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OCRL在2型Dent病中的相关作用研究

OCRL在2型Dent病中的相关作用研究

作者：黄丽敏浙江大学

学位级别：硕士

Dent病是一种罕见的遗传性近端小管病,目前对这一疾病的认识尚不足。Dent病的表型异质性导致了它有几种不同的分类,但现在广泛接受的是低分子量蛋白尿、高钙尿症和肾钙质沉着/肾结石是所有Dent病类型的共同病理特征。肾近端肾小管的上... 详细信息

Dent病是一种罕见的遗传性近端小管病,目前对这一疾病的认识尚不足。Dent病的表型异质性导致了它有几种不同的分类,但现在广泛接受的是低分子量蛋白尿、高钙尿症和肾钙质沉着/肾结石是所有Dent病类型的共同病理特征。肾近端肾小管的上皮细胞拥有特别发达和有效的内溶酶体途径,可以重吸收大量过滤的溶质。先天性或后天性疾病引起的内体和/或溶酶体途径功能障碍通常导致近端肾小管细胞的功能障碍,从而引起大量的溶质丢失和严重的代谢并发症,最终导致Dent病的发生和慢性肾脏疾病的发展（CKD）。最初,在Dent疾病的临床体征中低估了肾小球的病理表现,或仅将其视为肾小管损害的结果。然而近来发现肾小球区室CLCN5和OCRL的表达异常与肾小球的损伤密切相关。足细胞损伤是造成肾小球病变的主要原因,各种原因引起足细胞损伤,导致足突出现融合甚至消失,最后导致足细胞的凋亡及坏死以及蛋白尿的发生。因此在肾小管疾病中除了肾小管本身,足细胞在蛋白尿发生的过程中可能也扮演着重要的作用。OCRL是肌醇多磷酸5-磷酸酶,OCRL的突变或缺失可以引起LOWE综合征和Dent病2型。目前新的OCRL的突变类型在肾小管细胞和足细胞中的具体作用并不明确,因此系统研究新发突变在肾小管和足细胞中的作用机制,为Dent病2型提供新的治疗靶点具有重要的意义。目的:***在人的2型Dent病中肾脏的表达模式以及在细胞系的表达模式。***的敲低及突变过表达对肾小管细胞的功能的影响。***敲低后对足细胞功能的影响以及在足细胞损伤中的相关机制研究。材料及方法:首先我们通过免疫组化及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测OCRL在人Dent病2型病人肾脏组织中的表达,然后在体外人肾小管细胞系（human kidney2,HK-2）中通过OCRL的敲低以及过表达突变的OCRL序列,研究其对肾小管细胞的骨架,内吞,活性氧水平,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻,晶体在细胞表面粘附等功能的影响;同时在体外小鼠足细胞系（mouse podocyte cell line,MPC5）通过OCRL敲低研究对足细胞骨架,迁移,粘附,内吞等功能的影响,最后通过转录组测序进一步探讨OCRL在足细胞损伤中的相关分子机制。结果:1.免疫组化及免疫荧光结果显示在Dent病2型中,OCRL同时表达在在肾小管细胞以及肾小球足细胞中。2.在体外HK-2细胞系中OCRL的敲低和过表达突变均可导致小管细胞的吞噬功能减弱,PS外翻增多,晶体粘附增强,同时流式凋亡结果显示OCRL敲低以及突变过表达可以增加HK-2细胞的凋亡。3.体外小鼠足细胞系OCRL敲低后,足细胞相关功能检测显示足细胞的迁移能力增强,吞噬功能减弱,细胞的粘附功能未出现变化。细胞骨架免疫荧光染色结果显示OCRL敲低后对足细胞骨架F-肌动蛋白（F-actin）未造成损伤。4.小鼠足细胞敲低组和对照组的转录组测序对比结果显示OCRL敲低导致了细胞周期通路上多个蛋白的表达降低,包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A,Cdkn2a）,细胞周期蛋白D1（cyclin D1,Ccnd1）,转录因子1（E2F transcription factor 1,E2f1）。结论:***在肾小管中和肾小球足细胞中都有丰富的表达,说明OCRL在小管细胞和足细胞中均中具有重要作用。2.在HK-2系细胞敲低OCRL以及过表达突变的OCRL基因会导致细胞损伤,如肾小管细胞ROS产生增多,细胞活力下降,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻增多,同时导致其对晶体的的粘附能力增强,肾脏草酸钙一水合物粘附沉积,以及内吞功能下降,最终引起对滤过蛋白质的处理能力降低。3.在足细胞内敲除OCRL后,引起足细胞的黏附能力,内吞作用下降进而导致足细胞的损伤。这表明OCRL是足细胞维持正常的细胞形态及发挥正常的细胞功能必不可缺少的组成成分。***敲低导致了足细胞细胞周期通路上多个蛋白包括Cdkn2d、Ccnd1、E2f1的表达的降低,且E2f1与OCRL有较为直接的蛋白质相互作用。

关键词： Dent病肾小管细胞足细胞 westem-blot法免疫荧光细胞迁移黏附能力转铁蛋白内吞作用

餐后富含甘油三酯脂蛋白中的载脂蛋白E在成脂分化中的作用

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餐后富含甘油三酯脂蛋白中的载脂蛋白E在成脂分化中的作用

作者：李嫣红中南大学

学位级别：硕士

背景近年来,肥胖的发病率逐渐升高。作为糖尿病、冠心病、中风、癌症等多种疾病的独立危险因素,肥胖已成为日趋严重的公共卫生问题。肥胖是白色脂肪细胞肥大、增生和白色脂肪组织增多的结果。高甘油三酯血症患者血中增多的富含甘油三酯... 详细信息

背景近年来,肥胖的发病率逐渐升高。作为糖尿病、冠心病、中风、癌症等多种疾病的独立危险因素,肥胖已成为日趋严重的公共卫生问题。肥胖是白色脂肪细胞肥大、增生和白色脂肪组织增多的结果。高甘油三酯血症患者血中增多的富含甘油三酯脂蛋白(TRLs)与肥胖密切相关。TRLs不仅参与脂肪细胞肥大,而且促进脂肪细胞增生。极低密度脂蛋白(VLDL)及残粒脂蛋白可诱导各种前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,且VLDL诱导的成脂分化依赖于脂蛋白表面的载脂蛋白E(ApoE),但潜在的机制尚不清楚。ApoE可与多种脂蛋白受体结合,作为配体参与细胞受体介导的脂蛋白内吞过程。在肝细胞中,低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)均可识别脂蛋白中的ApoE,介导细胞对TRLs的摄取及降解。成脂分化中脂肪细胞表面也表达这些受体。故推测：TRLs中的ApoE在成脂分化中的重要作用可能涉及到ApoE依赖性的脂蛋白内吞作用。目的(1)观察TRLs中的ApoE对3T3-L1前体脂肪细胞成脂分化的影响;(2)探讨成脂分化中的脂肪细胞是否依赖于ApoE内吞TRLs;(3)明确分化中的脂肪细胞内吞TRLs颗粒的受体途径。方法收集人与小鼠高脂餐后4小时的血浆,利用密度梯度分离法获得富含甘油三酯的脂蛋白(TRLs),将获得的TRLs干预3T3-L1前体脂肪细胞,分别进行以下实验：(1)在有或无胰岛素(lOug/mL)的辅助下,分别以不同质量浓度的人TRLs (h-TRL s)(25.50、100、150mg/L)孵育细胞14天,以及用100mg/Lh-TRLs与10ug/mL胰岛素孵育细胞0、4、7、10、14天,通过油红O染色检测脂滴,实时荧光定量PCR及Western Blot检测脂肪细胞标志物—脂肪酸结合蛋白(aP2)、核调控因子—过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPAR-γ)及CCAAT增强结合蛋白(CEBPs)的表达,旨在观察人TRLs的促成脂分化作用;(2)在胰岛素(10ug/mL)的辅助下,分别用100mg/L的野生型小鼠的餐后TRLs或ApoE基因敲除小鼠的餐后TRLs孵育细胞14天,通过油红O染色检测脂滴,观察餐后TRLs表面的ApoE在成脂分化中的作用;(3)用能发出红色荧光的Atto565NHS标记各种TRLs,通过激光共聚焦显微镜观察餐后(?)TRLs被分化中的脂肪细胞内吞的情况,以明确TRLs中的ApoE在细胞内吞TRLs中的作用;(4)通过实时荧光定量PCR及Western Blot检测成脂分化过程中ApoE相关脂蛋白内吞受体的表达;(5)利用受体相关蛋白(RAP)或肝素分别干扰TRLs与LDLR家族成员或HSPG的结合,通过激光共聚焦显微镜观察细胞内吞TRLs的情况,以探讨分化中的脂肪细胞内吞餐后TRLs的受体途径。结果1、人的餐后TRLs在胰岛素(lOug/mL)的辅助作用下可成功诱导3T3-L1前体脂肪细胞分化为脂肪细胞：在胰岛素的辅助下,细胞内的脂滴含量与TRLs质量浓度呈正相关(r=0.971,P内有明显的脂滴,ApoE基因敲除小鼠TRLs处理组细胞内脂滴形成明显减少。3、激光共聚焦显微镜证实：人和野生型小鼠TRLs处理组细胞内均可见明显的红色荧光标记的TRLs颗粒,ApoE基因敲除小鼠TRLs处理组细胞内红色荧光标记的TRLs颗粒显著减少。4、在人TRLs诱导的成脂分化中：(1)不同浓度TRLs处理组低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)基因水平低于胰岛素对照组,但LRP1蛋白水平随TRLs质量浓度增大有增多的趋势。(2)与未分化的3T3-L1细胞相比,在100mg/L TRLs处理组的各个阶段,LRP1蛋白水平无明显变化,但持续存在较高的表达水平。5、与对照组相比,肝素处理组细胞内红色荧光标记的TRLs颗粒无明显变化,RAP处理组细胞内红色荧光标记的TRLs颗粒明显减少。结论1、餐后TRLs呈浓度及时间依赖性诱导成脂分化,并伴随aP2、PPAR-γ表达的上调。2、餐后TRLs促成脂分化能力及其被分化中脂肪细胞内吞的过程均依赖

关键词：富含甘油三酯脂蛋白载脂蛋白E 成脂分化内吞作用

一个新的人Rb26基因cDNA的克隆、表达及其增强细胞吞噬功能研究(英文)

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生物化学与生物物理进展 2008年第6期35卷 719-723页

作者：王健朱嗣博李鼎朱乃硕复旦大学生命科学学院微生物系病毒与分子免疫学实验室上海200433

RabGTPase家族成员基因及其调节囊泡膜运输途径功能已有许多报道,但Rab26蛋白分子的结构和功能仍不清晰.通过生物信息学分析,并在人脑cDNA文库中克隆了一个新的Rab26基因全长cDNA序列,长1656bp,与已发表的基因序列相比,在48～50位插入了... 详细信息

RabGTPase家族成员基因及其调节囊泡膜运输途径功能已有许多报道,但Rab26蛋白分子的结构和功能仍不清晰.通过生物信息学分析,并在人脑cDNA文库中克隆了一个新的Rab26基因全长cDNA序列,长1656bp,与已发表的基因序列相比,在48～50位插入了GCC,在956位T被C取代,而在1197位G被A取代.该序列包含一个771bp完整的开放阅读框(ORF),编码256个氨基酸残基的Rab26蛋白,分子质量为27.9ku(GenBank登录号***646153),而非如以往报告的190个氨基酸残基.GFP荧光标记全长Rb26在哺乳动物细胞中表达显示,Rab26主要呈现在细胞膜状结构相联系的分布,发现该基因高表达能显著增强PE标记的红色异源蛋白质的吞噬.还应用逆转录-聚合酶链反应对多种人肿瘤细胞Rb26表达进行了研究,结果显示,Rab26在Acc2、SPC-A1,K562以及HeLa等肿瘤细胞株呈高表达,而在SMMOL/LC-7721、HepG2、Caco2等肝和肠上皮细胞株中则不表达,值得进一步深入研究.

关键词： Rab26 RabGTP酶内吞作用

壳聚糖扩展青霉胞内作用靶点及其跨膜转运过程中相关基因功能分析

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壳聚糖扩展青霉胞内作用靶点及其跨膜转运过程中相关基因功能分析

作者：孙业梅江苏大学

学位级别：硕士

由扩展青霉(Penicillium expansum)侵染引起的青霉病害是导致苹果采后贮藏过程中腐烂的主要原因。目前最常用的防控方法是化学药物法,虽然具有较好的防治效果,但因化学药物的安全性和环境污染问题而备受人们关注。壳聚糖是一种天然多糖... 详细信息

由扩展青霉(Penicillium expansum)侵染引起的青霉病害是导致苹果采后贮藏过程中腐烂的主要原因。目前最常用的防控方法是化学药物法,虽然具有较好的防治效果,但因化学药物的安全性和环境污染问题而备受人们关注。壳聚糖是一种天然多糖,来源丰富、安全无毒、具有良好的生物相容性,与此同时对病原微生物具有较好的抑制效应。实验室前期通过激光共聚焦观察、基因敲除结合生物学分析证实了壳聚糖可以通过内吞作用被吸收转运到***胞内,并参与抑菌过程。在我们前期研究的基础上,本文对壳聚糖在扩展青霉中的胞内作用靶点以及壳聚糖内吞转运途径相关基因缺失突变株进行进一步地探究和分析,获得的主要结果如下:(1)荧光标记结合激光共聚焦观察发现,胞内FITC标记壳聚糖的绿色荧光信号弥散分布在整个胞内且与DAPI标记的细胞核蓝色荧光信号重叠,表明进入胞内的壳聚糖也可能进入到细胞核内;进一步的细胞周期分析发现,壳聚糖处理后G1和亚G1期细胞增加,表明壳聚糖处理阻断了细胞周期的进程。通过对胞内活性氧水平、线粒体膜电位和细胞凋亡分析发现壳聚糖处理引起***胞内活性氧的异常累积、线粒体膜电位改变、磷酯酰丝氨酸(PS)外化,从而诱导***细胞凋亡。(2)通过对壳聚糖内吞途径中的3个关键基因缺失突变体ΔPe CAM、ΔPe PLD和ΔPe EPS的功能分析发现:与野生型相比,突变株的孢子和菌丝形态以及极性生长发生明显变化,对抑霉唑和苯醚甲环唑的抗性明显增加;此外,基因缺失明显降低***在苹果上的致病性。(3)对野生型、ΔPe PLD突变体在壳聚糖处理前后进行高通量测序(RNA-Seq)分析,结果显示:野生型在壳聚糖处理后1652个基因差异表达,其中上调表达504个,下调表达1148个;ΔPe PLD在壳聚糖处理后1380个基因差异表达,上调表达422个,下调表达958个。进一步GO和KEGG分析发现,壳聚糖处理后ΔPe PLD中与DNA复制(DNA replication)和细胞周期(cell cycle)相关基因的富集下调表达明显低于野生型,这与细胞周期分析结果相吻合。

关键词：壳聚糖扩展青霉胞内靶点内吞作用

VP3 G–H环中氨基酸突变对O型口蹄疫病毒生物学特性的影响

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微生物学报 2019年第7期59卷 1285-1294页

作者：陈冬冬白兴文宫晓华包慧芳李平花李冬付元芳白启峰袁红孙普马雪青曹轶梅陈应理卢曾军刘在新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室OIE/国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 兰州大学基础医学院甘肃省新药临床前研究重点实验室甘肃兰州730000

【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和L... 详细信息

【目的】为了研究O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中氨基酸突变对其生物学特性的影响。【方法】借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救出2株定点突变体rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。进行蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID50和LD50的测定、间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测。【结果】结果显示,与骨架病毒rHN相比,虽然rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对BHK-21细胞的感染性及其蚀斑表型和复制动力学无显著性差异;但rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C对乳鼠的致病力明显减弱,且均获得了小窝蛋白介导侵染CHO-K1细胞的能力。【结论】VP3上第3174位特征性氨基酸突变影响O型口蹄疫病毒感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径,这有助于我们认知VP3 G-H环在口蹄疫病毒粒子立体空间构象中潜在的作用。

关键词：口蹄疫病毒 VP3 G-H环定点突变体生物学特性内吞作用

发动蛋白抑制剂dynasore的功能及在疾病治疗中的研究进展

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中国病理生理杂志 2023年第12期39卷 2273-2279页

作者：田振振陈喆朱平宋银宏肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室(三峡大学) 湖北宜昌443002 三峡大学感染与炎症损伤研究所湖北宜昌443002 三峡大学基础医学院湖北宜昌443002 三峡大学第一临床医学院肾病内科湖北宜昌443003

发动蛋白(dynamin)超家族存在于所有细胞生命活动中,在胞膜构成、肌动蛋白束和先天免疫等方面发挥重要作用。发动蛋白作为该家族的主要成员,是一种多结构域的机械化学鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)蛋白,对鸟嘌呤核苷... 详细信息

发动蛋白(dynamin)超家族存在于所有细胞生命活动中,在胞膜构成、肌动蛋白束和先天免疫等方面发挥重要作用。发动蛋白作为该家族的主要成员,是一种多结构域的机械化学鸟苷三磷酸酶(guanosine triphosphatase,GTPase)蛋白,对鸟嘌呤核苷酸具有低亲和力、高基础水解率,能自组装成高阶螺旋结构^([1]),在包膜重塑、膜裂变和跨高尔基体出芽等作用中发挥着重要作用^([2])。

关键词： dynasore 发动蛋白内吞作用铁死亡线粒体自噬

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生长素及其运输蛋白对植物铝胁迫的响应

植物生理学报 2014年第8期50卷 1135-1143页

作者：吴道铭曹华苹沈宏华南农业大学资源环境学院广州510642

铝对植物的毒害作用主要表现为抑制根尖生长,而根尖生长与生长素及其运输密切相关,铝可能影响了生长素及其代谢过程,但目前尚不清楚生长素及其运输蛋白如何参与植物应对铝胁迫响应。本文通过分析、总结前人研究,并结合自己的前期研究结... 详细信息

铝对植物的毒害作用主要表现为抑制根尖生长,而根尖生长与生长素及其运输密切相关,铝可能影响了生长素及其代谢过程,但目前尚不清楚生长素及其运输蛋白如何参与植物应对铝胁迫响应。本文通过分析、总结前人研究,并结合自己的前期研究结果,初步阐述生长素或其运输蛋白对植物铝胁迫的响应,即铝影响生长素代谢的相关基因,干扰根尖生长素运输蛋白在细胞内分布及其囊泡运输,调控生长素的极性运输,进而抑制根尖生长。另一方面,生长素或其运输蛋白又参与了植物应对铝胁迫过程,这主要体现在参与了植物铝毒信号传递、根系铝内置化过程和减缓铝诱导的氧化胁迫。最后,本文提出了生长素及其运输蛋白对植物铝胁迫响应的可能模型。

关键词：铝胁迫生长素 PINs蛋白信号传递内吞作用

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α-突触核蛋白致病机制研究进展

中华神经科杂志 2020年第3期53卷 227-231页

作者：张美美冯涛首都医科大学附属北京天坛医院神经病学中心运动障碍性疾病科 100071

细胞内错误折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在中枢神经系统及外周神经系统的沉积导致了帕金森病、路易体痴呆及多系统萎缩等突触核蛋白病的发生,而其病理传播机制尚不完全清楚。最近的研究表明具有神经毒性的寡聚体α-syn的... 详细信息

细胞内错误折叠的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)在中枢神经系统及外周神经系统的沉积导致了帕金森病、路易体痴呆及多系统萎缩等突触核蛋白病的发生,而其病理传播机制尚不完全清楚。最近的研究表明具有神经毒性的寡聚体α-syn的细胞间传播是大脑区域之间疾病传播的主要模式。本综述回顾了不同模式的寡聚体α-syn细胞分泌和再摄取的现有证据,包括细胞间直接转移、朊蛋白样传播、外泌体分泌和内吞作用、纳米隧道及小胶质细胞介导作用,以便更详细地了解突触核蛋白病理学在整个大脑中传播的模式,为防止疾病进展的治疗提供新靶点。

关键词： α-突触核蛋白突触核蛋白病外泌体朊蛋白样内吞作用纳米隧道小胶质细胞

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突触内吞关键蛋白Dynamin的研究进展

中南大学学报（医学版） 2014年第10期39卷 1088-1092页

作者：蔡婷袁伟第三军医大学附属西南医院耳鼻咽喉-头颈外科重庆400038

囊泡循环为突触的基本生理功能,涉及到多个环节的参与,囊泡回收是整个突触囊泡循环的基础。研究表明,网格蛋白介导的内吞作用是囊泡回收的主要途径,Dynamin(发动蛋白)在此过程中发挥重要作用。Dynamin是一个分子质量约为100 kD的GTP酶,... 详细信息

囊泡循环为突触的基本生理功能,涉及到多个环节的参与,囊泡回收是整个突触囊泡循环的基础。研究表明,网格蛋白介导的内吞作用是囊泡回收的主要途径,Dynamin(发动蛋白)在此过程中发挥重要作用。Dynamin是一个分子质量约为100 kD的GTP酶,它在网格蛋白介导的内吞过程中发挥"剪刀"的作用,将网格蛋白包被小窝与质膜分离。研究发现癲痫、阿尔茨海默病、中央核肌病等多种神经性疾病与Dynamin相关。本文从Dynamin的结构入手,简要论述其功能、表达调控及相关疾病的研究进展。

关键词：突触 Dynamin 内吞作用