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刚地弓形虫14-3-3蛋白真核表达载体的构建与表达

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2012年第6期30卷 438-441页

作者：孙敏何深一赵广会丛华周怀瑜赵群力孟敏山东大学医学院病原生物学研究所济南250012

目的构建并表达刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体。方法用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒... 详细信息

目的构建并表达刚地弓形虫RH株14-3-3蛋白的真核表达载体。方法用生物信息学方法对弓形虫14-3-3蛋白的理化性质和结构进行预测。以弓形虫RH株总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建重组质粒pcDNA3.0/14-3-3,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,用脂质体法转染人宫颈癌(HeLa)细胞,蛋白印迹(Western blotting)分析表达产物。结果根据14-3-3蛋白基因片段序列和氨基酸序列预测,该蛋白分子为酸性可溶性蛋白,主要以同源或异源二聚体存在,有5个氨基酸保守序列区。RT-PCR的扩增产物约为800 bp,构建的真核表达质粒pcDNA3.0/14-3-3插入片段经测序,片段长度为801 bp,与GenBank中刚地弓形虫14-3-3蛋白基因序列(登录号为AB012775.1)同源性为99%。Western blotting分析结果显示,在转染pcDNA3.0/14-3-3的细胞中,有14-3-3蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为30 000,且表达量显著高于转染空质粒和未转染的细胞。结论构建了真核表达载体pcDNA3.0/14-3-3,并能在真核细胞内表达。

关键词：刚地弓形虫 14-3-3蛋白真核表达生物信息学

刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的克隆与表达

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中国人兽共患病杂志 2005年第4期21卷 331-334页

作者：余南何蔼郑小英申川军郑斌郑焕钦李卓雅曹爱莲詹希美中山大学基础医学院寄生虫学教研室广州510089

目的　克隆编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,构建原核表达载体pET MMIC3,并在大肠杆菌BL2 1株中表达。方法　采用PCR技术从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,并克隆到T载... 详细信息

目的　克隆编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,构建原核表达载体pET MMIC3,并在大肠杆菌BL2 1株中表达。方法　采用PCR技术从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,并克隆到T载体上,经测序鉴定后,将目的基因亚克隆到表达载体pET30a(+)上,构建质粒pET MMIC3。表达产物用Westernblot进行进一步确认。结果　经初步菌液PCR鉴定,提取质粒双酶切鉴定并测序,确认插入T载体的序列为所需的目的序列;亚克隆构建pET -MMIC3,转化到宿主菌大肠杆菌BL2 1,得到分子量为37.2kDa的重组表达蛋白,Westernblot的结果与预测相符。结论　成功的克隆并融合表达了刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽,为进一步研究其在弓形虫粘附和入侵中的作用奠定了基础。

关键词：刚地弓形虫微线体克隆表达

刚地弓形虫感染昆明种及Babl/c小鼠的病理特征研究

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中国现代医学杂志 2009年第5期19卷 665-667页

作者：李永念包怀恩贵阳医学院免疫学教研室贵州贵阳550001 贵阳医学院寄生虫学教研室贵州贵阳550001

目的研究弓形虫感染昆明种及Babl/c小鼠的病理特征。方法分别以刚地弓形虫速殖子感染昆明种及Babl/c小鼠,观察小鼠感染发病情况,并用病理组织切片,直接染色或免疫组化法检测小鼠体内弓形虫包囊或抗原。正常对照组小鼠未感染弓形虫。结... 详细信息

目的研究弓形虫感染昆明种及Babl/c小鼠的病理特征。方法分别以刚地弓形虫速殖子感染昆明种及Babl/c小鼠,观察小鼠感染发病情况,并用病理组织切片,直接染色或免疫组化法检测小鼠体内弓形虫包囊或抗原。正常对照组小鼠未感染弓形虫。结果两种小鼠对刚地弓形虫均易感,昆明种小鼠感染刚地弓形虫后2、3d开始发病,感染后7～10d死亡,死亡率95.00%;Babl/c小鼠于感染后4、5d开始发病,呈一过性急性发作,绝大多数小鼠能度过急性期逐步恢复而长期存活,仅少数小鼠死亡,死亡率为10.00%。昆明种小鼠感染后主要表现为肝细胞变性、坏死、大量炎细胞浸润,小肠黏膜坏死脱落,腹腔内可见大量弓形虫速殖子;Babl/c小鼠在急性感染期表现为肝细胞水变性,腹腔内可见弓形虫速殖子,度过急性期后继续存活的小鼠体内虽未见到大量包囊、但在肝、脑等组织中可检出弓形虫抗原。对照组小鼠在实验期间无任何异常。结论两种小鼠对刚地弓形虫的易感性不同,Babl/c鼠感染弓形虫后经历了急性和慢性感染的转换过程,是研究弓形虫感染与免疫的良好模型。

关键词：刚地弓形虫昆明小鼠 Babl/c小鼠

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刚地弓形虫ROP12蛋白的生物信息学分析

中国病原生物学杂志 2015年第6期10卷 531-535页

作者：郭玲玲王春苗张进顺张晓磊贾晓晖姜文静刘楠河北北方学院病原生物与免疫学研究所河北张家口075000

目的通过在线生物程序分析刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白12(ROP12)的生物信息学特性。方法通过在线ProtParam、SOSUI、SOPMA、TMHMM、MotifScan及SYFPEITHI等程序,同时结合DNASTAR、DNAMAN生物信息学软件,分析TgROP12蛋白的生物学特性,如理化性质、二级结构、结构域及抗原表位等。结果TgROP12蛋白含有236个氨基酸,其为分子式C1125H1786N308O360S3,其分子质量和理论等电点分别为25.48ku和4.53。TgROP12蛋白具有信号肽序列和跨膜结构区域,其二级结构中β-转角和无规则卷曲分别占7.20%和44.92%;TgROP12蛋白含有8个亲水性较高(临界值为2.0)的区域,10个表面可及性较高(临界值为1.9)的区域;TgROP12蛋白含有保守结构区域和翻译后修饰位点各6个,并含有9个B细胞抗原表位和6个T细胞抗原表位。结论生物信息学分析显示TgROP12蛋白的免疫原性较好,可作为弓形虫病疫苗候选分子。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白12 生物信息学分析

刚地弓形虫培养上清对卵巢癌SKOV-3细胞的影响

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第四军医大学学报 2009年第24期30卷 3026-3029页

作者：葛璞李春莉彭静武卫华叶彬重庆医科大学病理生理学教研室重庆医科大学肿瘤与分子医学中心重庆400016 重庆医科大学生命科学院重庆400016 重庆医科大学病原生物学教研室重庆400016

目的:研究体外培养条件下的弓形虫培养上清对卵巢癌细胞SKOV-3细胞增值的影响及诱导其凋亡的情况.方法:取对数生长期的SKOV-3细胞(数量为5×107/L)分别接种于不同细胞培养板,对照组加入RPMI-1640孵育,试验组加入相同体积不同数量(3×101... 详细信息

目的:研究体外培养条件下的弓形虫培养上清对卵巢癌细胞SKOV-3细胞增值的影响及诱导其凋亡的情况.方法:取对数生长期的SKOV-3细胞(数量为5×107/L)分别接种于不同细胞培养板,对照组加入RPMI-1640孵育,试验组加入相同体积不同数量(3×1010/L,6×1010/L,12×1010/L)弓形虫速殖子培养上清,四甲基氮噻唑蓝(MTT)法检测吸光度(A490nm值)并计算SKOV-3细胞增值抑制率;Annexin-V-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率;并以荧光显微镜观察SKOV-3细胞形态改变情况;以琼脂糖凝胶电泳观察SKOV-3细胞凋亡DNA条带.结果:MTT法检测结果显示SKOV-3细胞增殖抑制率随着弓形虫速殖子培养上清数量和作用时间增加均明显增大,12×1010/L数量组72h抑制率最高可达(33.52±2.63)%,弓形虫速殖子培养试验组抑制率与对照组之间比较差异均有统计学意义(P弓形虫培养上清流式细胞仪检测显示SKOV-3细胞凋亡率随着时间增加有升高趋势,48h达到凋亡最高值(18.23%),48h后凋亡率开始下降,死亡率增加.荧光显微镜观察到试验组培养不同时项的SKOV-3细胞出现不同时期凋亡特征性改变.琼脂糖凝胶电泳见DNA梯形条带.结论:弓形虫速殖子培养上清对体外培养SKOV-3细胞增殖有明显的抑制作用,并可诱导SKOV-3细胞凋亡.

关键词：刚地弓形虫人卵巢癌细胞SKOV-3 细胞凋亡

刚地弓形虫P30与谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白通过辛德比重组病毒在动物细胞内的表达

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国际医学寄生虫病杂志 1994年第3期 140-141页

作者：罗树宏

P30是刚地弓形虫速殖子期主要表面抗原之一,能刺激机体产生高效价的抗体。由于从速殖子纯化P30既费时又费力,因此研制重组P30亚单位疫苗将是一种较为实用的方法。最近,通过基因工程技术,将辛德比病毒(Sindbis virus)载体Toto2Jl表达来... 详细信息

P30是刚地弓形虫速殖子期主要表面抗原之一,能刺激机体产生高效价的抗体。由于从速殖子纯化P30既费时又费力,因此研制重组P30亚单位疫苗将是一种较为实用的方法。最近,通过基因工程技术,将辛德比病毒(Sindbis virus)载体Toto2Jl表达来自亚基因组病毒mRNA的氯霉素乙酰转移酶(CAT),再用外源目的基因取代CAT基因,形成的重组载体感染真核生物系统,可得到所需要的重组蛋白。

关键词：刚地弓形虫 P30 辛德融合蛋白蛋白质速殖子溶解物谷胱甘肽辅酶硫转移酶 GST

刚地弓形虫棒状体蛋白18及其作为基因工程疫苗候选分子研究进展

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动物医学进展 2017年第12期38卷 104-107页

作者：刘荣荣张晓磊张进顺河北北方学院病原生物学与免疫学研究所河北张家口075000

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分... 详细信息

刚地弓形虫棒状体蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒状体分泌的、属于棒状体蛋白2家族的一员,具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性,在虫体入侵和毒力的发挥方面起着重要作用。论文就ROP18蛋白的结构、毒力和作用机制及其作为基因疫苗候选分子的研究现状进行综述。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白18 毒力作用机制基因疫苗

刚地弓形虫培养上清对人肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的作用

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激光杂志 2013年第1期34卷 98-99,101页

作者：黄开顺黄天利葛璞叶彬重庆医科大学实验教学中心重庆400016 重庆医科大学附一院老年科重庆400016 重庆医科大学基础医学院病理生理教研室重庆400016 重庆医科大学病原生物学教研室重庆400016 重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心重庆400016

目的:研究刚地弓形虫RH株培养上清对体外培养的肝癌细胞HepG2增值的影响,并探讨其可能的影响机制。方法:取对数生长期的HepG2细胞,分别接种于96孔细胞培养板及50mL培养瓶中,加入200μL不同数量(3×107/mL、6×107/mL、12×107/mL)弓形... 详细信息

目的:研究刚地弓形虫RH株培养上清对体外培养的肝癌细胞HepG2增值的影响,并探讨其可能的影响机制。方法:取对数生长期的HepG2细胞,分别接种于96孔细胞培养板及50mL培养瓶中,加入200μL不同数量(3×107/mL、6×107/mL、12×107/mL)弓形虫RH株速殖子培养上清孵育24、48、36、72h后,四甲基氮噻唑蓝(MTT)法检测其对HepG2细胞增殖抑制作用;不同浓度弓形虫培养上清作用HepG2细胞48 h后,DAPI染色,荧光显微镜观察细胞核形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内钙离子浓度(〔Ca2+〕i),Western-blot检测凋亡HepG2细胞内Caspase-3的表达。结果弓形虫培养上清能抑制HepG2细胞株增殖和诱导其凋亡,且呈时间剂量依赖性,各实验组与对照组比较有统计学意义(P刚地弓形虫培养上清能够抑制肝癌HepG2细胞增殖,其诱导HepG2细胞凋亡可能与细胞内钙离子浓度上调和Caspase-3的表达增强相关。

关键词：刚地弓形虫肝癌细胞HepG2 细胞凋亡细胞内钙离子浓度半胱氨酸蛋白酶-3

刚地弓形虫苹果酸脱氢酶基因编码蛋白主要特性与抗原表位的生物信息学分析

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中国人兽共患病学报 2013年第5期29卷 472-475页

作者：刘转转杨燕萍郑葵阳刘宜升徐州医学院徐州221004

目的用生物信息学方法分析刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。方法利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMPRED、HNN、MotifScan和NCBI上的ORF finder、SignalP、Bcep... 详细信息

目的用生物信息学方法分析刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。方法利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMPRED、HNN、MotifScan和NCBI上的ORF finder、SignalP、Bcepred等生物信息学在线分析程序,结合Gene Runner和DNAMAN等生物信息学软件,分析并预测TgMDH蛋白的开放阅读框、理化性质、可溶性、信号肽、跨膜区、表面可及性、可塑性、亲(疏)水性、翻译后修饰位点、二级结构及抗原表位,通过CPHmodels程序预测该蛋白的三维空间结构。结果 TgMDH蛋白由316个氨基酸组成,分子式为C1498H2454N402O440S20,分子质量单位为33 777.5,等电点为6.01,波长280nm时的吸光度(A)值为0.364,半衰期为30h,有9个表面可及性参数≥1.9的区域、4个亲水性参数得分≥1.9的区域、7个柔韧性参数得分≥2的区域、14个翻译后修饰位点和14个潜在抗原表位,为可溶性表达蛋白。结论 TgMDH基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。

关键词：刚地弓形虫苹果酸脱氢酶生物信息学抗原表位免疫原性