通过编码翻译形成透明带蛋白,对卵母细胞的发育、受精及着床具有非常重要的作用。文献报道在卵泡发育的早期阶段,FIGLA能够直接转录调控Zp1、Zp2、Zp3基因的表达,SOHLH1能够转录调控Zp1、Zp3基因的表达,间接调控Zp2基因的表达。在初级卵泡阶段,SOHLH1蛋白逐渐消失,ZP1、ZP2、ZP3蛋白在初级卵泡中大量表达直至排卵前。文献报道对Lhx8广泛性敲除新生雌鼠芯片结果分析,得出Zp2、Zp3等卵母细胞发育关键基因均出现表达差异,Zp1基因表达无显著差异,在初级卵泡中进行验证后,推测LHX8可能直接或间接调控Zp2、Zp3的表达。通过生物信息学预测发现Zp3基因启动子序列存在LHX8转录结合位点,因此推测LHX8可能直接调控Zp3基因的表达。本研究通过体外分离培养初级卵泡,运用显微注射siRNA的方法,通过形态学观察以及分子生物学实验初步探究转录因子LHX8对初级卵泡发育的影响以及对Zp3基因表达的调控。研究方法:本研究通过构建Lhx8-pcDNA3.0真核表达质粒,验证Lhx8-siRNA干扰效率;通过对比空白对照组、阴性对照组、显微注射Lhx8-siRNA组体外培养初级卵泡,观察卵泡由初级发育至次级的形态学变化及时间点变化;通过q RT-PCR实验、Western blot实验检测Lhx8基因沉默前后初级卵泡发育相关基因m RNA及蛋白的表达水平;构建Zp3启动子荧光素酶表达质粒和LHX8真核表达质粒并利用荧光素酶活性测定实验检测荧光值,通过Ch IP实验检测LHX8在Zp3基因启动子序列上的结合情况并筛选主要结合位点。结果:1、成功构建Lhx8-pcDNA3.0真核表达质粒,通过与Lhx8-siRNA共转染HEK293T细胞,获得Lhx8-mus-972干扰效率最高,抑制率为95.3%。2、qRT-PCR实验和Western blot实验表明Lhx8基因沉默后Lhx8 m RNA和蛋白表达量均下降,说明显微注射Lhx8-siRNA可以有效使初级卵泡中Lhx8基因沉默。3、通过体外培养初级卵泡,阴性对照组与空白对照组相比表明:显微注射操作未对初级卵泡生长及发育造成影响,两组均2d开始逐渐发育,经历5d发育为次级卵泡;注射Lhx8-siRNA组与阴性对照组相比:Lhx8基因沉默后,初级卵泡发育较为缓慢甚至出现暂时停滞,颗粒细胞增殖受阻,显微注射后6d开始恢复发育,7d可发育为次级卵泡。4、qRT-PCR和Western blot实验结果显示,在初级卵泡中,Lhx8基因沉默后,Zp2、Zp3m RNA表达量显著下调,ZP2、ZP3蛋白表达量显著下调。5、共转染LHX8真核表达质粒和Zp3启动子区域荧光素酶质粒的实验组荧光素酶活性高于对照组,Ch IP实验结果显示转录因子LHX8可以结合于Zp3转录起始位点上游(-1663bp,-1556bp)、(-1305bp,-1298bp)、(-1256bp,-1251bp)、(-1047bp,-1040bp)的结构域,与(-1305bp,-1298bp)(CTAATTAA)位点结合作用最强。结论:1、Lhx8是卵泡由初级发育至次级的关键基因。2、转录因子LHX8可直接激活Zp3的转录,(-1305bp,-1298bp)(CTAATTAA)为主要特异性结合位点。

关键词：初级卵泡 Lhx8-siRNA LHX8 Zp2 Zp3

获得小鼠初级卵泡进行体外培养的酶解方法比较

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中国优生与遗传杂志 2001年第1期9卷 104-105页

作者：张文红朱伟杰钟瑜暨南大学生殖免疫研究中心广州510632

目的 :对酶解小鼠卵巢 ,获取初级卵泡的方法进行探讨。方法 :卵巢取自性成熟前的昆明系小白鼠 ,酶液由不同浓度的胶原蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和链蛋白酶组成 ,培养液为WaymouthmediumMB75 2 /I,并添加牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白。... 详细信息

目的 :对酶解小鼠卵巢 ,获取初级卵泡的方法进行探讨。方法 :卵巢取自性成熟前的昆明系小白鼠 ,酶液由不同浓度的胶原蛋白酶、脱氧核糖核酸酶和链蛋白酶组成 ,培养液为WaymouthmediumMB75 2 /I,并添加牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白。实验共分 6组 ,每组所用酶液组成和处理时间各不相同。结果 :由 3mg/ml的胶原蛋白酶、10 0IU/ml的脱氧核糖核酸酶 ,另加或不加 0 .0 2mg/ml的链蛋白酶组成 ,处理时间为 2 0分钟的两个处理组 ,卵泡分离效果较好。结论 :胶原蛋白酶浓度是影响卵巢中卵泡分离的主要因素 ,它和消化时间对卵泡分离及分离后卵泡形态、存活能力有影响。

关键词：初级卵泡酶解分离体外培养小鼠

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小鼠窦前卵泡二维体外培养法的优化研究

解放军医学杂志 2020年第7期45卷 702-708页

作者：王喜艳潘晓燕孙艳美吴迪史沛德王富吉林医药学院生殖医学研究中心吉林省吉林市132013

目的优化小鼠窦前卵泡二维体外培养体系,探讨卵泡刺激素(FSH)对小鼠窦前卵泡体外发育的影响。方法将分离自14 d雌鼠的初级卵泡(80~100μm)和早期次级卵泡(110~130μm)分别培养在浓度为10、100 mU/ml r-FSH的培养液中,观察并记录卵泡体... 详细信息

目的优化小鼠窦前卵泡二维体外培养体系,探讨卵泡刺激素(FSH)对小鼠窦前卵泡体外发育的影响。方法将分离自14 d雌鼠的初级卵泡(80~100μm)和早期次级卵泡(110~130μm)分别培养在浓度为10、100 mU/ml r-FSH的培养液中,观察并记录卵泡体外生长情况和卵母细胞的成熟情况;检测并分析第10天窦卵泡的空间生长情况及不同培养液中卵泡的雌二醇(E2)分泌水平;Western blotting检测卵泡中FSH受体(FSHR)、类固醇激素合成限速酶3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、17α-羟化酶(CYP17)及芳香化酶(CYP19)的表达水平。结果初级卵泡在10、100 mU/ml r-FSH培养液中的成腔率(0.00%±0.00%,36.14%±4.02%)及卵母细胞成熟率(0.00%±0.00%,23.54%±7.62%)明显低于早期次级卵泡成腔率(78.63%±4.13%,92.74%±2.54%)及卵母细胞成熟率(48.55%±3.73%,80.88%±4.02%),差异有统计学意义(P卵泡成腔率(92.74%±2.54%)、卵母细胞成熟率(80.88%±4.02%)明显高于在10 mU/ml r-FSH培养液中的卵泡成腔率(78.63%±4.13%)及成熟率(48.55%±3.73%),差异有统计学意义(P卵泡在10 mU/ml r-FSH的培养液中呈平铺式生长模式,而在100 mU/ml r-FSH培养液中呈立体空间生长模式,后者更接近于体内卵泡的生长模式;早期次级卵泡中FSHR的相对表达水平明显高于初级卵泡(1.86±0.32 vs.1.19±0.28,t=4.94,P卵泡组卵泡3b-HSD、CYP17及CYP19的表达以及E2的分泌水平明显高于用10 mU/ml r-FSH培养液培养时。结论FSH不仅会影响窦前卵泡的体外发育率,还会改变窦前卵泡的体外发育模式。选择早期次级卵泡培养在含100 mU/ml r-FSH的二维培养液中培养可获得理想的卵泡发育率及发育模式。

关键词：初级卵泡早期次级卵泡卵泡刺激素卵泡刺激素受体类固醇激素合成酶

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原始卵泡形成研究进展

现代畜牧科技 2020年第12期39卷 1-3页

作者：哈斯高娃陈小辛伊茹汗乌日罕娜仁花内蒙古农业大学动物科学学院内蒙古自治区动物遗传育种与繁殖重点实验室内蒙古呼和浩特010018

卵巢早期发育中的原始卵泡形成以及原始卵泡向初级卵泡的转变及后续发育是卵巢行使生物功能的关键过程。这些过程直接影响女性在整个生育过程中可获得的卵母细胞数量。原始卵泡作为发育卵泡和卵母细胞的唯一来源,在哺乳动物整个生殖中... 详细信息

卵巢早期发育中的原始卵泡形成以及原始卵泡向初级卵泡的转变及后续发育是卵巢行使生物功能的关键过程。这些过程直接影响女性在整个生育过程中可获得的卵母细胞数量。原始卵泡作为发育卵泡和卵母细胞的唯一来源,在哺乳动物整个生殖中起到了至关重要的作用,一旦原始卵泡池被耗尽,会发生绝经并导致卵巢病变,如卵巢早衰(POF)和不孕。原始卵泡组装和发育由局部产生的旁分泌和自分泌生长因子协调,内分泌因素如黄体酮也被发现影响原始卵泡组装。本文综述介绍了原始卵泡形成与发育,包括参与原始卵泡发生的细胞因子,总结了小鼠和人体这些过程的细胞和分子研究的进展。

关键词：原始卵泡卵巢早衰初级卵泡生长因子

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原始卵泡形成和发育调节机制研究进展

动物医学进展 2006年第3期27卷 30-33页

作者：宋艳画宋善道张家骅西南大学动物科技学院重庆市牧草与草食家畜重点实验室重庆400716

原始卵泡的形成及其向初级卵泡的转化是卵泡发育过程中的一个重要阶段,是由多种内分泌、旁分泌和自分泌因素调控的生理过程。高水平的类固醇激素会抑制卵泡的形成,局部分泌的kit配基、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、角质形... 详细信息

原始卵泡的形成及其向初级卵泡的转化是卵泡发育过程中的一个重要阶段,是由多种内分泌、旁分泌和自分泌因素调控的生理过程。高水平的类固醇激素会抑制卵泡的形成,局部分泌的kit配基、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、角质形成细胞生长因子、骨形态发生蛋白等可促进原始卵泡向初级卵泡的转化,而抗缪勒氏激素则对这一过程有抑制作用。

关键词：原始卵泡初级卵泡形成转化调控

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动物原始卵泡生长调节因子的研究进展

国际生殖健康／计划生育杂志 2008年第1期27卷 11-13页

作者：池海虹周颖温州医学院附属第一医院生殖中心 325000

了解原始卵泡的形成、激活,特别是原始卵泡向初级卵泡转变的调控机制对卵子库的建立和辅助生殖技术的发展有着重要意义。简要综述与哺乳动物原始卵泡的形成、激活及向初级卵泡的转变过程有关的Fig-a、神经内分泌因子、酪氨酸蛋白激酶受... 详细信息

了解原始卵泡的形成、激活,特别是原始卵泡向初级卵泡转变的调控机制对卵子库的建立和辅助生殖技术的发展有着重要意义。简要综述与哺乳动物原始卵泡的形成、激活及向初级卵泡的转变过程有关的Fig-a、神经内分泌因子、酪氨酸蛋白激酶受体(c-kit)的配体(KL)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白血病抑制因子(LIF)、转化生长因子β(TGF-β)家族成员、抗苗勒激素(AMH)等调节因子的研究进展。

关键词：原始卵泡激活调节初级卵泡